KR20230020949A - 작용제 상호작용 효과 결정 - Google Patents

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KR20230020949A
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니콜라오스 카발로풀루스
로데리히 롬힐트
포-쳉 탕
요한 크뤼게르
댄 안데르손
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니콜라오스 카발로풀루스
로데리히 롬힐트
포-쳉 탕
요한 크뤼게르
댄 안데르손
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Abstract

배양 용기(10)의 소정의 위치에 있는 작용제 저장소(31, 33, 35)에 함유된 작용제가 기질(50)을 통해 확산하여 조합 영역(41, 43, 45) 내의 기질(50)에는 적어도 부분적으로 중첩되는 농도 구배 및 작용제 저장소(31, 33, 35)의 외부 경계 주변에 있는 기질(50)에는 실질적으로 중첩되지 않는 농도 구배를 형성하는 동안, 세포 집단(55)은 세포 배양 기질(50) 상에 배양된다. 작용제 저장소(31, 33, 35)의 외부 경계 주변에서 세포 집단(55)의 임의의 성장이 실질적으로 결여되는 각각의 저해 구역(60, 62, 64)의 저해 종말점(61, 63, 65) 및 조합 영역(41, 43, 45) 내에서 세포 집단(55)의 성장을 포함하는 각각의 성장 구역(70, 72, 74)의 성장 종말점(71, 73, 75)이 결정되어, 세포 집단(55)에 대한 작용제 사이의 상호작용 효과를 결정하는데 사용된다.

Description

작용제 상호작용 효과 결정
본 발명은 일반적으로 세포 집단에 대한 작용제 혼합물의 작용제 상호작용 효과(agent interaction effect)를 결정하는 것에 관한 것이다.
2종 이상의 생리활성 화합물이 동시에 발생하는 곳마다 화합물 상호작용 효과가 있을 수 있다. 화합물 혼합물의 조합 효과가 화합물 단독의 독립적인 작용(상가작용(additivity))에서 예상되는 것보다 더 높거나(양성 상승작용) 더 낮을 때(음성 상승작용, 길항작용), 화합물은 상호작용한다. 따라서, 양성 상승작용을 가진 여러 화합물은 특정 생물학적 활성을 최대화하기 위해 물리적으로 조합될 수 있다. 반대로, 음성인 상승작용 효과를 가진 다른 화합물은 혼합물에서 발생하는 활성의 저해를 피하기 위해 물리적으로 별도로 작용하는 것이 바람직할 수 있다.
조합 효과 및 상승작용 최적화는 생물의학 분야에서 특히 중요하다. 2종 이상의 약물의 조합 치료는 암 및 감염성 질환, 예를 들어, 세균성, 바이러스성 또는 진균성 감염 질환의 치료에 점점 더 많이 사용된다. 조합 치료는 치료 효율을 증가시키고 내성 발생을 감소시키기 때문에 단일 약물 치료에 비해 유리하다. 조합 치료의 효능은 바람직한 양성 상승작용뿐만 아니라 길항작용 효과도 생성할 수 있는 약물의 생리학적 상호작용과 관련이 있다.
항생제 내성이 확산됨에 따라 상승작용적 항생제 조합은 1차 치료 옵션으로서 점점 더 많이 사용되고 있다. 항생제 조합 요법은 내성 및 이종 내성 세균에 의한 감염을 포함한 복잡한 세균 감염의 효율적인 치료를 가능하게 하여, 사망률을 감소시키고 환자 회복을 가속화하는 것으로 나타났다. 그러나, 최근 데이터에 따르면 약물 상호작용은 종 및 임상 분리주 간에 달라질 수 있으므로[1], 치료 성공을 위해 신중한 진단을 필요로 한다.
상승작용 정량은 여러 화합물의 개별 및 조합 효과의 측정을 필요로 한다. 어려움은 상승작용이 전형적으로 생물학적 샘플에 따라 몇 자릿수만큼 이동할 수 있는 S자형 용량-반응 곡선의 가파른 영역인 좁은 농도 창에서 가장 잘 정량화될 수 있다는 것이다. 항생제 상승작용의 정량적 척도는 소위 분할 저해 농도 지수(fractional inhibitory concentration index: FICi)이다. 두 항생제 A 및 B에 대한 FICi는 cA/MICA + cB/MICB로 정의되며, 여기서 MICA/B는 순수한 A 또는 B의 최소 저해 농도이고, cA/B는 A+B의 MIC 생성 혼합물에서 항생제 A 또는 B의 농도를 나타낸다. 최소 저해 농도(MIC)는 샘플의 성장을 방해하는 화합물의 최소 농도이다.
상승작용 정량을 위한 표준 방법론은 두 화합물의 여러 개별 농도가 일반적으로 9x9 또는 8x12 농도의 완전 요인 격자 - 체커보드에서 조합되는 2차원의 액체배지 미량희석법이다. 농도 격자가 생성되는 즉시, 세포 샘플이 첨가되고 설정된 인큐베이션 시간 동안 또는 이후에 생물학적 반응이 측정된다. 3개 이상의 약물 간의 상승작용 정량을 위한 간소화된 체커보드 검정은 개발되어 있다[2].
반고체 한천 표면 상에서 페트리 접시 배양물에 대해 대안적인 상승작용 정량 해법이 개발되었다. 항생제 감수성 테스트(AST)는 항생제 또는 다른 화합물로 함침된 종이 디스크를 사용하여 일상적으로 수행된다. 이 디스크는 세포 샘플이 파종된 한천 표면 상에 배치된다. 디스크로부터 주변 한천으로 화합물의 확산은 농도 구배를 생성하고 세포 샘플은 최대 MIC까지만 성장할 수 있어 특징적인 저해 구역을 남긴다. 별개의 약물을 갖는 여러 디스크가 근접하게 배치되면, 상승작용은 저해 구역의 모양을 비틀어지게 할 수 있다. 따라서, AST 디스크의 배열은 정성적 상승작용 검출에 사용되었다[3]. 유사 방법은 정해진 방식으로 한천 내로 확산되는 화합물 농도 구배에 의해 코팅된 종이 또는 플라스틱 스트립을 사용한다[4, 5]. 저해 구역의 확대는 양성 상승작용을 나타낸다; 협소화는 길항작용 효과를 나타낸다. 일반적으로, 이러한 방법은 FICi 값과 같이 상승작용의 임의의 정량적 정보가 아닌 정성적 정보만을 제공한다.
상승작용은 스트립 교차 대형을 사용하여 정량할 수 있으며, 여기서, 2개의 스트립은 90° 각도로 배치되고 테스트 스트립은 MIC 지점에서 서로 교차한다[6]. 항생제 테스트 스트립 교차 대형의 단점은 여러 단계를 필요로 한다는 것이다. 테스트 스트립은 MIC 지점에서 서로 교차해야 하므로, 세포 샘플의 MIC가 사전 검정으로부터 공지되어야 할 필요가 있다. 3번째 해법은 폐쇄된 한천 확산 구획[7]을 사용하는 것으로서, 여기서 파종된 한천 표면은 확산으로 균질한 농도가 확립되는 더 작은 영역으로 분획된다. 확산 구획은 한천 플레이트에서 별개의 농도 및 화합물 혼합물에 대한 체커보드식 테스트를 가능하게 한다.
따라서, 임상 진단에 사용할 수 있고 광범위한 생리활성 화합물에 적용 가능한, 빠르고 간단한 상승작용 정량 및 최적화 방법은 여전히 필요한 상태이다.
본 발명의 일반적인 목적은 세포 집단에 대한 작용제 혼합물의 작용제 상호작용 효과를 결정하는 것이다.
이러한 목적 및 기타 목적은 본 명세서에 개시된 실시형태에 의해 충족된다.
본 발명은 독립항에 정의되어 있다. 본 발명의 추가 실시형태는 종속항에 정의되어 있다.
본 발명의 일 측면은 세포 집단에 대한 작용제 상호작용 효과를 결정하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 서로에 대해 소정의 위치에서 N개 작용제 저장소를 포함하는 배양 용기에 세포 배양 기질을 첨가하는 것을 포함한다. N개 작용제 저장소의 각 작용제 저장소는 작용제를 포함하고, N개 작용제 저장소는 조합 영역을 에워싸고 N은 3 이상의 정수이다. 이 방법은 또한 세포 배양 기질 상에 그리고/또는 내에 세포 집단을 배치하는 단계 및 N개 작용제 저장소의 작용제가 세포 배양 기질을 통해 확산되고 조합 영역 내의 세포 배양 기질에 적어도 부분적으로 중첩되는 작용제 농도 구배를 형성하고, N개 작용제 저장소 상의 외부 경계 주변의 세포 배양 기질에 실질적으로 중첩되지 않는 작용제 농도 구배를 형성하는 동안, 소정의 시간 기간 동안 세포 배양 기질 상에 그리고/또는 내에 세포 집단을 배양하는 단계를 포함한다. 이 방법은 N개 작용제 저장소 중 적어도 2개의 인접한 작용제 저장소의 각각의 작용제 저장소에 대해, 세포 집단의 임의의 성장이 실질적으로 결여된 저해 구역의 저해 종말점을 결정하는 단계를 더 포함한다. 저해 종말점은 작용제 저장소의 외부 경계 주변에 위치한다. 이 방법은 부가적으로, 적어도 2개의 인접한 작용제 저장소에 대해, 이 적어도 2개의 인접한 작용제 저장소에 함유되거나 포함된 작용제의 적어도 부분적으로 중첩되는 작용제 농도 구배를 갖는 조합 영역 내에서 세포 집단의 성장을 포함하는 성장 구역의 성장 종말점을 결정하는 단계를 포함한다. 이 방법은 또한 저해 종말점 및 성장 종말점에 기초하여 적어도 2개의 인접한 작용제 저장소에 함유된 작용제 간에 작용제 상호작용 효과를 결정하는 것을 포함한다.
본 발명의 또 다른 양상은 원형 바닥 플레이트의 원주에 부착된 원형 벽과 중심 N각형 개구부를 갖는 원형 바닥 플레이트를 포함하는 배양 용기 인서트(insert)에 관한 것이다. 배양 용기 인서트는 또한 원형 벽 및 원형 바닥 플레이트에 부착되고 중심 N각형 개구부를 에워싸는 N개의 현(chord) 벽을 포함한다. 원형 바닥 플레이트, 원형 벽 및 각 현 벽(chord wall)은 작용제 저장소를 획정하고 N은 3 이상의 정수이다.
본 발명의 관련 양상은 바닥 디스크, 바닥 디스크에 부착된 원주벽, 및 원형 바닥 플레이트가 바닥 디스크 상에 위치하고 원형 벽이 원주 벽으로부터 거리를 두고 있는 배양 용기 내에 위치한 상기에 따른 배양 용기 인서트를 포함하는 배양 용기를 정의한다.
본 발명의 또 다른 양상은 바닥 디스크, 바닥 디스크에 부착된 원주벽, 및 바닥 디스크에 부착되고 원주벽에 의해 에워싸이고 원주벽으로부터 거리가 있는 원형 벽을 포함하는 배양 용기에 관한 것이다. 배양 용기는 또한 원형 벽 및 바닥 디스크에 부착되고 바닥 디스크의 N-각형 부분을 에워싸는 N개의 현 벽을 포함한다. 바닥 디스크, 원형 벽 및 각 현 벽은 작용제 저장소를 획정하고 N은 3 이상의 정수이다.
본 발명의 또 다른 양상은 세포 집단에 대한 작용제 상호작용 효과를 결정하기 위한 키트에 관한 것이다. 키트는 상기에 따른 배양 용기 및 배양 용기에 첨가되고 세포 배양 기질로 고형화되도록 구성된 일정 부피의 세포 배양 기질 겔을 포함한다. N개 작용제 저장소의 각 작용제 저장소는 각각의 작용제를 포함하고 N개 작용제 저장소는 조합 영역을 에워싼다. 키트는 또한 세포 배양 기질 상에 그리고/또는 내에 세포 집단을 배치하고 소정의 시간 기간 후에 세포 배양 기질의 적어도 하나의 사진을 촬영하도록 하는 명령어를 포함한다. N개 작용제 저장소 중의 작용제는 세포 배양 기질을 통해 확산되고 적어도 부분적으로 중첩되는 작용제 농도 구배를 조합 영역 내의 세포 배양 기질에 형성하고, 실질적으로 중첩되지 않는 작용제 농도 구배를 N개 작용제 저장소 상의 외부 경계 주변의 세포 배양 기질에 형성한다. 키트는 적어도 하나의 사진으로부터 그리고 N개 작용제 저장소 중의 각 작용제 저장소에 대해, 세포 집단의 임의의 성장이 실질적으로 결여된 저해 구역의 저해 종말점을 결정하는 명령어를 더 포함한다. 저해 종말점은 작용제 저장소 주변에 위치한다. 키트는 또한 적어도 하나의 사진으로부터, 그리고 N개 작용제 저장소 중 2개의 인접한 작용제 저장소의 각 조합에 대해, 적어도 2개의 인접한 작용제 저장소 내에 함유된 작용제의 적어도 부분적으로 중첩한 작용제 농도 구배를 갖는 조합 영역 내에서 세포 집단의 성장을 포함하는 성장 구역의 성장 종말점을 결정하는 명령어를 포함한다. 키트는 세포 배양 기질과 관련하여 N개 작용제 저장소 내에 함유된 작용제에 대한 확산 계수를 정의하는 정보를 더 포함한다. 키트는 또한 2개의 인접한 작용제 저장소의 각 조합에 대해, 2개의 인접한 작용제 저장소에 대해 결정된 저해 종말점, 2개의 인접한 작용제 저장소에 대해 결정된 성장 종말점 및 확산 계수를 정의하는 정보를 기반으로 한, 2개의 인접한 작용제 저장소에 함유한 작용제 간의 작용제 상호작용 효과를 결정하는 명령어를 포함한다.
본 발명의 추가 양상은, 적어도 하나의 프로세서에 의해 실행될 때, 적어도 하나의 프로세서로 하여금, 세포 배양 기질 상에 그리고/또는 내에 세포 집단을 배치한 후 소정의 시간 기간에서 배양 용기 중의 세포 배양 기질을 촬영한 적어도 하나의 사진을 나타내는 이미지 데이터를 제공하도록 하는 명령어를 포함하는 컴퓨터 프로그램에 관한 것이다. 배양 용기는 N개 작용제 저장소를 서로에 대해 소정의 위치에 포함한다. N개 작용제 저장소 중 각 작용제 저장소는 작용제를 포함한다. N개 작용제 저장소는 조합 영역을 에워싸고, N은 3 이상의 정수이다. N개 작용제 저장소 중의 작용제는 세포 배양 기질을 통해 확산되고, 적어도 부분적으로 중첩되는 작용제 농도 구배를 조합 영역 내의 세포 배양 기질에 형성하고, 실질적으로 중첩되지 않는 작용제 농도 구배를 N개 작용제 저장소 상의 외부 경계 주변의 세포 배양 기질에 형성한다. 적어도 하나의 프로세서는 또한 이미지 데이터를 기반으로 하여, 그리고 N개 작용제 저장소 중 적어도 2개의 인접한 작용제 저장소의 각 작용제 저장소에 대해, 세포 집단의 임의의 성장이 실질적으로 결여된 저해 구역의 저해 종말점을 결정하도록 야기된다. 저해 종말점은 작용제 저장소의 외부 경계 주변에 위치한다. 적어도 하나의 프로세서는 이미지 데이터에 기초하여 그리고 적어도 2개의 인접한 작용제 저장소에 대해, 적어도 2개의 인접한 작용제 저장소에 함유된 작용제의 적어도 부분적으로 중첩되는 작용제 농도 구배를 갖는 조합 영역 내에서 세포 집단의 성장을 포함하는 성장 구역의 성장 종말점을 결정하도록 추가로 야기된다. 적어도 하나의 프로세서는 저해 종말점 및 성장 종말점에 기초하여 적어도 2개의 인접한 작용제 저장소에 함유된 작용제 사이의 작용제 상호작용 효과를 결정하도록 추가로 야기된다.
본 발명의 관련 양상은 상기에 따른 컴퓨터 프로그램을 포함하는 컴퓨터-판독 가능 저장 매체를 규정한다.
본 발명은 단일 실험 및 단일 배양 용기에서 작용제 조합에 대한 상호작용 효과, 예를 들어, 상승작용 효과 또는 길항작용 효과의 정량을 가능하게 한다. 본 발명은 임의의 상기 작용제 상호작용의 정성적 정보를 제공할 뿐만 아니라 작용제 상호작용의 정량을 가능하게 한다.
추가 목적 및 장점과 함께 실시형태는 다음 상세한 설명을 첨부 도면과 함께 참고함으로써 가장 잘 이해될 수 있다:
도 1은 일 실시형태에 따른 배양 용기 인서트를 저면도(상부), 측면도(중간) 및 상면도(하부)로 개략적으로 도시한 것이다.
도 2는 세포 배양 기질의 첨가(중간) 및 세포 배양물의 플레이팅(하부) 후에 배양 용기 인서트를 포함하는 배양 용기(상부)를 개략적으로 도시한 것이다.
도 3은 일 실시형태에 따른 배양 용기를 개략적으로 도시한 것이다.
도 4는 다른 실시형태에 따른 배양 용기 인서트를 개략적으로 도시한 것이다.
도 5는 추가 실시형태에 따른 배양 용기 인서트를 개략적으로 도시한 것이다.
도 6은 또 다른 실시형태에 따른 배양 용기 인서트를 개략적으로 도시한 것이다.
도 7은 일 실시형태에 따른 배양 용기 인서트를 개략적으로 도시한 것이다.
도 8은 다른 실시형태에 따른 배양 용기 인서트를 개략적으로 도시한 것이다.
도 9는 작용제 저장소의 주변에 위치한 세포 배양 기질에서 저해 구역을 보여주는 배양 용기 인서트를 갖는 배양 용기를 촬영한 사진이다.
도 10은 배양 용기 인서트의 중심 부분의 조합 영역에 있는 세포 배양 기질에서 성장 구역을 보여주는 배양 용기 인서트를 갖는 배양 용기를 촬영한 사진이다.
도 11은 본 발명에 따라 결정된 3가지 작용제 A, B 및 C에 대한 분할 저해 농도 지수(FICi)를 보여주는 다이어그램이다.
도 12는 일 실시형태에 따른 세포 집단에 대한 작용제 상호작용 효과를 결정하는 방법을 예시하는 흐름도이다.
도 13은 일 실시형태에 따른 도 12에 도시된 방법의 부가적인 선택적 단계를 예시하는 흐름도이다.
도 14는 일 실시형태에 따른 도 12에 도시된 방법의 부가적인 선택적 단계를 예시하는 흐름도이다.
도 15는 다른 실시형태에 따른 도 12에 도시된 방법의 부가적인 선택적 단계를 예시하는 흐름도이다.
도 16은 일 실시형태에 따른 컴퓨터를 개략적으로 도시한 것이다.
도 17은 에세리키아 콜라이(Escherichia coli) 기준 균주 K12-MG1655의 자기-상호작용 실험을 예시한 것이다. 8가지 항생제 AMP, CIP, CTX, GEN, FOF, NIT, MEC, TMP에 대한 모든 자기-상호작용에 대한 FICi. 막대는 3개의 생물학적 반복물의 평균 FICi 값 및 표준 편차(SD)를 나타낸다. 모든 상호작용은 본질적으로 부가적이었고 일 샘플 윌콕슨(Wilcoxon) 부호 순위 테스트에 의해 FICi=1로 통계적으로 유의미한 차이가 있는 것으로 검출된 것은 없었다.
도 18은 CombiANT™ 검정의 기술적 검증을 예시한 것이다. (18A) 이.콜라이, 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 및 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)의 기준 균주에서 약물 상호작용의 정량. 상승작용는 분할 저해 농도 지수(FICi, 평균±SD, n=10 반복물)로 표현된다. (18B) 검정 정확도 분석. 반복성은 같은 날에 수행된 검정에 대한 상대적 표준 오차로서 표현되며, 대시선은 중앙값 표준 오차를 나타내고 점선은 상위 및 하위 사분위수를 나타내며, n=6 조합이다. 재현성은 날마다의 FICi의 상대적 차이로서 표현되며, 대시선은 중앙값 상대적 차이를 나타내고 점선은 상위 및 하위 사분위수, n=6 조합을 나타낸다). (18C) 생물학적 및 기술적 반복성을 정량하기 위해 다른 날 및 같은 날의 반복물 모두를 포괄하는 풀링된 데이터(n=10 반복물)에 대한 변동 계수. 결과는 항생제 상호작용에 따라 그룹화되고, 그 다음 3가지 균주 간에 추가로 세분화된다. (18D) CombiANT™ 및 체커보드 검정의 Bland-Altman 방법 비교(평균값, n=18 균주-항생제 쌍 조합). 방법의 FICi의 절대적 차이는 이들의 평균 값에 대하여 플로팅된다. 지점의 작은 산란은 두 방법 간의 약간의 편향을 나타낸다. FICi = 1에 대한 일 샘플 윌콕슨 부호 순위 테스트, *** P<0.001, ** P<0.01, * P <0.05.
도 19는 이. 콜라이 기준 균주 K12-MG1655에 대한 CombiANT™ UTI 항생제 상호작용을 예시한 것이다. 막대는 3개의 생물학적 반복물의 평균 FICi 값 및 표준 편차(SD)를 나타낸다. 점선은 FICi = 1을 나타낸다. FICi = 1에 대한 일 샘플 윌콕슨 부호 순위 테스트, **** P<0.0001, *** P<0.001, ** P <0.01, * P <0.05.
도 20a 내지 20m은 이. 콜라이 UTI 임상 분리주의 상호작용 선별을 예시한 것이다. FICi로 표현되는 항생제 상호작용(평균±SD). FICi = 1에 대한 일 샘플 윌콕슨 부호 순위 테스트, *** P<0.001, ** P<0.01, * P <0.05.
도 21은 항생제 외에 다른 생리활성 화합물의 분석에 대한 CombiANT™의 사용법을 예시한 것이다.
도 22는 상이한 형광 단백질을 발현하는 혼합 세균 샘플의 분석에 대한 CombiANT™의 사용법을 예시한 것이다.
본 발명은 일반적으로 세포 집단에 대한 작용제 혼합물의 작용제 상호작용 효과를 결정하는 것에 관한 것이다.
본 발명은 세포 집단에 대한 작용제 조합의 상호작용 효과를 조사하고 결정하는데 사용될 수 있다. 본 발명은 작용제 조합이 세포 집단에 상호작용 효과를 갖는지 검증하고 상호작용 효과의 크기를 정량하는 데에도 사용될 수 있어, 즉, 정성적 및 정량적 정보 둘 모두를 제공한다. 이것은 본 발명이 작용제 조합이 상승작용 효과, 저해작용 또는 길항작용 효과를 발휘하는지 여부 또는 실제로 세포 집단에 대해 단지 독립적이거나 부가적인 효과를 갖는지 여부를 평가하는데 사용될 수 있고, 이러한 상승작용 또는 저해작용/길항작용적 효과를 정량하는 데에도 사용될 수 있음을 의미한다.
본 명세서에 사용된 "작용제"는 세포 집단에 효과를 발휘할 수 있고 세포 집단에 관하여 이러한 작용제와 또 다른 작용제의 상호작용 효과가 결정되어야 하는 는 임의의 분자, 화합물, 조성물 또는 다른 작용제에 관한 것이다. 전형적인, 하지만 비제한적인 이러한 작용제의 예로는 약물 후보를 포함하는 약물 또는 약제를 포함하고, 여기서 세포 집단에 대한 상이한 약물 또는 약제 조합의 상호작용은 관심 대상이다. 예를 들어, 상이한 약물 또는 약제의 조합이 세포 집단에 대해 단순한 부가적 효과를 넘는 효과를 발휘할 수 있는지 여부, 즉, 약물 또는 약제의 조합이 약물 또는 약제 단독의 독립적인 작용으로부터 예상되는 것보다 더 높거나 더 큰 효과, 즉, 상승작용적 효과를 갖는지 여부를 관찰하는 것은 흥미로울 수 있다. 또한, 이러한 조합의 약물 또는 약제 중 하나가 다른 약물 또는 약제 단독이 세포 집단에 발휘하는 작용 또는 효과를 저해하는지 여부를 관찰하는 것, 즉, 임의의 길항작용 효과가 있는지 여부를 결정하는 것은 흥미로울 수 있다.
약물 또는 약제의 조합 또는 칵테일이 치료에 사용되는 질환에는 여러 가지가 있으며, 그 예로는 암 환자의 화학요법에서 세포증식억제제 또는 화학요법제, 세균 감염에서 항생제 또는 항미생물제, 및 또한 이러한 바이러스 또는 진균 감염에서 항바이러스제 또는 항진균제의 조합을 포함한다.
작용제는 반드시 약물이나 약제이어야 할 필요는 없지만, 작용제가 세포 집단에 대해 임의의 상호작용 효과가 있는지를 결정하는 것이 관심 대상일 수 있는 경우, 예를 들어, 독성 물질, 오염 물질, 이온 또는 다른 화학물질일 수도 있다.
도 12는 실시형태에 따른 세포 집단에 대한 작용제 상호작용 효과를 결정하는 방법을 예시하는 흐름도이다. 이 방법은 도 1, 2, 9 및 10을 참조하여 이하에 설명된다. 방법은 서로에 대해 소정의 위치에 N개 작용제 저장소(31, 33, 35)를 포함하는 배양 용기(10)에 세포 배양 기질(50)을 첨가하는 것을 포함하는 단계 S1로 시작한다. N개 작용제 저장소(31, 33, 35)의 각 작용제 저장소(31, 33, 35)는 작용제를 포함하고, N개 작용제 저장소(31, 33, 35)는 도 10에 도시된 바와 같이 조합 영역(41, 43, 45)을 에워싼다. 이 실시형태에 따르면, 매개변수 N은 3 이상의 정수이다.
방법은 또한 단계 S2에서 세포 집단(55)을 세포 배양 기질(50) 상에 그리고/또는 내에 배치하는 단계 및 세포 배양 기질(50) 상의 그리고/또는 내의 세포 집단(55)을, N개 작용제 저장소(31, 33, 35) 중의 작용제가 세포 배양 기질(50)을 통해 확산되고 조합 영역(41, 43, 45) 내에서 세포 배양 기질(50)에 적어도 부분적으로 중첩되는 작용제 농도 구배 및 N개 작용제 저장소(31, 33, 35)의 외부 경계 주변의 세포 배양 기질(50)에 실질적으로 중첩되지 않는 작용제 농도 구배를 형성하는 동안 소정의 시간 기간 동안 배양하는 것을 포함한다.
방법은 단계 S3에서 그리고 N개의 작용제 저장소(31, 33, 35) 중 적어도 2개의 인접한 작용제 저장소(31, 33, 35)의 각각의 작용제 저장소(31, 33, 35)에 대해, 세포 집단(55)의 임의의 성장이 실질적으로 결여된 저해 구역(60, 62, 64)의 저해 종말점(61, 63, 65)을 결정하는 것을 포함한다. 이 저해 종말점(61, 63, 65)은 작용제 저장소(31, 33, 35)의 외부 경계에 대해 주변에 위치한다.
방법은 또한 단계 S4에서 그리고 적어도 2개의 인접한 작용제 저장소(31, 33, 35)에 대해, 적어도 2개의 인접한 작용제 저장소(31, 33, 35)에 함유된 작용제의 적어도 부분적으로 중첩되는 작용제 농도 구배를 갖는 조합 영역(41, 43, 45) 내에서 세포 집단(55)의 성장을 포함하는 성장 구역(70, 72, 74)의 성장 종말점(71, 73, 75)을 결정하는 것을 포함한다.
도 12의 단계 S3 및 S4는 적어도 부분적으로 병렬로, 또는 임의의 순서의 직렬로, 즉, 단계 S4 전에 단계 S3 또는 단계 S3 전에 단계 S4가 수행될 수 있다.
방법은 단계 S5에서 저해 종말점(61, 63, 65)과 성장 종말점(71, 73, 75)에 기초하여 적어도 2개의 인접한 작용제 저장소(31, 33, 35)에 함유된 작용제 사이의 작용제 상호작용 효과를 결정하는 단계를 더 포함한다.
도 12에 도시된 방법에 사용되는 배양 용기(10)는 배양 플레이트, 배양 접시, 예컨대, 페트리 접시를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 세포 배양에 사용되는 임의의 용기 또는 장치일 수 있다.
일 실시형태에서, 도 12의 단계 S1은 세포 배양 기질 겔을 배양 용기(10)에 첨가하고 세포 배양 기질 겔을 세포 배양 기질(50)로 고형화시키는 것을 포함한다. 따라서, 이 실시형태에서, 세포 배양 기질 겔은 배양 용기(10)에 투입되고 세포 배양 기질(50)로 고형화되며, 이 기질 상에 그리고/또는 기질 내에 세포 집단(55)이 배양될 수 있다.
세포 배양 기질 겔 및 세포 배양 기질(50)은 임의의 그러한 기질 겔 및 시험관내에서 세포를 배양하는데 사용되는 기질일 수 있다. 이러한 세포 배양 기질(50)의 비제한적이지만 예시적인 예로는 한천, 아가로스, 알기네이트, 세균 셀룰로스, MATRIGEL®, 하이드로겔, 폴리-L-라이신 및 피브로넥틴을 포함한다.
단계 S1에서 세포 배양 기질 겔을 첨가하는 것에 대한 대안은 다공성 세포 배양 기질(50)과 같은 세포 배양 기질(50)을 배양 용기(10)에 첨가, 주조 또는 투입하고, 선택적으로 (다공성) 세포 배양 기질(50)이 배양 용기(10)에서 고형화되도록 할 수 있다. 실제로, 배양 용기(10)에서 주조, 중합 또는 임의의 다른 방식으로 형성될 수 있는 임의의 세포 배양 기질(10)는 본 발명에 따라 사용될 수 있다.
세포 집단(55)은 단계 S2에서 세포 배양 기질 상에 그리고/또는 기질 내에 배치된다. 바람직한 실시형태에서, 세포 집단(55)은 세포 배양 기질(50)의 표면(51) 상에 배치되고 소정의 시간 기간 동안 세포 배양 기질(50)의 표면(51) 상에 배양된다. 이어서, 세포 집단(55)은 세포 배양 기질(50)의 표면(51) 상에 2차원(2D) 배양물을 형성할 것이다. 다른 실시형태에서, 세포 집단(55)은 세포 배양 기질(50)에 적어도 부분적으로 배치될 수 있다. 이는 세포는 세포 배양 기질(50) 내부 및 선택적으로 적어도 부분적으로 세포 배양 기질(50)의 표면(51) 상에 3차원(3D) 배양물로서 성장할 수 있다는 것을 의미한다. 이 실시형태에서, 세포 집단(55)은 단계 S1 및 S2가 적어도 부분적으로 병렬로 수행되도록 세포 배양 기질 겔과 예비혼합될 수 있다. 대안적으로, 세포 집단(55)은 세포 배양 기질(50) 내로 고형화되기 전에 세포 배양 기질 겔에 첨가될 수 있다.
배양 용기(10)는 각각의 작용제를 포함하는 N개 작용제 저장소(31, 33, 35)를 포함한다. 작용제 저장소(31, 33, 35)는 서로에 대해 소정의 위치에 배열되고 소위 조합 영역(41, 43, 45)을 포함하는 중심 영역 또는 창(40)을 에워싼다. 이러한 작용제 저장소(31, 33, 35)는 작용제를 포함하도록 구성된 임의의 저장소, 챔버 또는 셀일 수 있다. 작용제 저장소(31, 33, 35)는 개방형 저장소이고 폐쇄된 저장소가 아니며, 즉, 어떤 잠금 장치나 천장을 갖지 않는다. 이는 작용제 저장소(31, 33, 35)가 도 2에 도시된 바와 같이 세포 배양 기질(50)에 개방되어 작용제 저장소(31, 33, 35)에 함유된 작용제가 세포 배양 기질(50)을 통해 확산할 수 있어, 세포 배양 기질(50)에서 작용제 저장소(31, 33, 35)로부터 멀어질수록 작용제의 농도가 계속 감소하는 농도 구배를 세포 배양 기질(50)에 형성하도록 한다.
작용제 저장소(31, 33, 35)로부터 작용제의 확산 및 작용제 저장소(31, 33, 35)의 서로에 대한 위치는 작용제 저장소(31, 33, 35)의 외부 경계에 대해 주변인 세포 배양 기질(50)의 부분, 즉, 작용제 저장소(31, 33, 35)의 외부 경계 또는 제한과 세포 배양 기질(50)의 주변 사이에 위치한 세포 배양 기질(50)의 부분이 실질적으로 그 작용제 저장소(31, 33, 35)로부터 확산된 작용제만을 포함한다는 것을 의미한다. 예를 들어, 작용제 저장소(31)의 외부 경계로부터 세포 배양 기질(50)의 주변 쪽으로 도 9에 나타낸 선(80)을 따라 이동하면, 작용제 저장소(31)의 외부 경계에서는 농도가 높고 세포 배양 기질(50)의 주변에서는 작용제의 농도가 낮거나 또는 심지어 0인 작용제 저장소(31)에 함유된 작용제의 농도 구배가 존재한다. 또한, 세포 배양 기질(50)의 이 부분에는 다른 작용제 저장소(33, 35)로부터 확산된 작용제가 실질적으로 존재하지 않는다. 따라서, 이러한 다른 작용제의 농도는 세포 배양 기질(50)의 이 부분에서 실질적으로 0이다. 이것은 작용제 저장소(31, 33, 35)에 대해 주변인 세포 배양 기질(50)의 각 부분에서 세포 배양 기질(50)에 N개의 실질적으로 중첩되지 않는 작용제 농도 구배가 있음을 의미한다.
작용제 저장소(31, 33, 35) 내의 작용제는 세포 배양 기질(50)에서 주변부로 확산될 뿐만 아니라 조합 영역(41, 43, 45)을 갖는 중심 창 또는 부분(40)의 중심(15)쪽으로도 확산된다. 세포 배양 기질(50)의 이 중심 창 또는 부분(40)에서 작용제는 조합 영역(41, 43, 45)에 적어도 부분적으로 중첩되는 작용제 농도 구배를 형성할 것이다. 이는 주어진 조합 영역(41)에서 2개의 인접한 작용제 저장소(31, 33)의 제1 조합에 함유된 작용제의 작용제 농도 구배가 적어도 부분적으로 중첩될 것이고, 이에 반해, 다른 조합 영역(43)에서는 2개의 인접한 작용제 저장소(33, 35)의 제2 조합에 함유된 작용제의 작용제 농도가 적어도 부분적으로 중첩될 것임을 의미한다. 이는, 각 작용제 저장소(31, 33, 35)가 다른 작용제 저장소(31, 33, 35)의 작용제와 상이한 작용제를 포함할 때, 각 조합 영역(41, 43, 45)은 적어도 부분적으로 중첩되는 작용제 농도 구배의 고유의 조합을 포함한다는 것을 의미한다.
작용제 저장소(31, 33, 35)의 배열의 결과로서, 세포 배양 기질(50)의 중심 창 또는 부분(40)은 적어도 부분적으로 중첩되는 작용제 농도 구배를 포함할 것이지만, 반면에 작용제 저장소(31, 33, 35) 너머의 세포 배양 기질(50)의 주변 부분은 실질적으로 중첩되지 않는 작용제 농도 구배를 포함한다.
작용제 저장소(31, 33, 35)의 외부 경계 주변의 세포 배양 기질(50)의 영역 또는 부분은 각각 저해 구역(60, 62, 64)을 포함한다. 저해 구역(60, 62, 64)에서, 작용제 저장소(31, 33, 35)에 함유된 작용제의 농도는 세포 집단(55)의 임의의 성장을 방해하기에 충분히 높다. 작용제 저장소(31, 33, 35)로부터 세포 배양 기질(50)의 주변 쪽으로 이동할 때 이 저해 구역(60, 62, 64)의 끝, 즉, 소위 저해 종말점(61, 63, 65)은 세포 집단(55)의 성장을 방해하거나 저해할 수 있는 작용제 저장소(31, 33, 35)에 함유된 작용제의 최저 농도를 나타낸다.
세포 배양 기질(50)의 중심 창 또는 부분(40)에서 각각의 조합 영역(41, 43, 45)은 세포 집단(55)의 성장을 포함하는 각각의 성장 구역(70, 72, 74)을 포함한다. 이러한 각각의 성장 구역(70, 72, 74)은 세포 집단이 더 이상 성장하지 않는 조합 영역(41, 43, 45) 내의 종말점을 포함한다. 세포 성장과 세포 성장 결여 사이의 이러한 종말점은 소위 성장 종말점(71, 73, 75)을 구성한다. 이 종말점에서, 인접한 작용제 저장소(31, 33, 35)에 함유된 2가지 작용제 농도의 조합은 세포 집단(55)의 성장을 방해하거나 저해하기에 충분하다.
두 작용제 간의 작용제 상호작용 효과는 그 다음 두 작용제의 작용제 농도 구배가 부분적으로 중첩되는, 조합 영역(41, 43, 45)에 대해 결정된 성장 종말점(71, 73, 75)에 기초하여, 그리고 두 작용제/작용제 저장소(31, 33, 35)에 대해 결정된 저해 종말점(61, 63, 65)에 기초하여 결정될 수 있다.
일 실시형태에서, 방법은 도 13에 도시된 바와 같은 2개의 부가적 단계를 포함한다. 단계 S10은 도 12의 단계 S3 다음에 수행되며, 적어도 2개의 인접한 작용제 저장소(31, 33, 35)의 각각의 작용제 저장소(31, 33, 35)에 대해, 저해 종말점(61, 63, 65)에 기초하여 세포 집단에 관한 작용제 저장소(31, 33, 35)에 함유된 작용제의 최소 저해 농도(MIC)를 결정하는 것을 포함한다. 도 13의 단계 S11은 도 12의 단계 S4 이후에 수행되며, 적어도 2개의 인접한 작용제 저장소(31, 33, 35)의 각각의 작용제 저장소(31, 33, 35)에 대해, 성장 종말점(71, 73, 75)에 기초하여 적어도 2개의 인접한 작용제 저장소(31, 33, 35)에 함유된 작용제 혼합물에서 작용제 저장소(31, 33, 35)에 있는 작용제의 MIC를 결정하는 것을 포함한다.
방법은 그 다음 도 12의 단계 S5로 계속된다. 이 실시형태에서, 단계 S5는 MIC에 기초하여 분할 저해 농도 지수(FICi)를 결정하는 것을 포함한다.
특정 실시형태에서, 단계 S5는 cA/MICA + cB/MICB에 기초하거나, 바람직하게는 그와 동일한 FICi를 결정하는 것을 포함한다. MICA는 작용제 저장소(31)에 함유된 작용제 A에 대해 단계 S10에서 결정된 MIC를 나타내는 반면, MICB는 인접 작용제 저장소(33)에 함유된 작용제 B에 대해 단계 S10에서 결정된 MIC를 나타낸다. 따라서, 이러한 MIC 값은 각각의 저해 종말점(61, 63)에 기초하여 결정된다. 이에 상응하게, cA는 성장 종말점(71)에 기초하여 단계 S11에서 결정된 작용제 A 및 B의 MIC-생성 혼합물 중 작용제 A의 MIC를 나타내는 반면, cB는 이 성장 종말점(71)에 기초하여 단계 S11에서 결정된 작용제 A 및 B의 MIC 생성 혼합물 중 작용제 B의 MIC를 나타낸다.
따라서, 본 발명은 작용제의 조합에 대한 FICi를 결정하기 위해 필요되기도 하는, 혼합물 중 작용제의 MIC뿐만 아니라 작용제의 개별 MIC를 제공하므로, 본 발명은 단일 실험 및 세포 용기(10)에서 두 작용제의 조합에 대한 FICi를 결정할 수 있다.
도 11은 도 10에 도시된 바와 같은 배양 용기에서 테스트된 3가지 작용제 A, B, 및 C에 대한 FICi 값을 나타내는 다이어그램이다. 1보다 작은 FICi 값은 상승작용 효과를 나타낸다. 이러한 상승작용 효과는 테스트 작용제 A와 B의 조합에서 관찰된다. 약 1과 동일한 FICi 값은 작용제 B와 C의 조합에 의해 나타나는 바와 같이, 부가적 효과를 나타낸다. 일반적으로, 1보다 큰 FICi 값은 길항작용 효과를 나타낸다. 본 실시예에서, 작용제 A 및 C의 조합은 길항작용 효과를 달성한다. 상승작용의 임상적으로 관련 있는 수준은 일반적으로 (여기서 작용제 A와 B 사이에 나타난 바와 같이) 0.5보다 작은 FICi 값으로서 정의되고, 길항작용의 임상적으로 관련 있는 수준은 일반적으로 (여기서 작용제 A와 C 사이에 나타난 바와 같이) 4보다 큰 FICi 값으로서 정의된다.
일 실시형태에서, 도 13의 단계 S10은, 적어도 2개의 인접한 작용제 저장소(31, 33, 35)의 각각의 작용제 저장소(31, 33, 35)에 대해, 세포 배양 기질(50)과 관련하여 작용제 저장소(31, 33, 35)에 함유된 작용제의 확산 계수 및 저해 종말점(61, 63, 65)에 기초하여 작용제 저장소(31, 33, 35)에 함유된 작용제의 MIC를 결정하는 것을 포함한다. 이 실시형태에서 단계 S11은 적어도 2개의 인접한 작용제 저장소(31, 33, 35)의 각각의 작용제 저장소(31, 33, 35)에 대해, 확산 계수 및 성장 종말점(71, 73, 75)에 기초하여 적어도 2개의 인접한 작용제 저장소(31, 33, 35)에 함유된 작용제 혼합물 중 작용제 저장소(31, 33, 35)에 함유된 작용제의 MIC를 결정하는 것을 포함한다.
세포 배양 기질(50)과 관련하여 작용제의 확산 계수는 세포 배양 기질(50) 내의 거리를 작용제의 농도로 변환하는 데 사용될 수 있다. 작용제의 작용제 농도 구배가 Fick의 확산 법칙을 따른다고 가정하면, 작용제의 농도(C)는 이류 플럭스 및 순 부피 공급원의 부재 하에 유한 요소 모델(FEM)을 사용하여 대류-확산 방정식을 풀어서 계산할 수 있다. 모델은 일정 지점의 작용제 농도를 계산하기 위해, 작용제 저장소(31, 33, 35)의 일정 지점과 세포 배양 기질(50)의 임의의 주어진 지점 사이의 거리(X)와 확산 계수(d) 및 확산 시간(t)을 사용하며, 즉, 일부 함수 f()에 대해 C=f(d,t,X)이다. 저해 종말점(61, 63, 65) 또는 성장 종말점(71, 73, 75)까지의 거리를 측정할 때, 기준 지점으로서 사용되는 작용제 저장소(31, 33, 35)의 일정 지점은 작용제 저장소(31, 33, 35)의 중간 또는 중심 또는 작용제 저장소(31, 33, 35)의 경계와 같이 작용제 저장소(31, 33, 35) 내에 있거나 그에 상대적인 임의의 기준 지점일 수 있다.
작용제의 확산 계수는 전형적으로 사용되는 특정 세포 배양 기질(50)에 따라 달라진다. 이것은 제1 세포 배양 기질을 사용하는 경우 주어진 작용제는 제1 확산 계수를 가질 수 있고, 제2의 상이한 세포 배양 기질을 사용할 때에는 제2의 상이한 확산 계수를 가질 수 있음을 의미한다.
작용제의 확산 계수는 확산 보정에서 세포 배양 기질에 대해 결정될 수 있다. 이러한 확산 보정은 각각의 상이한 농도로 작용제를 포함하는 N개 작용제 저장소(31, 33, 35)를 포함하는 배양 용기(10)에 세포 배양 기질(50)을 첨가하는 것을 포함한다. 예를 들어, 세포 배양 기질 겔은 배양 용기(10)에 첨가될 수 있고 세포 배양 기질(50)로 고형화되게 할 수 있다. 확산 보정은 또한 세포 배양 기질(50) 상에 그리고/또는 내에 테스트 세포 집단(55)을 배치하고, 세포 배양 기질(50)을 통해 N개 작용제 저장소(31, 33, 35)의 작용제가 확산하는 동안, 세포 배양 기질(50) 상의 그리고/또는 내의 테스트 세포 집단(55)을 소정의 시간 기간 동안 배양하는 것을 포함한다. 이들 단계는 기본적으로 도 12에 도시된 단계 S1 및 S2에 상응하지만, 각 작용제 저장소(31, 33, 35)가 동일한 작용제를 포함하지만, 바람직하게는 상이한 농도로 포함한다는 차이가 있다. 확산 보정에서 작용제의 상이한 농도를 사용한다는 것은 특정 작용제가 세포 배양 기질(50)을 통해 빠르게 확산할지라도, 판독가능한 결과가 있을 것임을 의미한다. 확산 보정에 사용된 테스트 세포 집단(55)은 작용제에 대해 알려진 MIC를 갖는다.
확산 보정은 또한 N개 작용제 저장소(31, 33, 35) 중 적어도 하나의 작용제 저장소(31, 33, 35)에 대해, 테스트 세포 집단(55)의 임의의 성장이 실질적으로 결여된 저해 구역(60, 62, 64)의 저해 종말점(61, 63, 65)을 결정하는 것을 포함한다. 저해 종말점(61, 63, 65)은 작용제 저장소(31, 33, 35)의 외부 경계 주변에 위치한다. 이 단계는 기본적으로 도 12의 단계 S3에 상응한다.
확산 보정은 테스트 세포 집단(55)에 관하여 작용제의 MIC 및 저해 종말점(61, 63, 65)에 기초하여 세포 배양 기질(50)에 관한 작용제의 확산 계수를 결정하는 것을 더 포함한다.
따라서, 저해 종말 구역(60, 62, 63)의 저해 종말점(61, 63, 65)은 테스트 세포 집단(55)에 관한 작용제의 MIC에 상응하는, 즉, 실질적으로 동일한 작용제의 농도를 갖는다. 그런 다음 확산 계수(d)는 이전에 언급된 방정식 C=f(d,X)를 사용하여, C를 알려진 MIC와 동일하게 설정하고 X를 저해 종말점(61, 63, 65)과 작용제 저장소(31, 33, 35)의 일정 지점 사이의 거리와 동일하게 설정함으로써 계산할 수 있다.
확산 보정에 사용되는 테스트 세포 집단(55)은 작용제에 대해 알려진 MIC를 갖고 세포 배양 기질(50) 상에 그리고/또는 내에 배양될 수 있는 임의의 세포 집단일 수 있다.
확산 보정은 작용제 상호작용 효과를 결정하는 방법을 수행하기 전에 별도의 과정으로서 수행될 수 있다. 대안적으로, 확산 보정은 한 번 수행될 수 있고, 그 다음 그 정보는 이후에 작용제 상호작용 효과를 결정하는 방법을 수행할 때 사용하기 위해 저장될 수 있다. 따라서, 방법에 사용하기 위한 확산 계수는 표 또는 목록에서 검색될 수 있으며, 예를 들어, 위에서 언급한 확산 보정을 사용하여 사전에 결정되었을 수 있다.
세포 집단(55)은 소정의 시간 기간 동안 세포 배양 기질(50) 상에 그리고/또는 내에 배양된다. 이 시간 기간은 세포가 세포 배양 기질(50) 상에 그리고/또는 내에 성장할 수 있고 작용제 저장소(31, 33, 35)에 함유된 작용제가 세포 배양 기질(50) 내로 확산되어 작용제 농도 구배를 형성할 수 있도록 선택된다.
시간 기간은 너무 길지 않아야 하는데, 이러한 경우, 사실상 작용제는 세포 배양 기질(50) 내에서 기본적으로 균일한 작용제 농도를 형성하도록 세포 배양 기질(50) 내로 확산하여, 더 이상 임의의 작용제 농도 구배를 형성하지 않도록 할 수 있다. 시간 기간은 더욱이 작용제 농도 구배가 세포 배양 기질(50)에서 확립될 시간을 갖지 못하고 세포 배양 기질(50) 상에 그리고/또는 내에 세포 집단(55)이 성장하기에 충분한 시간을 가지지 못할 수 있으므로, 너무 짧지 않아야 한다.
소정의 시간 기간은 일 실시형태에서, 작용제 저장소(31, 33, 35)에 함유된 작용제의 확산 계수 및 바람직하게는 세포 집단(55)의 세포 분열 시간에 기초하여 선택된다. 전형적인 실시형태에서, 소정의 시간 기간은 6 시간 내지 36 시간의 간격, 바람직하게는 8 시간 내지 32 시간의 간격, 보다 바람직하게는 10 시간 내지 30 시간의 간격 내에서 선택된다. 현재 바람직한 시간 기간은 12 시간 내지 24 시간이다. 따라서, 전형적인 실시형태에서, 세포 집단(55)은 세포 배양 기질(50) 상에 그리고/또는 내에 밤새 배양된다.
일 실시형태에서, 방법은 도 14에 도시된 바와 같은 부가 단계 S20을 포함한다. 이 단계 S20은 N개 작용제 저장소(31, 33, 35)의 각 작용제 저장소(31, 33, 35) 내로 겔과 혼합된 작용제를 첨가하고, 이 겔을 작용제 포함 플러그로 고형화시키는 것을 포함한다.
이 실시형태에서, 각 작용제 저장소(31, 33, 35)는 따라서 도 12에서의 단계 S1에서 세포 배양 기질 또는 세포 배양 기질 겔을 첨가하기 전에 작용제 포함 플러그를 포함한다. 작용제가 혼합되는 겔은, 단계 S1에서 첨가된 세포 배양 기질 겔 또는 작용제 포함 플러그 내에서 고형화될 수 있는 또 다른 겔일 수 있다. 하지만, 이러한 작용제 포함 플러그 내의 작용제는 배양 용기(10)에서 형성된 즉시, 작용제 포함 플러그로부터 세포 배양 기질(50) 내로 확산할 수 있어야 한다.
도 15는 작용제 저장소(31, 33, 35)에 작용제를 제공하는 또 다른 실시형태를 예시한 것이다. 이 실시형태에서, N개 작용제 저장소(31, 33, 35)의 각 작용제 저장소(31, 33, 35)는 작용제를 동결건조된 또는 건조된 형태로 포함한다. 이러한 경우에, 겔은 단계 S21에서 그리고 N개 작용제 저장소(31, 33, 35)의 각 작용제 저장소(31, 33, 35) 내로 첨가된다. 작용제는 그 다음 겔 내로 용해 또는 분산되고 겔은 작용제 포함 플러그로 고형화되도록 한다.
단계 S21은 도 12에서 단계 S1과 별도로 또는 함께 수행될 수 있다. 전자의 경우에, 겔은 먼저 작용제 저장소(31, 33, 35)에 첨가되고, 작용제 포함 플러그로 고형화되도록 한다. 이러한 경우, 겔은 단계 S1에서 첨가된 세포 배양 기질 겔 또는 작용제 포함 플러그로 고형화될 수 있는 또 다른 겔일 수 있다. 후자의 경우, 작용제 포함 플러그는 작용제 저장소(31, 33, 35)에 존재하는 세포 배양 기질(50)의 일부이다. 동결건조된 또는 건조된 작용제를 갖는 작용제 저장소(31, 33, 35)를 사용하는 경우에는, 단계 S21에서 작용제 저장소(31, 33, 35)에 작용제 포함 플러그를 먼저 형성시키고, 그 다음 별도의 단계로서 단계 S1에서 세포 배양 기질 또는 세포 배양 기질 겔을 첨가하여 겔 및 작용제 포함 플러그 내의 작용제가 적어도 실질적으로 균일하고 일정한 작용제 농도로 양호한 용해 또는 분산을 수득하도록 하는 것이 바람직하다.
일 실시형태에서, 도 12의 단계 S1은 소정의 부피의 세포 배양 기질 겔을 배양 용기(10) 내로 첨가하여 N개 작용 저장소(31, 33, 35)를 커버하고, 세포 배양 기질 겔이 세포 배양 기질(50)로 고형화하도록 하는 것을 포함한다. 따라서, 작용제 저장소(31, 33, 35)를 덮는 세포 배양 기질(50)을 형성하기 위해서는 충분한 부피의 배양 기질 겔이 배양 용기(10)에 첨가되어야 한다.
예시적인 예로서, 표준 90㎜ 페트리 접시에는 25㎖의 소정의 부피가 사용될 수 있다. 다른 배양 용기(10)의 경우, 소정의 부피는 배양 용기 인서트(20)를 덮도록 계산된 것이 바람직하다. 특정 예에서, 배양 용기 인서트(20)는 바람직하게는 적어도 2㎜이지만, 바람직하게는 10㎜ 이하인 높이로 덮어야 한다.
소정 부피의 세포 배양 기질 겔을 갖는다면, 세포 배양 기질(50)의 표면(51)에 세포 집단을 배치하고 세포 배양 기질(50)의 표면(51) 상에 세포 집단(55)을 배양할 때 특히 유리하다. 이러한 경우에, 작용제는 세포 배양 기질(50)을 통해 확산할 것이고 조합 영역(41, 43, 45) 내에 세포 배양 기질(50)의 표면(51)을 따라 적어도 부분적으로 중첩되는 작용제 농도 및 작용제 저장소(31, 33, 35)의 외부 경계 주변에서 세포 배양 기질(50)의 표면(51)을 따라 실질적으로 중첩되지 않는 작용제 농도 구배를 형성할 것이다.
이러한 소정 부피의 세포 배양 기질 겔은 또한 전술한 확산 보정에 바람직하게 사용된다.
소정 부피의 세포 배양 기질 겔은 배양 용기(10)의 부피에 적어도 부분적으로 의존적이다.
일 실시형태에서, 도 12의 단계 S3은 N개 작용제 저장소(31, 33, 35)의 각 작용제 저장소(31, 33, 35)에 대해, 저해 구역(60, 62, 64)의 저해 종말점(61, 63, 65)을 결정하는 것을 포함한다. 단계 S4는 이 실시형태에서 N개 작용제 저장소(31, 33, 35) 중 2개의 인접한 작용제 저장소(31, 33, 35)의 각 조합에 대해, 인접한 2개의 작용제 저장소(31, 33, 35)에 함유된 작용제의 적어도 부분적으로 중첩되는 작용제 농도 구배를 갖는 조합 영역(41, 43, 45) 내에 성장 구역(70, 72, 74)의 성장 종말점(71, 73, 75)을 결정하는 것을 포함한다. 이 실시형태에서, 단계 S5는 2개의 인접한 작용제 저장소(31, 33, 35)의 각 조합에 대해, 2개의 인접한 작용제 저장소(31, 33, 35)에 대해 결정된 저해 종말점(61, 63, 65) 및 2개의 인접한 작용제 저장소(31, 33, 35)에 대해 결정된 성장 종말점(71, 73, 75)에 기초하여 2개의 인접한 작용제 저장소(31, 33, 35)에 함유된 작용제 사이의 작용제 상호작용 효과를 결정하는 것을 포함한다.
이런 이유로, 이 실시형태에서는 N개 저해 종말점(61, 63, 65) 및 N개 성장 종말점(71, 73, 75)이 결정되고 인접한 작용제 저장소(31, 33, 35) 및 이 안에 함유된 작용제의 각 쌍에 대해 작용제 상호작용 효과가 결정된다. 예를 들어, 작용제 A, B 및 C를 갖는 3개의 작용제 저장소(31, 33, 35)를 포함하는 도 1, 2, 9 및 10에 도시된 배양 용기(10)는 작용제 A와 B 사이, 작용제 A와 C 사이 및 작용제 B와 C 사이의 작용제 상호작용 효과를 결정하는데 사용될 수 있다.
일 실시형태에서, N개 작용제 저장소(31, 33, 35)는 도 1에 도시된 원의 원주를 따라 서로에 상대적인 소정의 위치에 배열된다. 이러한 실시형태에서, 저해 종말점(61, 63, 65)은 원 및 작용제 저장소(31, 33, 35)의 중심(15)을 통과하는 축(80)을 따라, 그리고 작용제 저장소(31, 33, 35)의 외부 경계 주변의 축(80)을 따른 위치에 위치한다.
이런 이유로, 이러한 실시형태에서, 저해 종말점(61, 63, 65)은 원의 중심(15)에 상대적인 방사상으로, 그리고 작용제 저장소(31, 33, 35)를 통과하는 반경을 따라 위치한다.
도 2, 9 및 10에 도시된 배양 용기(10)는 배양 용기 인서트(20)에 3개의 작용제 저장소(31, 33, 35)를 포함하며, 즉, 매개변수 N은 3이다. 하지만, 실시형태는 이에 제한되지 않고, 도 4 내지 6 및 8에 도시된 바와 같은 3개 초과의 작용제 저장소(31, 33, 35, 37, 39)를 사용하는 것을 포괄한다. 배양 용기(10)가 3개 초과의 작용제 저장소(31, 33, 35, 37, 39)를 포함한다면, 그 다음 일반적으로 인접하지 않은 작용제 저장소의 농도 구배는 배양 용기 인서트(20)의 중간에서 전형적으로 중첩될 것이고, 이는 임의의 작용제 상호작용 효과를 결정하기 위해 더욱 복잡한 계산을 야기한다.
이런 이유로, 바람직한 실시형태에서, 매개변수 N은 3이고, 이에 따라 단일 실험에서 작용제 저장소(31, 33, 35)에 함유된 작용제의 모든 조합에 대한 작용제 상호작용 효과를 테스트할 수 있도록 한다.
일 실시형태에서, 각 작용제 저장소(31, 33, 35)는 도 1에 도시된 바와 같이 원의 원주와 함께 정렬된 원주 벽(24)과 현 벽(21, 23, 25) 사이에 에워싸인다. 이러한 실시형태에서, 3개의 현 벽(21, 23, 25)는 삼각형(40)을 에워싼다. 이런 이유로, 이러한 실시형태에서, 중심 창 또는 부분은 삼각형(40)의 형태 내에 있다.
바람직한 실시형태에서, 각 작용제 저장소(31, 33, 35)의 부피는 동일하고, 이에 따라 각 현 벽(21, 23, 25)은 동일한 길이를 갖는다. 이러한 실시형태에서, 3개의 현 벽(21, 23, 25)에 의해 에워싸인 삼각형(40)은 등변 삼각형(40)이다. 하지만, 실시형태는 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 3개의 현 벽(21, 23, 25)에 의해 에워싸인 삼각형(40)은 이등변 삼각형(40)일 수 있다. 이러한 실시형태에서, 2개의 작용제 저장소(31, 33)는 동일한 부피 및 동일한 길이의 현 벽(21, 23)을 가질 수 있는 반면, 나머지 작용제 저장소(35)는 상이한 부피 및 길이의 현 벽(25)을 가질 수 있다. 이러한 경우에, 작용제 농도 구배의 해상은 상이한 작용제 및 작용제 저장소(31, 33, 35)마다 상이할 것이다.
세포 배양 기질(50) 내에 그리고/또는 상에 배양된 세포 집단(55)은 단일 세포 또는 세포 혼합물의 임의의 집단일 수 있다. 세포는, 예를 들어, 세균 세포, 효모 세포, 진균 세포, 조류 세포, 식물 세포, 동물 세포, 예를 들어, 인간 세포, 예컨대, 예시적이지만 비제한적인 예로서 무한증식성 세포주, 원발성 암 세포 및 샘플 유래 배양물일 수 있다. 세포는 또한 파지-감염된 세균 및 바이러스-감염된 진핵 세포일 수 있다. 예를 들어, 세포 집단(55)은 환자로부터 취해진 것과 같은 생물학적 샘플로부터 수득될 수 있다. 생물학적 샘플은 그 다음 혈액 샘플, 혈장 샘플, 혈청 샘플, 림프액 샘플, 뇌척수액 샘플, 또는 소변 샘플과 같은 체액 샘플, 또는 생검 샘플 및 체액 또는 조직 샘플에서 단리되고 선택적으로 정제된 세포와 같은 체조직 샘플일 수 있다.
본 발명은 단리되거나 정제된 세포 샘플에 사용될 수 있을 뿐만 아니라 실제로 조합된 세포 샘플, 즉, 실시예 5에 제시된 바와 같은 2종 이상의 상이한 유형 또는 균주의 세포를 포함하는 샘플에서 하나 이상의 세포에 대한 작용제 상호작용 효과를 결정하는 데 사용될 수 있다. 이것은 본 발명에 따라 세포를 분석하기 전에 임의의 세포 또는 균주 정제 단계에 대한 필요성을 완화시킴을 의미한다. 바람직한 실시형태에서, 세포 혼합물 내의 상이한 세포 또는 균주는 바람직하게는 세포 배양 기질 상에서 그리고/또는 내에서 식별 가능하고, 특히 가시적으로 식별 가능하다. 예를 들어, 개별 세포 또는 균주는 간상형 세균 세포 대 일반적으로 둥근 모양을 갖는 구균과 같이 개별 세포의 모양에 의해, 혼합물 내 하나 이상의 세포 또는 균주가 형광 단백질을 발현한다면 형광 측정 또는 현미경검사에 의해, 또는 혼합물 내 하나 이상의 세포 또는 균주가 염료 또는 비색 표지 등을 발현한다면 비색 측정 또는 현미경검사에 의해 식별 및 분리될 수 있다.
본 발명의 방법의 전형적인 적용은 세균 집단에 대한 항생제와 같은 항미생물제 조합의 FICi 값을 결정하는 정황에서 이루어진다. 세균 집단은, 예를 들어, 세균 감염을 앓고 있는 대상체로부터의 혈액 배양물 또는 다른 체액 또는 조직 샘플에서 유래할 수 있다. 이 방법은 그 다음 세균 집단의 성장을 저해하는데 효과적인 항미생물제의 적합한 조합을 찾는 데 사용될 수 있고, 따라서 세균 감염을 퇴치하기 위해 대상체에게 투여될 수 있다.
이러한 특정 실시형태에서, 그리고 도 1, 2, 9 및 10에 도시된 바와 같은 세포 용기(10)의 사용 시, 도 12의 단계 S1은 서로에 대해 소정의 위치에 3개의 작용제 저장소(31, 33, 35)를 포함하는 배양 용기(10)에 세포 배양 기질 겔을 첨가하고, 세포 배양 기질 겔이 세포 배양 기질(50)로 고형화하도록 하는 것을 포함한다. 이 특정 실시형태에서, 3개의 작용제 저장소(31, 33, 35) 중 각각의 작용제 저장소(31, 33, 35)는 항미생물제를 포함한다. 단계 S2는 세포 배양 기질(50) 상에 그리고/또는 내에, 바람직하게는 세포 배양 기질(50)의 표면(51) 상에 세균 집단(55)을 배치하고, 세포 배양 기질(50) 상에 그리고/또는 내에, 바람직하게는 세포 배양 기질(50)의 표면(51) 상에, 3개의 작용제 저장소(31, 33, 35) 내의 항미생물제가 세포 배양 기질(50)을 통해 확산되고 조합 영역(41, 43, 45) 내의 세포 배양 기질(50)에서는 적어도 부분적으로 중첩되는 작용제 농도 구배를 형성하고 3개의 작용제 저장소(31, 33, 35)의 외부 경계 주변의 세포 배양 기질(50)에서는 실질적으로 중첩되지 않는 작용제 농도 구배를 형성하는 동안, 바람직하게는 12시간 내지 24시간의 간격 내에서 선택되는 소정의 시간 기간 동안 세균 집단(55)을 배양하는 것을 포함한다. 단계 S3은 각 작용제 저장소(31, 33, 35)에 대해, 세균 집단(55)의 임의의 성장이 실질적으로 결여된 저해 구역(60, 62, 64)의 저해 종말점(61, 63, 65)을 결정하는 것을 포함한다. 이 실시형태에서, 저해 구역(60, 62, 64)의 종말점(61, 63, 65)은 원 및 작용제 저장소(31, 33, 35)의 중심(15)을 통과하는 축(80)을 따라, 그리고 작용제 저장소(31, 33, 35)의 외부 경계 주변인 축(80)을 따른 위치에 위치한다. 단계 S4는 2개의 인접한 작용제 저장소(31, 33, 35)의 각 조합에 대해, 2개의 인접한 작용제 저장소(31, 33, 35)에 함유된 항미생물제의 적어도 부분적으로 중첩되는 작용제 농도 구배를 갖는 조합 영역(41, 43, 45) 내에서 세균 집단(55)의 성장을 포함하는 성장 구역(70, 72, 74)의 성장 종말점(71, 73, 75)을 결정하는 것을 포함한다.
이러한 특정 실시형태에서, 방법은 도 13에 도시된 바와 같은 단계 S10 및 S11을 더 포함한다. 이러한 경우에 단계 S10은 각 작용제 저장소(31, 33, 35)에 대해, 저해 종말점(61, 63, 65)에 기초한 세균 집단(55)과 관련하여 작용제 저장소(31, 33, 35)에 함유된 항균제의 MIC 및 세포 배양 기질(50)과 관련하여 작용제 저장소(31, 33, 35)에 함유된 항균제의 확산 계수를 결정하는 것을 포함한다. 단계 S11은 2개의 인접한 작용제 저장소(31, 33, 35)의 각 작용제 저장소(31, 33, 35)에 대해, 성장 종말점(71, 73, 75)에 기초한 2개의 인접한 작용제 저장소(31, 33, 35)에 함유된 작용제 혼합물에서 작용제 저장소(31, 33, 35)에 함유된 항미생물제의 MIC 및 확산 계수를 결정하는 것을 포함한다.
방법은 그 다음 단계 S5에서 MIC에 기초한 FICi를 결정하는 것을 포함한다.
본 발명은 또한 세포 집단에 대한 작용제 상호작용 효과를 결정하기 위한 방법에 사용될 수 있는 배양 용기 인서트(20)에 관한 것이다. 일 실시형태에서, 배양 용기 인서트(20)는 중심 N각형 개구부(40), 바람직하게는 중심 등변 N각형 개구부(40)를 갖는 원형 바닥 플레이트(22)를 포함한다. 일 실시형태에서, 배양 용기 인서트(20)는 원형 바닥 플레이트(22)의 원주에 부착된 원형 벽(24)을 포함한다. 세포 배양 기질(20)은 또한 이 실시형태에서, 원형 벽(24) 및 원형 바닥 플레이트(22)에 부착되고 중심 N각형 개구부(40)를 에워싸는 N개의 현 벽(21, 23, 25)을 포함한다. 원형 바닥 플레이트(22), 원형 벽(24) 및 각각의 현 벽(21, 23, 25)은 작용제 저장소(31, 33, 35)를 획정하며, N은 3 이상의 정수이다.
일 실시형태에서, 원형 바닥 플레이트(22)는 적어도 하나의 작용제 저장소(31, 33, 35) 내에 존재하는 적어도 하나의 식별자(32, 34, 36)를 포함한다. 도 1은 이러한 식별자(32, 34, 36)를 예시한다. 적어도 하나의 작용제 저장소(31, 33, 35)가 이러한 식별자(32, 34, 36)를 포함해도 일반적으로 충분한데, 그 이유는 나머지 작용제 저장소(31, 33, 35)가 이 작용제 저장소(31, 33, 35)에 상대적으로 그들의 소정의 위치에 관해 식별될 수 있기 때문이다. 그러나, 바람직한 실시형태에서, 각각의 작용제 저장소(31, 33, 35)는 도 1에 도시된 바와 같이 각각의 식별자(32, 34, 36)를 포함한다. 식별자(32, 34, 36)는 바닥 플레이트(22)에 있는 문자, 숫자 또는 다른 마킹과 같은 임의의 식별자일 수 있다.
세포 배양 인서트(20)는 중합체, 플라스틱, 금속 합금을 포함하는 금속, 유리 및 세라믹을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 다양한 물질로 제조될 수 있다. 이 물질은 작용제 저장소(31, 33, 35)에 함유될 작용제에 대해 비활성이어야 하고, 즉, 작용제와 반응하지 않아야 한다. 물질은 바람직하게는 오토클레이빙, 화학적 멸균 및/또는 방사선 멸균과 같이 멸균될 수 있어야 한다.
세포 배양 인서트(20)는 일회용일 수 있으므로 사용 후 폐기될 수 있다. 대안적으로, 세포 배양 인서트(20)는 재사용 가능하여 세척 및 멸균 후 여러 실험에 사용될 수 있다.
비제한적이지만 예시적인 플라스틱의 예로는 세포 배양에 통상적으로 사용되는 플라스틱, 예를 들어, 폴리스타이렌(PS), 폴리프로필렌(PP), 폴리염화비닐(PVC), 폴리에틸렌(PE), 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET), 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE), 폴리에터 에터 케톤(PEEK) 아크릴로니트릴 부타다이엔 스타이렌(ABS), 나일론 폴리아마이드(PA), 폴리카보네이트(PC), 폴리옥시메틸렌(POM), 폴리(메틸 메타크릴레이트)(PMMA), 폴리페닐렌 설파이드(PPS) 및 이들의 공중합체를 포함한다.
비제한적이지만, 예시적인 금속의 예로는 티타늄, 알루미늄, 구리, 아연 및 망간뿐만 아니라 이들의 합금 및 강철을 포함한다.
비제한적이지만, 예시적인 세라믹의 예로는 탄소 및 규소 기반의 결정질 및 비결정질 세라믹을 포함한다.
세포 배양 인서트(20)는 3D 프린팅, 몰딩, 기계가공, 주조 및 조각화를 포함하나, 이에 제한되지 않는 다양한 제조 공정을 사용하여 제조될 수 있다.
일 실시형태에서, 세포 배양 인서트(20)는 광학적으로 투명하거나, 적어도 광학적으로 반투명한 물질로 제조된다.
본 발명은 또한 도 2에 예시된 바와 같이 바닥 디스크(12) 및 바닥 디스크(12)에 부착된 원주벽(14)을 포함하는 배양 용기(10)에 관한 것이다. 배양 용기(10)는 또한 원주 벽(14)으로부터 거리가 있는 원형 벽(24) 및 바닥 디스크(12) 상에 위치한 원형 바닥 플레이트(22)를 갖는 원형 용기(10)에 위치한 본 발명에 따른 배양 용기 인서트(20)를 포함한다.
이 실시형태에서, 배양 용기 인서트(20)는 배양 용기(10)에서 분리되며, 도 2에 도시된 바와 같은 배양 용기(10)에 투입되도록 설계되어 있다. 이 실시형태에서, 배양 용기(10)는 배양 용기 인서트(20)가 투입되는 세포 배양 플레이트 또는 접시, 예컨대, 페트리 접시와 같은 임의의 배양 용기(10)일 수 있다. 배양 용기(10)는 그 다음 도 2에 도시된 바와 같이 하나의 배양 용기 인서트(20)를 포함할 수 있고, 또는 배양 용기 인서트(20)의 크기(직경) 대 배양 용기(10)의 크기(직경)에 따라 다수의, 즉, 적어도 2개의 배양 용기 인서트(20)가 배양 용기(10)에 위치할 수 있다.
적어도 하나의 배양 용기 인서트(20)는 배양 용기(10)의 바닥 디스크(12)에 위치한, 바람직하게는 바닥 디스크(12)의 중심 위치에 위치한 원형 바닥 플레이트(22)와 함께 위치한다. 특히, 배양 용기 인서트(20)는 배양 용기 인서트(20)의 원형 벽(24)과 배양 용기(10)의 원주 벽(14) 사이에 공간 또는 거리가 있도록 배양 용기(10)에 위치해야 한다. 이것은 작용제가 원주 벽(14) 쪽의 주변으로 확산하도록 할 여지를 제공하고, 이로써 작용제 저장소(31, 33, 35)의 외부 경계 주변에 실질적으로 중첩되지 않는 작용제 농도 구배를 형성한다.
상기 실시형태에서, 배양 용기 인서트(20)는 배양 용기(10)와 분리되어 있다. 도 3은 배양 용기(110)와 인서트를 단일 조각으로서 갖는 다른 실시형태를 예시한다. 이러한 실시형태에서, 배양 용기(110)는 바닥 디스크(112) 및 바닥 디스크(112)에 부착된 원주 벽(114)을 포함한다. 배양 용기(110)는 또한 바닥 디스크(112)에 부착되고 원주 벽(114)에 에워싸여 이로부터 거리가 있는 원형 벽(124)을 포함한다. 배양 용기(110)는 원형 벽(124) 및 바닥 디스크(112)에 부착되고 바닥 디스크(112)의 N각형 부분(40), 바람직하게는 등변 N각형 부분(40)을 에워싸는 N개 현 벽(121, 123, 125)을 더 포함한다. 이 실시형태에서, 바닥 디스크(112), 원형 벽(124) 및 각 현 벽(121, 123, 125)은 작용제 저장소(131, 133, 135)를 획정하고, N은 3 이상의 정수이다.
일 실시형태에서, 바닥 디스크(112)는 적어도 하나의 작용제 저장소(131, 133, 135) 내에 존재하는 적어도 하나의 식별자를 포함한다.
상기에 기재된 바와 같이, 매개변수 N은 바람직하게는 3이지만, 4, 5, 6, 또는 그 이상과 같이 3 초과일 수도 있다.
도 2에 도시된 배양 용기(10) 또는 도 3에 도시된 배양 용기(110)는 중합체, 플라스틱, 금속 합금을 포함하는 금속, 유리 및 세라믹과 같이, 배양 용기 인서트(20)에 대해 앞서 본 명세서에 기재된 바와 같은 물질로 제조될 수 있다.
일 실시형태에서, 배양 용기 인서트(20) 또는 배양 용기(110)에서 각 작용제 저장소(31, 33, 35; 131, 133, 135)는 겔과 작용제의 고형화된 혼합물로 제조된 작용제 포함 플러그를 포함한다. 이러한 실시형태에서, 각 작용제 포함 플러그는 다른 작용제 포함 플러그 중의 작용제와 상이한 작용제를 포함하는 것이 바람직하다.
다른 실시형태에서, 배양 용기 인서트(20) 또는 배양 용기(110)에서 각 작용제 저장소(31, 33, 35; 131, 133, 135)는 동결건조된 또는 건조된 형태로 작용제를 포함한다. 이러한 실시형태에서, 각각 동결건조된 또는 건조된 작용제는 다른 동결건조된 또는 건조된 작용제와 상이한 것이 바람직하다.
이들 실시형태에서, 배양 용기 인서트(20) 또는 배양 용기(110)는 동결건조 또는 건조된 형태 또는 작용제 포함 플러그의 형태로 작용제가 사전로딩된 것이다.
도 4 내지 8은 대안적인 배양 용기 인서트(20) 실시형태를 예시한 것이다. 이들 배양 용기 인서트(20)는 도 1에 도시된 바와 같은 배양 용기 인서트(20) 대신에 작용제 상호작용 효과를 결정하기 위한 방법에서 배양 용기(10)와 함께 사용될 수 있다. 대안적으로, 도 3의 배양 용기(110)에는 도 3에 도시된 작용제 저장소(131, 133, 135) 대신에 도 4 내지 9 중 임의의 도면에서와 같이 배열되고 획정된 작용제 저장소(31, 33, 35, 37, 39)가 장착될 수 있다.
도 4는 배양 용기 인서트(20)의 외부 경계를 획정하는 직사각형, 바람직하게는 정사각형 벽(24)을 포함하는 배양 용기 인서트(20)를 예시한다. 배양 용기 인서트(20)는 또한 정사각형 벽(24)에 내접된 원형 벽(26)을 포함하고, 즉, 원형 벽(26)의 직경이 바람직하게는 정사각형 벽(24)의 측면 길이와 동일하다. 원형 용기 인서트(20)의 원형 벽(26), 정사각형 벽(24) 및 바닥 플레이트(22)는 4개의 작용제 저장소(31, 33, 35, 37)를 획정한다. 원형 벽(26)은 중심 원형 개구부 또는 창(40)을 에워싼다.
도 5는 배양 용기 인서트(20)의 외부 경계를 획정하는 원형 벽(24)을 포함하는 배양 용기 인서트(20)의 또 다른 실시형태를 예시한다. 배양 용기 인서트(20)는 또한 원형 벽(24)이 외접된 정사각형 벽(26)을 포함하고, 즉, 정사각형 벽(26)의 대각선이 바람직하게는 원형 벽(24)의 직경과 동일하다. 배양 용기 인서트(20)의 정사각형 벽(26), 원형 벽(24) 및 바닥 플레이트(22)는 4개의 작용제 저장소(31, 33, 35, 37)를 획정한다. 정사각형 벽(26)은 중심 정사각형 개구부 또는 창(40)을 에워싼다.
도 6은 배양 용기 인서트(20)의 외부 경계를 획정하는 원형 벽(24)을 포함하는 배양 용기 인서트(20)의 추가 실시형태를 예시한다. 배양 용기 인서트(20)는 또한 원형 벽(24)이 외접된 오각형 벽(26)을 포함한다. 배양 용기 인서트(20)의 오각형 벽(26), 원형 벽(24) 및 바닥 플레이트(22)는 5개의 작용제 저장소(31, 33, 35, 37, 39)를 획정한다. 오각형 벽(26)은 중심 오각형 개구부 또는 창(40)을 에워싼다.
도 1, 도 5 및 도 6에 도시된 바와 같은 실시형태는 원형 벽(24) 및 원형 벽(24)에 의해 외접된 N각형 벽(26)을 갖는 것으로 간주될 수 있다. 도 1에서, N은 3, 즉, 삼각형이고, 도 5에서, N은 4, 즉, 정사각형이며, 도 6에서, N은 5, 즉, 오각형이다. 이 개념은 5보다 큰 N 값에 대해 더욱 확대될 수 있다.
도 7은 배양 용기 인서트(20)의 외부 경계를 획정하는 삼각형 벽(24)을 포함하는 배양 용기 인서트(20)의 실시형태를 예시한다. 배양 용기 인서트(20)는 또한 삼각형 면적을 3개의 작용제 저장소(31, 33, 35) 및 중심 창 또는 개구부(40)로 나누는 3개의 벽(21, 23, 25)을 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 이들 3개의 벽(21, 23, 25)은 길이가 동일하고, 각 벽(21, 23, 25)은 바람직하게는 삼각형 벽(24)의 측면 중 하나에 평행하다. 배양 용기 인서트(20)의 3개의 벽(21, 23, 25), 삼각형 벽(24) 및 바닥 플레이트(22)는 3개의 작용제 저장소(31, 33, 35)를 획정한다.
도 8은 배양 용기 인서트(20)의 외부 경계를 획정하는 외부 직사각형, 바람직하게는 정사각형 벽(24)을 포함하는 배양 용기 인서트(20)의 추가 실시형태를 예시한 것이다. 배양 용기 인서트(20)는 외부 정사각형 벽(24)에 의해 외접된 내부 직사각형, 바람직하게는 정사각형 벽(26)을 포함하고, 즉, 내부 정사각형 벽(26)의 대각선은 바람직하게는 외부 정사각형 벽(24)의 측면 길이와 동일하다. 배양 용기 인서트(20)의 내부 정사각형 벽(26), 외부 정사각형 벽(24) 및 바닥 플레이트(22)는 4개의 작용제 저장소(31, 33, 35, 37)를 획정한다. 내부 정사각형 벽(26)은 중심 정사각형 개구부 또는 창(40)을 에워싼다.
본 발명의 또 다른 측면은 세포 집단(55)에 대한 작용제 상호작용 효과를 결정하기 위한 키트에 관한 것이다. 키트는 임의의 실시형태에 따른 배양 용기(10; 110)를 포함한다. 또한, 키트는 배양 용기(10; 110)에 첨가되도록 구성되고 세포 배양 기질(50)로 고형화되도록 한 세포 배양 기질 겔의 부피를 포함한다. N개 작용제 저장소(31, 33, 35; 131, 133, 135)의 각 작용제 저장소는 각 작용제를 포함하고, N개 작용제 저장소(31, 33, 35)는 조합 영역(41, 43, 45)을 에워싼다. 또한, 키트는 세포 집단(55)을 세포 배양 기질(50) 내에 그리고/또는 바람직하게는 표면(51) 상에 배치하고 소정의 시간 기간 후, 세포 배양 기질(50), 바람직하게는 세포 배양 기질(50)의 표면(51)에 대한 적어도 하나의 사진을 촬영하도록 하는 명령어도 포함한다. N개 작용제 저장소(31, 33, 35)의 작용제는 세포 배양 기질(50)을 통해 확산하여, 조합 영역(41, 43, 45) 내의 세포 배양 기질(50)에 적어도 부분적으로 중첩되는 작용제 농도 구배 및 N개 작용제 저장소(31, 33, 35)의 외부 경계 주변에 있는 세포 배양 기질(50)에 실질적으로 중첩되지 않는 작용제 농도 구배를 형성한다.
키트는 적어도 하나의 사진으로부터, 그리고 N개 작용제 저장소(31, 33, 35; 131, 133, 135)의 각 작용제 저장소(31, 33, 35; 131, 133, 135)에 대해, 세포 집단(55)의 임의의 성장이 실질적으로 결여된 저해 구역(60, 62, 64)의 저해 종말점(61, 63, 65)을 결정하는 명령어를 더 포함한다. 저해 종말점(61, 63, 65)은 작용제 저장소(31, 33, 35; 131, 133, 135)에 대해 주변에 위치한다. 키트는 또한 적어도 하나의 사진으로부터, 그리고 N개 작용제 저장소(31, 33, 35; 131, 133, 135)의 2개의 인접한 작용제 저장소(31, 33, 35; 131, 133, 135)의 각 조합에 대해, 적어도 2개의 인접한 작용제 저장소(31, 33, 35; 131, 133, 135)에 함유된 작용제의 적어도 부분적으로 중첩되는 작용제 농도 구배를 갖는 조합 영역(41, 43, 45) 내에 세포 집단(55)의 성장을 포함하는 성장 구역(70, 72, 74)의 성장 종말점(71, 73, 75)을 결정하는 명령어를 포함한다.
키트는 세포 배양 기질(50)과 관련하여 N개 작용제 저장소(31, 33, 35; 131, 133, 135)에 함유된 작용제에 대한 확산 계수를 정의하는 정보를 포함한다. 키트는 또한 2개의 인접한 작용제 저장소(31, 33, 35; 131, 133, 135)의 각 조합에 대해, 2개의 인접한 작용제 저장소(31, 33, 35; 131, 133, 135)에 대해 결정된 저해 종말점(61, 63, 65), 2개의 인접한 작용제 저장소(31, 33, 35; 131, 133, 135)에 대해 결정된 성장 종말점(71, 73, 75) 및 확산 계수를 정의하는 정보에 기초하여 2개의 인접한 작용제 저장소(31, 33, 35; 131, 133, 135)에 함유된 작용제 사이의 작용제 상호작용 효과를 결정하는 명령어를 포함한다.
특정 실시형태에서, 키트는 본 명세서에 앞서 기재된 바와 같이 저해 종말점(61, 63, 65), 성장 종말점(71, 73, 75) 및 확산 계수를 정의하는 정보를 기초로 하여 결정된 MIC 값에 기초하여 FICi 값을 결정하는 명령어를 포함한다.
일 실시형태에서, 키트는 또한 N개 작용제 및 N개 작용제와 혼합되고 N개 작용제 저장소에서 각각의 작용제 포함 플러그로 고형화될 겔을 포함한다.
도 16은 실시형태에 따라 작용제 상호작용 효과를 결정하는 데 사용될 수 있는 프로세서(210) 및 메모리(220)를 포함하는 컴퓨터(200)의 개략적인 블록 다이어그램이다. 이러한 실시형태에서, 작용제 상호작용 효과의 결정은 컴퓨터(200)의 하나 이상의 프로세서(210)를 포함하는 프로세싱 회로에 의한 실행을 위해 메모리(220)에 로딩되는 컴퓨터 프로그램(240)에서 실행될 수 있다. 프로세서(210) 및 메모리(220)는 정상 소프트웨어가 실행될 수 있도록 서로 상호접속된다. 입력 및 출력(I/O) 장치(230)는 카메라(260)로부터 이미지 데이터를 수신할 수 있도록 프로세서(210) 및/또는 메모리(220)에 바람직하게 접속된다.
용어 프로세서는 일반적인 의미로서, 특정 프로세싱, 결정 또는 계산 과제를 수행하도록 프로그램 코드 또는 컴퓨터 프로그램 명령어를 실행할 수 있는 임의의 회로, 시스템 또는 장치로서 해석되어야 한다. 따라서, 하나 이상의 프로세서(210)를 포함하는 프로세싱 회로는 컴퓨터 프로그램(240)을 실행하는 경우, 본 명세서에 기재된 것과 같은 명확한 프로세싱 과제를 수행하도록 구성된다.
프로세서(210)는 전술한 단계, 기능, 절차 및/또는 블록을 실행하는 데에만 전용적인 것은 아니며, 다른 과제를 실행할 수도 있다.
특정 실시형태에서, 컴퓨터 프로그램(240)은 적어도 하나의 프로세서(210)에 의해 실행되는 경우, 세포 집단(55)을 세포 배양 기질(50) 상에 그리고/또는 내에, 바람직하게는 세포 배양 기질(50)의 표면(51)에 배치한 후 소정의 시간 기간에 배양 용기(10) 중 세포 배양 기질(50)의 표면(51)을 촬영한 적어도 하나의 사진을 나타내는 이미지 데이터를 적어도 하나의 프로세서(210)가 제공하게 하는 명령어를 포함한다. 배양 용기(10)는 서로에 대해 소정의 위치에 N개의 작용제 저장소(31, 33, 35)를 포함한다. N개의 작용제 저장소(31, 33, 35)의 각 작용제 저장소(31, 33, 35)는 작용제를 포함하고 N개의 작용제 저장소(31, 33, 35)는 조합 영역(41, 43, 45)을 에워싼다. N은 3 이상의 정수이다. N개 작용제 저장소(31, 33, 35)의 작용제는 세포 배양 기질(50)을 통해 확산하여, 조합 영역(41, 43, 45) 내의 세포 배양 기질에 적어도 부분적으로 중첩되는 작용제 농도 구배 및 N개의 작용제 저장소(31, 33, 35) 상의 외부 경계 주변에 있는 세포 배양 기질(50)에 실질적으로 중첩되지 않는 작용제 농도 구배를 형성한다. 적어도 하나의 프로세서(210)는 또한 이미지 데이터 및 N개 작용제 저장소(31, 33, 35)의 적어도 2개의 인접한 작용제 저장소(31, 33, 35)의 각 작용제 저장소(31, 33, 35)에 대해, 세포 집단(55)의 임의의 성장이 실질적으로 결여된 저해 구역(60, 62, 64)의 저해 종말점(61, 63, 65)을 결정하도록 야기된다. 저해 종말점(61, 63, 65)은 작용제 저장소(31, 33, 35)의 외부 경계 주변에 위치한다. 적어도 하나의 프로세서(210)는 이미지 데이터에 기초하여 적어도 2개의 인접한 작용제 저장소(31, 33, 35)에 대해, 적어도 2개의 인접한 작용제 저장소(31, 33, 35)에 함유된 작용제의 적어도 부분적으로 중첩되는 작용제 농도 구배를 갖는 조합 영역(41, 43, 45) 내에서 세포 집단(55)의 성장을 포함하는 성장 구역(70, 72, 74)의 성장 종말점(71, 73, 75)을 결정하도록 추가로 야기된다. 적어도 하나의 프로세서(210)는 저해 종말점(61, 63, 65) 및 성장 종말점(71, 73, 75)에 기초하여 적어도 2개의 인접한 작용제 저장소(31, 33, 35)에 함유된 작용제 사이에 작용제 상호작용 효과를 결정하도록 추가로 야기된다.
일 실시형태에서, 명령어는, 적어도 하나의 프로세서(210)에 의해 실행될 때, 적어도 하나의 프로세서(210)로 하여금, 이미지 데이터에 기초하여, 그리고 적어도 2개의 인접한 작용제 저장소(31, 33, 35) 중 각 작용제 저장소(31, 33, 35)에 대해, 저해 종말점(61, 63, 65)에 기초하여 세포 집단(55)에 관한 작용제 저장소(31, 33, 35)에 함유된 작용제의 MIC를 결정하도록 야기된다. 적어도 하나의 프로세서(210)는 이 실시형태에서, 또한, 이미지 데이터에 기초하여, 그리고 적어도 2개의 인접한 작용제 저장소(31, 33, 35)의 각 작용제 저장소(31, 33, 35)에 대해, 성장 종말점(71, 73, 75)에 기초하여 적어도 2개의 인접한 작용제 저장소(31, 33, 35)에 함유된 작용제 혼합물에서 작용제 저장소(31, 33, 35)에 함유된 작용제의 MIC를 결정하도록 야기된다. 적어도 하나의 프로세서는 MIC에 기초하여 FICi를 결정하도록 추가로 야기된다.
일 실시형태에서, 명령어는 적어도 하나의 프로세서(210)에 의해 실행될 때, 적어도 하나의 프로세서(210)로 하여금, 이미지 데이터에 기초하여, 그리고 적어도 2개의 인접한 작용제 저장소(31, 33, 35) 중 각 작용제 저장소(31, 33, 35)에 대해, 세포 배양 기질(55)과 관련하여 작용제 저장소(31, 33, 35)에 함유된 작용제의 확산 계수 및 저해 종말점(61, 63, 65)에 기초하여, 작용제 저장소(31, 33, 35)에 함유된 작용제의 MIC를 결정하도록 야기된다. 적어도 하나의 프로세서(210)는 이 실시형태에서, 또한, 이미지 데이터에 기초하여, 그리고 적어도 2개의 인접한 작용제 저장소(31, 33, 35)의 각 작용제 저장소(31, 33, 35)에 대해, 확산 계수 및 성장 종말점(71, 73, 75)에 기초하여 적어도 2개의 인접한 작용제 저장소(31, 33, 35)에 함유된 작용제 혼합물 중 작용제 저장소(31, 33, 35)에 함유된 작용제의 MIC를 결정하도록 야기된다.
일 실시형태에서, 명령어는 적어도 하나의 프로세서(210)에 의해 실행될 때, 적어도 하나의 프로세서(210)로 하여금, 세포 배양 기질(50)의 표면(51)에 세포 집단(55)을 배치한 후 소정의 시간 기간에 배양 용기(10) 내 세포 배양 기질(50)의 표면(55)을 카메라(260)를 제어하여 적어도 하나의 사진을 촬영하도록 한다.
제안된 기술은 또한 컴퓨터 프로그램(240)을 포함하는 컴퓨터 판독 가능 저장 매체(250)를 제공한다. 예로서, 소프트웨어 또는 컴퓨터 프로그램(240)은 컴퓨터 판독 매체(250), 특히 비휘발성 매체에 운반되거나 저장되는 컴퓨터 프로그램 제품으로서 실현될 수 있다. 컴퓨터 판독 가능 매체(250)는 읽기 전용 메모리(Read-Only Memory: ROM), 임의 접근 메모리(Random Access Memory: RAM), CD(Compact Disc), DVD(Digital Versatile Disc), 블루레이(Blu-ray) 디스크, USB(Universal Serial Bus) 메모리, 하드 디스크 드라이브(HDD) 저장 장치, 플래시 메모리, 자기 테이프 또는 임의의 다른 통상적인 메모리 장치를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는 하나 이상의 제거 가능 또는 비-제거 가능 메모리 장치를 포함할 수 있다. 따라서, 컴퓨터 프로그램(240)은 프로세서(210)가 실행하도록 하기 위해 컴퓨터의 작동 메모리(220)에 로딩될 수 있다.
실시예
실시예 1 - CombiANT ™
이 실시예에서는 강력하고 고도로 정량적인 항생제 상승작용을 테스트하기 위한 검정이 제시된다. 본 명세서에서 CombiANT™로 나타낸 검정은 이 실시예의 경우, 단일 한천 플레이트에서 3개의 항생제의 모든 쌍별 상호작용에 대한 정량적 정보를 제공하는 확산 기반 검정이다. 기술 검증 연구는 CombiANT™가 체커보드 방법론과 동등하게 잘 수행되었지만, 그의 고유 설계 및 기능으로 인해, 디스크 확산 테스트와 비슷한 훨씬 감소된 방법 복잡성을 제공했음을 보여주었다. 체커보드 검정과 마찬가지로, CombiANT™는 분할 저해 농도 지수(FICi)를 생성했지만, 처리량이 더 높고 다중화가 더 쉽다. 검정은 샘플의 감수성에 대한 사전 정보 없이 적용될 수 있다. 항생제 상호작용 선별을 위한 CombiANT™의 잠재력은 이 검정을 조합 요법의 새로운 분야, 즉, 요로 감염(UTI)의 치료에 적용함으로써 관찰되었다. 보존적 및 가변적인 항생제 상호작용은 개량된 조합 요법에서 개인 맞춤형 약제에 대한 높은 잠재력을 나타내는 것으로 식별되었다.
재료 및 방법
제작 및 설계
배양 용기 인서트는 컴퓨터 지원 설계 소프트웨어(Autodesk Fusion 360)를 이용하여 설계하고 오토클레이브 가능 또는 치과 레진용으로 독점권이 있는 포뮬레이션을 사용하여 3D 프린팅(Formlabs, 매사추세츠주 서머빌; SLA 3D 프린터)으로 제조하였다. 3D 프린팅은 웁살라 대학의 U-PRINT 시설에서 수행되었다.
균주 및 배지
기술 검증을 위해 기준 균주인 에세리키아 콜라이 K12-MG1655(DA5438), 슈도모나스 아에루기노사 PA14(DA64160) 및 스타필로코커스 아우레우스 ATCC29213(DA64485)을 사용했다. UTI 연구를 위해, 본 발명자들은 항생제 시프로플록사신(CIP), 포스포마이신(FOF), 메실리남(MEC), 나이트로푸란토인(NIT), 트라이메토프림(TMP), 암피실린(AMP), 젠타마이신(GEN) 및 세포탁심(CTX)에 감수성인 독립적 기원의 6 내지 295개의 임상 분리주를 선별했다. 세균은 Mueller Hinton 한천과 Mueller Hinton 액체배지(Becton Dickinson, 메릴랜드주 스파크스; 참조번호 275730, 225250)에서 37℃ 인큐베이션 하에 배양했다. 밤새 배양물은 1㎖ 중 단일 콜로니로부터 190 rpm 궤도 진탕 하에 제조하였다. UTI 분리주 선별을 위해, FOF 작용에 필요한 것으로서, 25 ㎎/ℓ의 글루코스-6-포스페이트를 한천에 보충했다. 항생제 스톡은 제조업체의 권장 사항에 따라 제조했으며 1회 분량으로 -20℃에서 보관했다: 물에 AMP 100 ㎎/㎖ 또는 180 ㎎/㎖(Sigma-Aldrich, 참조번호 A9518-25G), 0.1 M HCl에 CIP 25 ㎎/㎖(Sigma-Aldrich, 참조번호 17850-25G-F), 물에 CTX 3 ㎎/㎖ 또는 50 ㎎/㎖(Sigma, 참조번호 C7039-1G), 물에 GEN 45 ㎎/㎖ 또는 50 ㎎/㎖(Sigma, 참조번호 48760-5G-F), 물에 FOF 50 ㎎/㎖(Sigma-Aldrich, 참조번호 P5396-5G), 물에 MEC 10 ㎎/㎖(Sigma-Aldrich, 참조번호 33447-100MG), DMSO에 NIT 10 ㎎/㎖(Sigma, 참조번호 N7878-10G), 및 DMSO 중 TMP 10 ㎎/㎖(Sigma, 참조번호 T-7883-5G).
액체배지 미량희석
CombiANT™를 보정하기 위해 EUCAST 가이드라인에 따라 표준 액체배지 미량희석 방법을 사용하여 항생제에 대한 MIC 값을 개별적으로 결정했다. Mueller Hinton 액체배지에 있는 항생제의 2배 연속 희석액을 96웰 마이크로타이터 플레이트에서 준비했다. 그런 다음 플레이트에 조밀한 밤새 배양물(1:1000 희석, 180㎕ 최종 부피)로부터 약 3×105개 세포를 접종하고, 37℃에서 24시간 동안 진탕 없이 인큐베이션하고, 그 후 피펫팅으로 웰을 혼합하고 성장을 540㎚에서의 광학 밀도(Thermo Scientific, Multiscan FC 유형 357)로 측정했다. MIC는 접종되지 않은 대조군 웰의 성장 신호를 생성하는 가장 낮은 농도로 호칭되었다. 측정은 2개의 생물학적 반복물로 수행했으며 그 평균값을 MIC로 지정했다. FOF에 대한 MIC의 결정을 위해 배지에 FOF 매개 저해에 필요한 50 ㎎/ℓ의 글루코스-6-포스페이트를 보충했다.
투입 농도
CombiANT™ 검정의 기술적 보정을 위해, 항생제 농도는 사용된 균주에 대한 항생제의 MIC에 기초하여 결정했다(표 1). UTI 분리주의 선별에서, 두 세트의 항생제 농도가 모든 균주에 사용되었다(도 20c 내지 도 20j 분리주의 경우 표 2 및 도 20a 내지 도 20c 및 20m 분리주의 경우 표 3). MIC가 항생제에 대해 알려진 경우, 배양 용기 인서트 중 농도의 MIC 기반의 결정을 사용하는 것이 가장 판독가능한 결과를 초래하므로 바람직하다. FOF를 사용한 테스트의 경우, 글루코스-6-포스페이트는 25 ㎎/ℓ의 농도로 최종 한천 층에 제공되었다.
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체커보드 실험
FICi 결정을 위한 표준 체커보드 검정(8×8 농도)은 이전에 설명된 대로 단일 생물학적 반복물 및 4×MIC 내지 ¼ MIC 범위의 2배 연속 희석물을 이용하여 수행했다[6]. 접종물 크기는 5×105개 세포(0.5 McFarland)였고, 광학 밀도는 16시간의 정적 인큐베이션 후 540㎚(Thermo Scientific, Multiscan FC Type 357)에서 판독했다. Bliss 모델 상승작용 정량을 위해, 최대 1×MIC의 선형 농도 및 3개의 생물학적 반복물을 사용하여 고해상도 체커보드(9×9 농도)를 수득했다. 처리 위치는 가장자리 및 구배 효과로 인한 편향을 피하기 위해 완전히 무작위로 지정했다. 상승작용의 정도는 이전에 설명한 대로 계산했다[8]. 성장 수율은 배경 보정된 광학 밀도 값을 사용하여 미처리 웰에 상대적으로 표현했다. Bliss 독립 모델[9]에 따라 예상된 상대적 성장 Y1+2는 단일 항생제 처리에서 수득되는 상대적 성장 수율 Y1 및 Y2를 곱하여 계산했다. 조합의 상승작용 정도 S는 다음과 같이 정의되었다: S = Y1+2 - Y관측값. S = 0은 상가작용을 나타내고, 양수 값은 상승작용을 나타내며, 음수 값은 길항작용을 나타낸다.
물리 확산 모델 및 이미지 분석
FEM(Finite Elements Model)은 저장소에서 시약의 확산을 모델링하는 데 사용했다. 확산은 Fick의 확산 법칙을 따르는 것으로 가정하고 작용제의 농도는 이류 플럭스 및 순 부피 공급원의 부재 하에 대류-확산 방정식을 풀어서 계산했다. FEM 분석, 항생제 확산 모델링 및 보정, 뿐만 아니라 항생제 랜드스케이프 어셈블리는 COMSOL Multiphysics(Comsol, 스웨덴 스톡홀름)를 사용하여 수행했다. 알고리즘은 Matlab(Mathworks, 매사추세츠주 네이틱) 및 COMSOL-Matlab 브리지를 사용하여 각색했다. CombiANT™ 플레이트는 수직으로 장착된 CCD 디지털 카메라(Raspberry Pi v2 카메라 모듈)를 사용하여 사진촬영했다.
통계 분석
Graph Pad Prism 및 Matlab을 사용하여 통계 분석을 수행했다. 부가적 모델(FICi = 1)에 대한 측정된 FICi의 통계적 차이는 Wilcoxon 부호 순위 테스트를 사용하여 평가했다. UTI 선별에서 임상적으로 관련 있는 수준의 항생제 상호작용(FICi < 0.5, FICi > 4)을 보여주는 상호작용을 테스트했으며, 뿐만 아니라 FIC = 1에 대한 하나의 샘플의 Wilcoxon 부호 순위 테스트는 임상적 상승작용 또는 길항작용이 있는 것으로 보여지는 분리주에 대해 수행했다(표 4 및 5).
결과
CombiANT™ 검정 및 시스템 설계
CombiANT™ 분석은 다음 기준을 충족하도록 설계되었다: (i) 항생제 상호작용의 정량적 정보 생성; (ii) 검정 준비 및 분석을 위한 검정 복잡성 및 작업 시간 감소; (iii) 높은 다중화 능력; 및 (iv) 임상 미생물학 실험실 루틴에 용이한 통합. CombiANT™ 검정은 단일 한천 플레이트에서 3가지 항생제의 쌍별 상승작용에 대한 정량적 정보를 제공하는 확산 기반 검정이다. 검정은 임의의 표준 세포 배양 플레이트(도 2)에 통합될 수 있는 배양 용기 인서트(도 1)로 구성되었다. 동일한 세포 배양 플레이트에서 여러 배양 용기 인서트가 사용될 수 있다. 배양 용기 인서트는 항생제를 위한 3개의 저장소(도 1에서 'A', 'B' 및 'C'로 표시) 및 중심 삼각형 이미지화 영역을 포함했다(도 1).
CombiANT™ 상승작용 검정을 진행하기 위해, 0.5㎖의 항생제 함유 한천을 피펫팅하여 작용제 저장소에 로딩했다. 대부분의 적용예의 경우, 작용제 저장소에는 상이한 항생제가 로딩되었다. 한천 고형화 시, 검정은 비활성 상태가 되었다. 이 시점에서 배양 용기 인서트는 최소 1주일 동안 기능 손실 없이 냉장 보관될 수 있다. 이를 통해 상이한 항생제를 포괄하는 다수의 검정이 사용자의 필요에 따라 준비 및 보관될 수 있어 지체 없이 쉽게 구현될 수 있다.
특정 상승작용 테스트를 구현하기 위해 준비된 배양 용기 인서트는 배양 플레이트에 배치되고 배양 한천의 최종 층으로 오버캐스트되었고, 표준 90mm 플레이트에 대해 전형적으로 25㎖이다(도 2). 이 단계는 플레이트가 고형화된 즉시 사용 준비된 검정을 활성화시켰다(도 2). 최종 한천 층은 작용제 저장소에 현탁된 항생제가 주위 한천 영역 내 및 한천 표면으로 확산하기 시작하도록 했다. 샘플은 면봉으로 스트리킹하여 고형화된 플레이트에 적용했다. 검정은 디스크 확산 테스트 v8.0에 대한 EUCAST 가이드라인에 따라, 0.5 McFarland의 접종 밀도로 설계했다. 접종 후, 플레이트는 샘플이 성장하도록 밤새 인큐베이션하였다. 이 시점에서 CombiANT™ 플레이트는 표준 한천 플레이트와 동일했다. 이 특징을 통해, CombiANT™ 검정은 플레이트에서 세균 샘플을 밤샘 배양 및 인큐베이션하기 위한 임의의 실험실 운영 시스템에 원활하게 통합될 수 있다. 성장하는 동안 3가지 항생제의 확산-생성된 농도 랜드스케이프에 따라 배양 용기 인서트 주위에 저해 구역이 확립되었다(도 10). 항생제 상호작용의 측정을 위해 플레이트는 사진촬영했다. 결과는 정량적 상승작용 측정을 제공하는 전문적인 식견으로 엄선된 알고리즘으로 분석했다.
약물 상호작용의 정량적 측정
정량적 측정은 이미지 분석에 의해 수득했다. 배양 용기 인서트의 특정 기하학적 구조 및 한천 표면에 대한 그의 기하학적 관계는 항생제의 사전결정되고 제어된 확산을 달성했다. 제어된 확산은 개별적으로 각 항생제에 대한 유한 요소 방법으로 모델링되었다. 이 모델은 항생제 특정의 확산 지도를 산출했다. 이 확산 지도는 작용제 저장소에서의 항생제의 초기 농도 및 항생제의 확산 계수에 대한 플레이트 표면의 항생제 농도를 표현했다.
항생제는 이들의 구조 및 확산 매트릭스와의 상호작용에 따라 확산 특성이 다르다. 항생제의 확산 계수는 보정 단계에서 정확한 검정 조건(한천의 종류, 배양 부피, 인큐베이션 시간)마다 결정될 수 있다. 보정을 위해, MIC가 알려진 기준 균주는 3가지 농도의 표적 항생제(10x, 20x, 40x MIC)로 테스트했다. 보정은 모든 잠재적인 항생제에 대해 한 번만 수행하면 된다. 그 후, 특정 항생제를 테스트할 때마다 적용할 수 있도록 확산 지도를 저장했다. 확산 계수 외에도, 일회성 보정 결과로부터 항생제 저장소에 사용될 권장 초기 농도를 계산하였다. 본 연구에 사용되고 항미생물 감수성 테스트를 위해 EUCAST 가이드라인에 따른 8가지 항생제에 대한 권장 초기 농도는 표 1 내지 3에 제공된다.
분석 알고리즘은 보정된 확산 지도를 사용하여 가상의 한천 표면을 생성했다. 먼저, 사용자는 검정의 모든 작용제 저장소에 항생제를 배치했음을 나타내었다. 이 시점에서 알고리즘은 검정에 사용된 항생제에 해당하는 저장된 확산 지도를 소환했다. 이들을 검정-특이적 항생제 랜드스케이프에 조립했다. 그런 다음, 배양 용기 인서트의 기하학적 앵커 포인트에 따라 항생제 랜드스케이프를 사진에 지도화했다. 항생제 상호작용의 정도는 이하에 개략된 바와 같이 분할 저해 농도 지수(FICi)의 공식에 따라 저해 및 성장 구역의 가장자리에 있는 지점으로부터 정량했다.
CombiANT™ 한천 플레이트의 사진에서 관심 있는 특정 영역을 관찰할 수 있다(도 9 및 도 10). 배양 용기 인서트의 외측에서는 모든 항생제가 단독으로 작용하고 있었다. 항생제가 작용제 저장소로부터 바깥쪽으로 확산했기 때문에, 작용제 저장소에서 더 멀리 떨어진 작용제 저장소 반대편인 저해 구역의 지점은 단독으로 작용할 때의 해당 항생제의 저해 농도(IC)를 나타냈다. IC 지점(도 9에서 점으로 표시됨)은 항생제 랜드스케이프에 매칭되었고, 3가지 항생제의 상응하는 농도가 추출되었다(ICA, ICB 및 ICC).
이미징 영역 내부에서 3가지 항생제는 작용제 저장소로부터 확산되어 이제 3개의 모서리에서 쌍으로 중첩되었다. 이미징 영역의 모든 모서리는 2개의 가장 가까운 항생제가 함께 작용하는 플레이트의 부분을 구성했다. 따라서, 모서리에 가장 가까운 이미징 영역에서 성장 구역의 가장자리는 존재하는 두 항생제의 조합이 성장 저해성인 지점에 상응했다(도 10에서 점으로 표시됨). 유사하게, 3개의 IC 지점에 대해, 3개의 조합 저해성 지점(CP)이 항생제 랜드스케이프의 지점들에 매칭되었고, 존재하는 두 항생제의 농도가 추출되었다. 3개의 항생제 모두에 대해 개별 IC 및 CP를 모두 추출한 후, 분석 알고리즘은 모든 항생제 쌍에 대한 분할 저해 농도 지수(FICi)를 계산하도록 진행되었다. 항생제 A와 B 사이의 상호작용 시, FICiAB = CA/ICA + CB/ICB, 여기서 CA 및 CB는 상응하는 조합 저해 지점(CP)에서 A 및 B 각각의 농도이다. FICiAC 및 FICiBC도 유사하게 계산되었다. 1의 FICi 값은 상가작용을 나타낸다. FICi < 1은 상승작용을 나타냈고, FICi > 1은 길항작용을 나타냈다. 상승작용 및 길항작용의 임상적으로 관련 있는 수준에 대한 역치값은 일반적으로 각각 <0.5 및 >2-4로 설정된다. 사진에서 모든 IC 및 CP 지점의 식별은 자동 또는 수동으로 수행될 수 있다. 그 후, 분석은 3개의 항생제 쌍 모두에 대한 FICi 데이터를 즉시 산출했다(도 10의 플레이트 분석으로부터 도 11에 도시된 바와 같음).
검정 시스템의 기술 검증
먼저 대조군으로서 3개의 배양 용기 인서트 저장소에 동일한 항생제를 충전시킨 자기-상호작용 실험을 수행했다. 자기-상호작용 제어 실험은 이 실시예에 사용된 모든 항생제에 대해 1에 가까운 FICi를 확실하게 생성했다(도 17). 다음으로, CombiANT™ 검정이 유효한 상승작용 정량을 생성했는지 검증하기 위해, 본 발명자들은 정확도 및 정밀도 연구를 실행했다. 본 발명자들은 2개의 그람 음성 기준 균주인 이.콜라이 K12-MG1665 및 피.아에루기노사 PA14, 및 그람 양성의 에스. 아우레우스 기준 균주 ATCC29213에서 4가지 항생제 패널에 대한 모든 쌍별 항생제 상호작용을 테스트했다. 테스트된 항생제인 암피실린(AMP), 세포탁심(CTX), 시프로플록사신(CIP) 및 젠타마이신(GEN)은 3가지 별개의 작용 기전에 걸쳐 있으며, 이들 세균 종에 의해 유발되는 균혈증 및 패혈증 치료에 흔히 사용된다. FICi 지수는 모두 6가지 쌍별 상호작용 및 3가지 균주 모두에 대해 계산되었다(도 18a).
분석의 정밀도를 충분히 정량하기 위해, CombiANT™ 검정 프로토콜을 사용하여 다수의 반복물(n >10)로 균주를 선별했다. 반복물 중 절반은 동일한 날에 테스트되어 반복성(일내 변동성)을 정량했다. 나머지 절반은 다음 날에 테스트되어 재현성(일간 변동성)을 정량했다. 일간의 결과를 비교하기 위해, 본 발명자들은 동일한 항생제 조합의 상대적인 일간 차이를 정량한 다음, 모든 균주에 대해 6가지 조합 모두의 평균을 내기 위해 선택했다(도 18b). 평균 상대적 차이는 모든 균주에 대해 13% 미만이었고 가장 높은 사분위수는 40% 미만이었다. 이는 검정이 반복 가능하고 일간 변동에 무관함을 입증했다. 재현성을 정량하기 위해 모든 항생제 조합에 대해 같은 날의 반복물을 사용하여 평균의 상대 표준 오차를 측정했다. 그런 다음, 모든 균주에 대해 평균을 냈다. 모든 상대 표준 오차는 12% 미만이었고 가장 높은 사분위수는 15% 미만이었다. 이는 반복물 간에 매우 작은 기술적 변동을 보여주었다(도 18b). 마지막으로, 본 발명자들은 반복성 및 재현성을 모두 포괄하는 정밀도의 전반적인 평가를 수득하기 위해 모든 반복물을 함께 가져왔다. 본 발명자들은 상호작용의 평균값에 비례하여 측정의 변동성을 표현한 분석인 각 종-조합 쌍에 대한 변동 계수를 계산하기로 결정했다(도 18c). 모든 변동 계수는 37% 미만이고, 평균 19.7%였으며, 이는 방법이 복제 가능 및 반복 가능할 정도로 충분히 정확함을 의미한다.
다음으로, 본 발명자들은 CombiANT™의 정확도를 정량하기 위해 착수했다. 이를 위해, 본 발명자들은 이전에 기재된 바와 같이[6], 액체배지에서 체커보드 검정의 금본위제 방법론을 사용하여 항생제 상호작용의 모든 측정을 반복했다. 첫째, 본 발명자들은 두 방법이 체계적으로 상이한 결과를 생성하는지에 대해 테스트하기를 원했다. 따라서, 본 발명자들은 두 방법에 의해 수득된 FICi 데이터에 대해 Bland-Altman 분석을 수행했다(도 18d). Bland-Altman 비교는 체커보드 검정 및 CombiANT™ 검정 사이에 0.049의 편향을 산출했다. 이런 낮은 수준의 편향은 FICi 차이의 검출 한계에 가까웠다. 따라서, 본 발명자들은 두 방법으로부터 수득한 결과 사이에 통계적으로 검출 가능한 불일치가 없다는 결론을 내렸다.
체계적으로 2가지 방법이 호환 가능함을 보여주었으므로, 본 발명자들은 다변량 선형 회귀 분석을 사용하여 다른 방법보다 한 방법을 선택하는 효과를 테스트했다. 국소 항생제 쌍의 정체는 측정된 FICi 값에 강력하고 유의미한 영향을 미쳤다(상관 계수 = 0.55; P < 0.01). 한편, 방법의 선택은 실험 결과와 통계적으로 상관관계가 없었다(상관계수 = 0.07; P = 0.83). 종합적으로, 본 발명자들은 CombiANT™가 체커보드 검정만큼 항생제 상호작용을 검출하는 데 있어서 동일한 정확도를 가졌다는 결론을 내렸다.
체커보드 검정과 CombiANT™의 차이는 확산으로 인해, CombiANT™는 연속 농도 범위를 적용하는 반면, 체커보드는 전형적으로 별개의 2배 희석물을 테스트한다는 것이다. 따라서, 본 발명자들은 CombiANT™의 높은 정밀도가 더 미세한 농도 범위의 결과인지 여부를 테스트했다. 고해상도 선형 농도 범위 체커보드는 모두 18개 균주 조합 쌍에 대해 수득했고, 이에 대해 Bliss 독립 부가적 모델을 사용하여 항생제 상호작용을 정량했다. 본 발명자들은 다시 CombiANT™ 결과와 항생제 상호작용의 높은 일치를 관찰했다. 흥미롭게도, 상승작용 프로파일은 때로 MIC보다 낮은 용량에서 상이한 상승작용 프로파일을 갖는 용량 의존적 변동을 보였는데, 이는 상호작용의 분류를 더 어렵게 했다. 이러한 용량 의존적 변동은 사전결정된 높은 저해 수준에서 상호작용을 분류한 CombiANT™에 의해서는 검출되지 않았다. 본 발명자들은 CombiANT™의 정밀도가 선형 농도 범위에 의해서만 결정된 것이 아니라, 설정된 높은 저해 수준에서 상호작용의 정량에 의해서도 결정된다는 결론을 내렸다.
임상 UTI 이.콜라이 분리주에 대한 CombiANT™ 검정을 사용한 항생제 상호작용 패널
본 발명자들은 CombiANT™ 검정을 사용하여 이.콜라이 UTI 임상 분리주 및 이. 콜라이 K12-MG1655 기준 균주에 대한 항생제 상승작용을 선별했다. UTI에 대한 단일 또는 조합 치료로서 일반적으로 사용되는 5가지 항생제 패널을 선택했다: 나이트로푸란토인(NIT), 트라이메토프림(TMP), 메실리남(MEC), 시프로플록사신(CIP) 및 포스포마이신(FOF). 이. 콜라이 균주 및 이. 콜라이 K12-MG1655 기준 균주에 대한 항생제 패널의 모든 쌍별 상호작용을 측정하기 위해 CombiANT™ 검정을 구현했다(도 19). 대부분의 이. 콜라이 균주는 패널에 있는 모든 항생제에 감수성이 있는 것으로 표시되었다(도 20a 내지 20m). 임상적으로 관련 있는 수준의 양성 상승작용을 나타내는 것으로 표시된 상호작용에 대한 범주형 FICi 한계는 이전의 권장 사항에 따라 FICi <0.5로 설정되었다. 길항작용의 보존적 한계는 FICi >4로 설정되었다. 모든 중간 값은 상가작용임을 설명하는 것으로서 표시되었다.
테스트된 모든 균주에 걸쳐 상가작용인 NIT-CIP(도 20i), MEC-CIP(도 20d), TMP-CIP(도 20g), MEC-FOF(도 20e), TMP-FOF(도 20f), NIT-FOF(도 20h), GEN-CTX(도 20k), 및 GEN-CTX(도 20m)에 대해 나타낸 바와 같이, 그 거동이 변동적인 것으로 나타난 소수의 균주에 의해 대부분의 조합은 본질적으로 부가적인 것으로 나타났다, 표 4 및 5 참조. FOF-CIP(도 20j)는 분리주 DA44560에서 경계선이지만 통계적으로 유의미한 길항적 상호작용을 나타내었고, 하지만 다른 모든 균주에서는 부가적 거동을 나타냈다. 나머지 조합인 TMP-NIT(도 20b), MEC-TMP(도 20a), MEC-NIT(도 20c) 및 AMP-GEN(도 20k)에 대해서는 의학적으로 더 흥미로운 결과가 수득되었다. TMP-NIT(도 20b) 및 AMP-CTX(도 20l) 조합에 대한 양성 상승작용은 대부분의 UTI 분리주에서 검출되었고, 몇몇 분리주는 부가적 또는 길항적 거동을 표시했으며, 이는 UTI 분리주 중 다양한 유전자 변동과 함께 이들 항생제의 보존적인 상승적 상호작용 성질을 나타낸다. MEC-NIT 조합(도 20c)은 다른 한편으로 테스트된 대부분의 분리주에서 검출된 강력한 길항작용 거동을 나타냈다. MEC-TMP의 조합(도 20a)은 테스트된 모든 분리주에 대해 양성 상승작용, 강한 길항작용 및 상가작용의 혼합을 보여주었지만, AMP-GEN의 조합(도 20k)은 상가작용 및 다른 정도의 길항작용의 혼합을 보여주었다. 종합하면, 이들 데이터는 1종 내에서 사례별 상승작용 검증의 가치를 분명하게 나타냈다.
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논의
이 연구에서 본 발명자들은 항생제 상호작용의 효율적인 결정을 가능하게 하는 CombiANT™ 검정을 제시하고 특성화했다. 확대 기술 검증은 높은 정확도와 정밀도, 및 확립된 체커보드 방법과 전반적으로 동등한 성능을 보였다. 그런 다음, 본 발명자들은 임상 UTI 분리주의 큰 수집물 중에서 항생제 상승작용을 선별하기 위해 CombiANT™를 구현했다. 일관된 상승작용, 중립 및 길항적 상호작용은 균주간에 유의미한 변동이 있는 것으로 발견되었다.
CombiANT™ 프로토콜은 간단성 및 임상적 구현을 위해 특별히 설계되었다. 비활성 상태에서는 항생제 한천 플레이트의 정규 저장 수명에 따라 대량으로 냉장 보관될 수 있다. 이것은 병원 및 실험실에서 배양 용기 인서트에 관심 항생제를 사전에 로딩한 다음, 필요할 때 신속하게 구현할 수 있도록 한다. 활성화 단계부터 시작하여, CombiANT™ 플레이트의 취급은 정규 한천 플레이트의 취급과 동일하므로, 대규모 생산을 위한 한천의 자동 투입을 포함하여 한천 플레이트의 대량 취급을 위한 기존 임상 파이프라인과 호환된다.
임상 및 학술 연구실 모두에서 CombiANT™를 가장 쉽게 사용할 수 있도록 하기 위해, 본 발명자들은 2가지 다른 프로토콜, 즉, 임상용의 내성 중단점 기반의 프로토콜(표 2 및 표 3, 그리고 도 20a 내지 20m에서 UTI 선별에 적용된 것), 및 연구 적용예를 위한 고감도의 MIC 기반 프로토콜(도 18a 내지 18d에 적용된 바와 같은 표 1)을 설계했다. CombiANT™의 분석은 완전 자동화될 수 있으며, 입력값으로서 단지 디지털 사진만을 필요로 한다. 전용 기계의 불필요성은 CombiANT™를 자원이 적은 환경에도 적합하게 만든다.
CombiANT™의 중요한 설계 원칙은 항생제 상승작용이 임상적으로 관련 있는 높은 농도에서 정량된다는 것이었다. 상승작용은 FICi를 사용하여 조합 공간의 MIC-등가선을 의미하는 저해 구역의 가장자리에서 측정된다. 성장률을 기반으로 하는 방법과 같은 다른 방법은 낮은 저해 수준에서 상승작용을 측정한다. 이들 실험에서 상승작용은 부가적 모델(Bliss 독립 또는 Loewe 상가작용)과의 편차로 인해 중간 저해 범위에서 측정된다. 특정 항생제 조합의 상호작용 프로파일은 용량 의존적일 수 있어, 체커보드의 상승작용 정량을 때로 복잡하게 하는 것으로 나타났다. 이러한 생물학적으로 흥미로운 사례는 복잡한 생리학적 효과를 나타낸다. FICi에 의한 상승작용 측정은 더욱 임상적으로 관련 있는 설정된 높은 저해 수준(MIC)에서 수행되기 때문에 이러한 변동에 대해 강력하다(또는 인지하지 못하게 한다). 액체배지 미량희석 방법에 비해 플레이트 기반의 CombiANT™ 검정의 또 다른 기술적 차이는 세포 모양에 대한 항생제의 표현형 효과를 의미한다. 많은 항생제는 작용 기전의 일부로서 세포 모양의 변화를 유도한다. 예를 들어, 베타-락탐 항생제는 세포 사멸 전에 확대적 세포 신장을 유도한다. 이러한 신장은 광학 밀도 측정 시 생존 세포 수의 과대평가로 이어질 수 있으며, 예를 들어, 액체배지 및 한천 방법에 의해 소환된 MIC 값의 불일치로 이어질 수 있다.
기술적 데이터세트에서 수득된 결과는 문헌의 결과와 일치한다. CombiANT™는 이. 콜라이 K12-MG1655에서 이전에 보고된 AMP-GEN, TMP-MEC 및 TMP-NIT 간의 상승작용; MEC-NIT 간의 강한 길항작용 및 베타-락탐과 CIP 사이의 상가작용을 반복했다. 그러나, 부가적 조합인 GEN-CIP는 낮은 저해 성장률 방법론을 사용 시, 상승작용으로서 이전에 분류되었다. 피. 아에루기노사 PA14 균주 및 에스. 아우레우스 ATCC29213에서 몇몇 항생제 상호작용만이 이전에 특성화되어 비교를 제한했다. AMP-CIP 상가작용은 에스. 아우레우스에서 이전에 보고되었으며 CIP와 베타-락탐 및 아미노글리코사이드 GEN의 상호작용은 피. 아에루기노사에서 길항작용적인 것으로 알려져 있다. CombiANT™는 이러한 관찰을 반복했다. 결론적으로, 문헌과 본 발명자들의 측정의 관찰된 높은 일치는 CombiANT™의 정확성 및 유용성을 뒷받침한다.
임상 UTI 분리주의 상기 상승작용 선별이 반복됨으로써, 두 항생제를 조합하면 대부분의 균주를 따라 일관된 길항작용 효과가 있는 것으로 보이는 TMP-MEC 간의 상호작용과 같은 경우가 있다. 보드를 따라 길항작용적 거동을 갖는 이들과 같은 경우는 경험적으로라도 조합 요법을 설계할 때 명확한 가이드가 필요함을 보여준다. 피해야 하는 항생제의 이러한 조합을 식별하려면 대규모의 체계적인 상승작용 선별이 필요할 것이다. 항생제 상승작용을 정량하는 현행 방법으로는 이러한 규모의 체계적인 선별이 불가능하다. 그러나, CombiANT™는 여전히 정량가능한 결과를 얻을 수 있는 노동 비용이 적게 드는 새로운 방법을 제시한다. 상호작용 연구에 대한 본 발명자들의 새로운 접근 방식의 사용은 이러한 대규모 상승작용 선별을 달성할 수 있게 한다.
TMP-NIT, TMP-MEC, MEC-NIT, AMP-GEN, AMP-CTX 및 GEN-CTX 간의 상호작용에 대한 선별은 중요한 결과, 즉, 동일한 두 항생제가 동일한 종의 상이한 분리주를 따라 일관된 상승작용 프로파일을 갖지 않을 수 있음을 보여주었다. 항생제가 하나의 균주에 대해 상승작용적일 수 있지만, 다른 균주에 대해 부가적 또는 길항작용적일 수 있다면, 상승작용 선별은 미생물 연구실의 표준 테스트의 일부가 되어야 한다. 이러한 거동은 CombiANT™와 같은 검정의 필요성을 추가로 입증한다. 정량적이지만, 어렵거나 만성적인 경우에 대해서 유보되지 않을 정도로 충분히 간단하지만, 표준 선별의 일부이어야 하는 검정은 모든 경우를 미생물학 연구실에서 받아야 한다.
임상적 적용 가능성 외에도, CombiANT™은 생물학의 기초 연구를 위한 도구로서 높은 잠재력을 갖고 있다. 대부분의 항생제 상호작용에 대한 역학적 이해는 현재 부족하다. 연구 분야는 또한 항생제 상호작용 또는 다른 생리활성 화합물과 항생제 상호작용에 대한 진화론적 이해와 거리가 멀다. 이러한 지식의 격차는 현재 상승작용 측정 방법의 복잡성에 의해 부분적으로 설명될 수 있다. UTI 분리주의 선별에서 항생제 상호작용의 대부분은 부가적이었다. MEC-TMP 및 AMP-GEN에서 관찰된 다양한 상승작용 프로파일은 흥미로운 생물학적 균주간 변동을 나타냈다. 또한, MEC-NIT 간의 고도로 길항작용적 상호작용은 잠재적으로 이 약물 상호작용의 진화적 보존을 나타낼 수 있으며, 이는 세포의 기능적 모듈 간에 기능적 제약을 암시한다. 길항작용은 잠재적으로 성분 약물에 대한 세포 약물 및 스트레스 반응에서의 중첩에 의해 설명될 수 있다. 베타-락탐 및 NIT 둘 모두는 DNA 복구를 위한 세포 SOS 반응의 발현을 개별적으로 유도하는 것으로 나타났으며, 잠재적으로 조화를 이룬 보다 강력한 방어 반응을 통한 길항작용을 설명한다. 그러나, 항생제는 또한 베타-락탐에 대한 RpoS 매개 스트레스 반응, 및 NIT의 경우 산화 스트레스 반응과 같은 다른 반응 시스템도 유도한다. 따라서, 길항작용은 이러한 추가 반응의 잠재적 다면발현에 의해 대안적으로 설명될 수 있다. 요컨대, 다른 설명은 항생제 흡수 기전 감소 또는 해독 증가이다. 이러한 가설 및 다른 가설은 기능적 유전학 선별에서 CombiANT™를 구현함으로써 효율적으로 테스트될 수 있다.
실시예 2 - 보정 프로토콜
테스트된 모든 항생제에 대해 적절한 기준 균주가 선택된다. 이 실시예에서 모든 보정은 이. 콜라이 균주 K12-MG1665에 의해 수행되었다. 이하는 보정 프로토콜의 단계이다:
1. 기준 균주에 대한 항생제의 MIC는 이미 알려진 것이 아닌 한, 액체배지 미량희석 검정(BMD)을 사용하여 결정한다.
2. CombiANT™ 검정은 3반복으로 준비된다. 3개의 작용제 저장소에는 MH 한천에 10×MIC, 20×MIC 및 40×MIC 항생제 농도가 로딩된다.
3. CombiANT™ 검정 프로토콜에 따라 3개의 배양 용기 인서트에 최종 한천 층을 붓고 고형화시킨 후, 기준 균주의 집단을 프로토콜에 따라 접종한다.
4. 24시간 후, 도 9에 나타낸 바와 같이, 인서트의 외부에서 저해 구역이 형성된다.
배양 용기 인서트의 외부에서 농도 구역의 가장자리는 균주에 대해 사용 중인 항생제의 MIC에 상응한다. FEM 협력 모델의 확산 계수는 3개의 저해 구역 전부의 가장자리에서 예측된 농도가 BMD에 의해 결정된 실험 값과 일치할 때까지 반복적으로 조정된다. 확산 계수의 조정이 완료되면 조정 검정의 나머지 두 반복물에 대해 모델을 테스트한다. MIC 예측의 변동성이 나머지 두 검정 모두에 대한 실험 값의 10% 미만이면 보정이 완료된다. 확산 모델 보정 후, 그 항생제는 모든 실험 검정에 사용될 수 있다. 권장되는 초기 항생제 농도는 계산 아티팩트를 피하기 위해 5mm 초과의 저해 구역을 초래하는 농도로서 계산한다.
실시예 3 - CombiANT™ 검정을 위한 프로토콜
1. 사용 파이프라인 외부: CombiANT™ 배양 용기 인서트를 준비한다.
a. 멸균 페트리 접시에 CombiANT™ 배양 용기 인서트를 넣는다.
b. 투입 항생제 농도에 대해 표 1(MIC 기반 고해상도 측정) 또는 표 2 또는 3(중단점 기반 결정)을 참고한다.
c. 액체 오토클레이빙된 MH 한천(온도 50 내지 65℃) 내 투입 농도로 항생제를 희석한다.
d. CombiANT™ 배양 용기 인서트의 할당된 작용제 저장소에 항생제 한천 0.5㎖를 첨가한다.
e. 페트리 접시 뚜껑을 첨가하고 한천이 응고되도록 평평한 표면 상에 냉장한다. 4℃에서 로딩된 배양 용기 인서트는 적어도 1주일 동안 안정적이다.
2. 사용 전: MH 액체배지에서 단일 콜로니로부터 표적 균주의 조밀한 밤새 배양물을 성장시킨다.
3. 사용 중: MH 한천으로 오버캐스팅하여 CombiANT™ 배양 용기 인서트를 활성화한다. 표준 90mm 페트리 접시의 경우, MH 한천 25㎖를 첨가한다.
4. 한천을 실온에서 적어도 3시간 동안 응고시킨다.
5. 조밀한 세균 배양액을 0.5 McFarland로 희석한다.
6. 디스크 확산 테스트 v8.0에 대한 EUCAST 가이드라인에 따라, 멸균된 면봉을 사용하여 플레이트 표면에 세균을 접종하여 고른 성장을 수득한다.
7. 플레이트를 24시간 동안 인큐베이션한다.
8. 플레이트 사진을 찍고 CP 및 IC 지점을 식별한다.
9. 분석 알고리즘에 데이터를 입력한다.
실시예 4 - CombiANT™ 다른 생리활성 화합물
이 실시예에서 본 발명자들은 다른 생리활성 화합물을 갖는 CombiANT™ 검정의 유용성을 4가지 다른 세균 종에 대해 확장했다.
재료 및 방법
균주 및 배지
균주 에세리키아 콜라이 K12-MG1655(Eco), 슈도모나스 아에루기노사 PA14(Pae), 스타필로코커스 아우레우스 ATCC29213(Sau) 및 비브리오 나트리에겐스 ATCC14048(Vna)을 4가지 생리활성 화합물인 아스피린(ASP), 벤조산(BA), 이부프로펜(IBU) 및 티트리 오일(TTO)에 대해 사용했다. Mueller Hinton 한천 및 Mueller Hinton 액체배지(Becton Dickinson, 메릴랜드주 스파크스; 참조번호 275730, 225250)에서 세균을 37℃에서 밤새 인큐베이션하여 배양했다. 1㎖ 중 단일 콜로니로부터 190 rpm 궤도 진탕 하에 밤새 배양물을 제조하였다. 비브리오 나트리에겐스의 경우, 배양 배지에 204mM NaCl, 4.2mM KCl 및 23.14mM MgCl2를 포함하는 v2 염을 보충했다[10]. 생리활성 화합물 스톡은 제조업체의 권장 사항에 따라 제조했고, 1회 분량, 즉, 50% DMSO 중 아스피린 400 ㎎/㎖(Sigma-Aldrich, 참조번호 A2093-100G), DMSO 중 벤조산 400 ㎎/㎖(Sigma-Aldrich, 참조번호 242381-25G), 및 물 중 이부프로펜 664 ㎎/㎖(Sigma, 참조번호 I1892-100G)로 -20℃에서 보관했다. 티트리 오일은 필요할 때까지 제조사로부터 받은 100% 오일로서 실온에서 보관했다(Sigma-Aldrich, 참조번호 W390208-SAMPLE-K).
액체배지 미량희석
생리활성 화합물에 대한 MIC 값은 EUCAST 가이드라인과 일치하는 표준 액체배지 미량희석 방법론을 사용하여 개별적으로 결정했다. Eco, Pae 및 Sau 균주에 대한 Mueller Hinton 액체배지 중 각 생리활성 화합물의 2배 연속 희석액은 96웰 미세역가 플레이트에서 제조하였다. 그런 다음, 플레이트에 조밀한 밤새 배양물(1:1000 희석, 180㎕ 최종 부피)의 약 3×105개 세포를 접종하고, 밀봉하고 37℃에서 24시간 동안 진탕없이 인큐베이션했다. MIC는 접종되지 않은 대조군 웰의 가시적 성장 신호를 산출하는 최저 농도로 호칭되었다. 3개의 생물학적 반복물로 측정을 수행하고 그 평균을 MIC로 지정했다. Vna 균주의 MIC를 결정하기 위해 배지에 이 세균 종의 성장에 필요한 v2 염을 보충했다.
투입 농도
CombiANT™ 검정을 사용하여 자기-상호작용을 결정하기 위해, 사용된 4가지 균주에 대한 생리활성 화합물의 MIC에 기초하여 인서트 농도를 결정했다(표 6).
Figure pct00019
결과 및 논의
이 실시예는 CombiANT™가 항생제 외에 생리활성 화합물을 평가하는 데에도 사용될 수 있음을 증명했다(도 21). 이들 화합물은 한천 성장 배지 내에서 쉽게 확산된다. 화합물의 증가 농도가 인서트에 배치되어 저해 구역 크기의 차이가 관찰되었고, 이는 도 9 내지 도 10에 대해 이전에 논의한 대로 정량될 수 있다.
따라서, CombiANT™는 항생제 간의 약물 상호작용 연구에 국한되지 않는다. 원칙적으로, 임의의 생리활성 화합물의 개별 활성 및 조합 활성은 CombiANT™에 의해 연구될 수 있다. 따라서, CombiANT™는 예를 들어 인간 및 동물 세포와 같은 세포에 대한 화학요법 화합물의 효과를 연구하는 데 사용될 수 있으며, 또한 환경 미생물학의 적용예에도 사용될 수 있다. 적용예의 잠재적 다양성은 다른 배양 배지 및 다른 배양 조건(예컨대, 다른 온도에서 CombiANT™ 실행)으로 쉽게 구현될 수 있는 CombiANT™의 높은 유연성에 의해 뒷받침된다. CombiANT™는 또한 활성이 광학적으로, 예를 들어, 형광, 비색 등에 의해 추적될 수 있다면, 여러 유도인자 및 억제인자의 의존하에 생물학적 활성을 특성화하는 데 적용될 수 있다. 항생제 내성의 확산은 점점 더 조합 요법을 매력적으로 만들지만, 높은 병원균 다양성은 CombiANT™ 검정 결과를 기반으로 한 치료의 검증 및 최적화를 최적으로 필요로 하는 개인맞춤형 치료의 부가 가치를 나타낸다. CombiANT™는 (다른 분석 방법에 의해) 광범위하게 내성을 보이는 분리주에 대한 조합 치료 가능성의 식별을 용이하게 할 수 있다.
실시예 5 - CombiANT™ 혼합 세균 샘플
이 실시예에서 본 발명자들은 CombiANT™ 검정의 유용성을 확대하여 혼합 세균 샘플을 취급하고 2 성분 세균이 별개의 형광 마커에 의해 구별될 때 하나의 테스트 내에 2개의 다른 FICi 세트를 외삽했다.
재료 및 방법
균주 및 배지
균주 MP026 및 TB191은 둘 모두가 에세리키라 콜라이 K12-MG1655 균주의 파생물이다. MP026은 적색 형광 단백질(mCherry 유전자에 의해 암호화됨)을 발현하도록 유전자 조작되었다. 이 균주는 항생제 클로람페니콜에 감수성이다. MP026 균주는 마로스 플레스카(Maros Pleska) 박사(미국 록펠러 대학)의 친절한 선물이었다. TB191은 청록색 형광 단백질(세룰리안(cerulean) 유전자에 의해 암호화됨) 및 항생제 클로람페니콜에 대한 내성(cat 유전자에 의해 암호화됨)을 발현하도록 유전자 조작되었다. TB191은 토비아스 버그밀러(Tobias Bergmiller)(영국 엑서터 대학)의 친절한 선물이었다. Mueller Hinton 한천 및 Mueller Hinton 액체배지(Becton Dickinson, 메릴랜드주 스파크스; 참조번호 275730, 225250)에서 세균을 37℃에서 밤새 인큐베이션하여 배양했다. 1㎖ 중 단일 콜로니로부터 190 rpm 궤도 진탕 하에 밤새 배양물을 제조하였다. 항생제 스톡은 제조업체의 권장에 따라 제조했고, 1회 분량, 즉, DMSO 중 NIT 10 ㎎/㎖(Sigma, 참조번호 N7878-10G) 및 DMSO 중 TMP 10 ㎎/㎖(Sigma, 참조번호 T-7883-5G); 에탄올 중 CAM 12.5 ㎎/㎖(Sigma, 참조번호 C0378-5G)으로 -20℃에서 보관했다.
혼합물 테스트
MP026 및 TB191 균주 각각의 희석된 밤새 배양물은 실시예 1에서 이전에 기재된 바와 같이 CombiANT™ 검정에 적용하기 위한 접종물로서 사용하였다. MP026 및 TB191 균주의 1:1 비율의 혼합물을 밤새 배양물로부터 제조하였다. 밤새 배양물의 총 밀도는 2×108 cfu/㎖였다. 이어서, 이 혼합물을 실시예 1에서 이전에 기재된 바와 같이 CombiANT™ 검정에 적용하기 위한 접종물로서 사용하였다. 항생제 인서트 농도는 사용된 3가지 항생제에 대한 MP026 균주의 MIC에 기초하여 결정했다(표 7).
Figure pct00020
결과 및 논의
본 발명자들은 CombiANT™가 혼합 세균 샘플에 사용될 수 있음을 증명했다. 혼합물의 성분 세균이 형광(도 22) 또는 색상에 의해 구별될 수 있는 경우, 이들의 개별 FICi 값은 단일 CombiANT™ 검정에서 결정될 수 있다. 표 8은 MP026 및 TB191에 대한 FICi 값을 보여준다.
Figure pct00021
대부분의 세균 감염에서는 높은 병원균 다양성이 관찰되며, CombiANT™는 정제되지 않은 혼합 샘플에 적용될 수 있다. 균주 정제 단계의 생략은 치료에 사용하기에 효과적인 항생제 조합을 결정하기 위한 총 검정 시간을 단축시킨다. CombiANT™ 검정은 진단 및 개인맞춤형 치료를 공식화 및 검증하는 데 매우 가치가 있을 것으로 예상된다. CombiANT™이 형광 또는 색상 등에 의해 구별될 수 있는 샘플에 적용되는 경우, 동일 샘플에서 여러 세균의 다수의 FICi가 수득될 수 있다.
전술한 실시형태는 본 발명의 몇 가지 예시적인 예로서 이해되어야 한다. 본 기술분야의 기술자라면 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 실시형태에 다양한 수정, 조합 및 변경이 이루어질 수 있음을 이해할 것이다. 특히, 기술적으로 가능한 경우, 상이한 실시형태에 상이한 부분 해법이 다른 구성으로 조합될 수 있다.
참고문헌
Figure pct00022

Claims (25)

  1. 세포 집단에 대한 작용제 상호작용 효과(agent interaction effect)를 결정하는 방법으로서,
    (S1) N개의 작용제 저장소(31, 33, 35)를 서로에 대해 소정의 위치에 포함하는 배양 용기(10)에 세포 배양 기질(50)을 첨가하는 단계로서, 상기 N개 작용제 저장소(31, 33, 35)의 각 작용제 저장소(31, 33, 35)는 작용제를 포함하고, 상기 N개 작용제 저장소(31, 33, 35)는 조합 영역(41, 43, 45)을 에워싸며, N은 3 이상의 정수인, 상기 첨가하는 단계;
    (S2) 상기 세포 배양 기질(50) 상에 그리고/또는 내에 세포 집단(55)을 배치하고, 상기 세포 배양 기질(50)을 통해 상기 N개 작용제 저장소(31, 33, 35) 중의 작용제가 확산하여 상기 조합 영역(41, 43, 45) 내의 상기 세포 배양 기질(50)에 적어도 부분적으로 중첩되는 작용제 농도 구배 및 상기 N개 작용제 저장소(31, 33, 35)의 외부 경계 주변에 있는 상기 세포 배양 기질(50)에 실질적으로 중첩되지 않는 작용제 농도 구배를 형성하는 동안, 소정의 시간 기간 동안 상기 세포 배양 기질(50) 상에 그리고/또는 내에 상기 세포 집단(55)을 배양하는 단계;
    (S3) 상기 N개의 작용제 저장소(31, 33, 35) 중 적어도 2개의 인접한 작용제 저장소(31, 33, 35)의 각 작용제 저장소(31, 33, 35)에 대해, 상기 세포 집단(55)의 임의의 성장이 실질적으로 결여된 저해 구역(60, 62, 64)의 저해 종말점(61, 63, 65)을 결정하는 단계로서, 상기 저해 종말점(61, 63, 65)은 상기 작용제 저장소(31, 33, 35)의 외부 경계에 대해 주변에 위치하는, 상기 저해 종말점을 결정하는 단계;
    (S4) 상기 적어도 2개의 인접한 작용제 저장소(31, 33, 35)에 대해, 상기 적어도 2개의 인접한 작용제 저장소(31, 33, 35)에 함유된 작용제의 적어도 부분적으로 중첩되는 작용제 농도 구배를 갖는 조합 영역(41, 43, 45) 내에서 상기 세포 집단(55)의 성장을 포함하는 성장 구역(70, 72, 74)의 성장 종말점(71, 73, 75)을 결정하는 단계; 및
    (S5) 상기 저해 종말점(61, 63, 65) 및 상기 성장 종말점(71, 73, 75)에 기초하여 상기 적어도 2개의 인접한 작용제 저장소(31, 33, 35)에 함유된 작용제 사이의 작용제 상호작용 효과를 결정하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 세포 배양 기질(50)을 첨가하는 단계 (S1)은 상기 배양 용기(10)에 세포 배양 기질 겔을 첨가하고(S1) 상기 세포 배양 기질 겔이 상기 세포 배양 기질(50)로 고형화되도록 하는 것을 포함하는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    (S10) 상기 적어도 2개의 인접한 작용제 저장소(31, 33, 35)의 각 작용제 저장소(31, 33, 35)에 대해, 상기 저해 종말점(61, 63, 65)을 기초로 하여, 상기 세포 집단(55)에 관한 상기 작용제 저장소(31, 33, 35)에 함유된 상기 작용제의 최소 저해제 농도(MIC)를 결정하는 단계; 및
    (S11) 상기 적어도 2개의 인접한 작용제 저장소(31, 33, 35)의 각 작용제 저장소(31, 33, 35)에 대해, 상기 성장 종말점(71, 73, 75)을 기초로 하여, 상기 적어도 2개의 인접한 작용제 저장소(31, 33, 35)에 함유된 작용제의 혼합물에서 상기 작용제 저장소(31, 33, 35)에 함유된 상기 작용제의 MIC를 결정하는 단계
    를 더 포함하되, 상기 작용제 상효작용 효과를 결정하는 단계 (S5)는 상기 MIC에 기초하여 분할 저해 농도 지수(FICi)를 결정하는 단계 (S5)를 포함하는 것인, 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 MIC를 결정하는 단계 (S10)은 상기 적어도 2개의 인접한 작용제 저장소(31, 33, 35)의 각 작용제 저장소(31, 33, 35)에 대해, 상기 세포 배양 기질(50)과 관련하여 상기 작용제 저장소(31, 33, 35)에 함유된 작용제의 확산 계수 및 상기 저해 종말점(61, 63, 65)을 기초로 하여 상기 작용제 저장소(31, 33, 35)에 함유된 상기 작용제의 MIC를 결정하는 단계 (S10)를 포함하고; 그리고
    상기 혼합물 내 상기 MIC를 결정하는 단계 (S11)은 상기 적어도 2개의 인접한 작용제 저장소(31, 33, 35)의 각 작용제 저장소(31, 33, 35)에 대해, 상기 확산 계수 및 상기 성장 종말점(71, 73, 75)을 기초로 하여 상기 적어도 2개의 인접한 작용제 저장소(31, 33, 35)에 함유된 상기 작용제 혼합물에서 상기 작용제 저장소(31, 33, 35)에 함유된 작용제의 MIC를 결정하는 단계 (S11)을 포함하는, 방법.
  5. 제4항에 있어서, 하기 단계들에 의해, 작용제의 확산 계수를 결정하는 단계를 더 포함하는, 방법:
    상기 작용제를 각각 다른 농도로 포함하는 상기 N개 작용제 저장소(31, 33, 35)를 포함하는 상기 배양 용기(10)에 상기 세포 배양 기질 겔을 첨가하고 상기 세포 배양 기질 겔을 상기 세포 배양 기질(50)로 고형화시키는 단계;
    상기 세포 배양 기질(50) 상에 그리고/또는 내에 테스트 세포 집단(55)을 배치하고, 상기 세포 배양 기질(50)을 통해 상기 N개 작용제 저장소(31, 33, 35) 중의 작용제가 확산하는 동안 소정의 시간 기간 동안 상기 세포 배양 기질(50) 상에 그리고/또는 내에 상기 테스트 세포 집단(55)을 배양하는 단계로서, 상기 테스트 세포 집단(55)은 상기 작용제의 공지된 MIC를 갖는, 상기 테스트 세포 집단을 배양하는 단계;
    상기 N개 작용제 저장소(31, 33, 35)의 적어도 하나의 작용제 저장소(31, 33, 35)에 대해, 상기 테스트 세포 집단(55)의 임의의 성장이 실질적으로 결여된 저해 구역(60, 62, 64)의 저해 종말점(61, 63, 65)을 결정하는 단계로서, 상기 저해 종말점(61, 63, 65)은 상기 작용제 저장소(31, 33, 35)의 외부 경계에 대해 주변에 위치하는, 상기 저해 종말점을 결정하는 단계; 및
    상기 테스트 세포 집단(55)에 관한 상기 작용제의 MIC 및 상기 저해 종말점(61, 63, 65)을 기초로 하여 상기 세포 배양 기질(50)에 관한 상기 작용제의 확산 계수를 결정하는 단계.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, (S20) 상기 N개 작용제 저장소(31, 33, 35)의 각 작용제 저장소(31, 33, 35) 내로 겔과 혼합된 상기 작용제를 첨가하고, 상기 겔을 작용제 포함 플러그로 고형화시키는 단계를 더 포함하는, 방법.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 N개 작용제 저장소(31, 33, 35)의 각 작용제 저장소(31, 33, 35)는 동결건조 또는 건조된 형태의 작용제를 포함하고; 그리고
    상기 방법은 (S21) 상기 N개 작용제 저장소(31, 33, 35)의 각 작용제 저장소(31, 33, 35) 내로, 상기 작용제가 용해 또는 분산되어 있는 겔을 첨가하고, 상기 겔을 작용제 포함 플러그로 고형화시키는 단계를 더 포함하는, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 N개 작용제 저장소(31, 33, 35)는 원의 원주를 따라 서로에 대해 소정의 위치에 배열되고; 그리고
    상기 저해 종말점(61, 63, 65)은 상기 원 및 상기 작용제 저장소(31, 33, 35)의 중심(15)을 통과하는 축(80)을 따라, 그리고 상기 작용제 저장소(31, 33, 35)의 외부 경계 주변의 축(80)을 따르는 위치에 위치하는 것인, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, N이 3인, 방법.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서,
    상기 각 작용제 저장소(31, 33, 35)는 상기 원의 원주와 함께 정렬된 원주 벽(24) 사이 및 현 벽(21, 23, 25)에 의해 에워싸이고;
    상기 3개의 현 벽(21, 23, 25)은 삼각형(40), 바람직하게는 등변 삼각형(40)을 에워싸는, 방법.
  11. 배양 용기 인서트(20)로서,
    중심 N각형 개구부(40), 바람직하게는 중심 등변 N각형 개구부(40)를 갖는 원형 바닥 플레이트(22);
    상기 원형 바닥 플레이트(22)의 원주에 부착된 원형 벽(24); 및
    상기 원형 벽(24)과 상기 원형 바닥 플레이트(22)에 부착되고, 상기 중심 N각형 개구부(40)를 에워싸는 N개 현 벽(21, 23, 25)
    을 포함하되, 상기 원형 바닥 플레이트(22), 상기 원형 벽(24) 및 각 현 벽(21, 23, 25)은 작용제 저장소(31, 33, 35)를 획정하고, N은 3 이상의 정수인, 배양 용기 인서트.
  12. 제11항에 있어서, 상기 원형 바닥 플레이트(22)가 적어도 하나의 작용제 저장소(31, 33, 35) 내에 존재하는 적어도 하나의 식별자(32, 34, 36)를 포함하는, 배양 용기 인서트.
  13. 배양 용기(10)로서,
    바닥 디스크(12);
    상기 바닥 디스크(12)에 부착된 원주 벽(14); 및
    상기 배양 용기(10) 내에 위치하고 상기 바닥 디스크(12) 상에 위치한 원형 바닥 플레이트(22) 및 상기 원주 벽(14)으로부터 거리가 있는 원형 벽(24)을 갖는 제11항 또는 제12항에 따른 배양 용기 인서트(20)
    를 포함하는, 배양 용기.
  14. 배양 용기(110)로서,
    바닥 디스크(112);
    상기 바닥 디스크(112)에 부착된 원주 벽(114);
    상기 바닥 디스크(112)에 부착되고 상기 원주 벽(114)에 의해 에워싸이고 상기 원주 벽으로부터 거리가 있는 원형 벽(124); 및
    상기 원형 벽(124) 및 상기 바닥 디스크(112)에 부착되고 상기 바닥 디스크(112)의 N각형 부분(40), 바람직하게는 등변 N각형 부분(40)을 에워싸는 N개의 현 벽(121, 123, 125)
    을 포함하되, 상기 바닥 디스크(112), 상기 원형 벽(124) 및 각 현 벽(121, 123, 125)은 작용제 저장소(131, 133, 135)를 획정하고, N은 3 이상의 정수인, 배양 용기.
  15. 제14항에 있어서, 상기 바닥 디스크(112)가 적어도 하나의 작용제 저장소(131, 133, 135) 내에 존재하는 적어도 하나의 식별자를 포함하는, 배양 용기.
  16. 제11항 또는 제12항에 따른 배양 용기 인서트, 또는 제14항 또는 제15항에 따른 배양 용기에 있어서, N이 3인, 배양 용기 인서트 또는 배양 용기.
  17. 제11항, 제12항 또는 제16항 중 어느 한 항에 따른 배양 용기 인서트, 또는 제14항, 제15항, 또는 제16항 중 어느 한 항에 따른 배양 용기에 있어서, 상기 각 작용제 저장소(31, 33, 35; 131, 133, 135)가 겔 및 작용제의 고형화된 혼합물로 제조된 작용제 포함 플러그를 포함하고, 각 작용제 포함 플러그는 다른 작용제 포함 플러그의 작용제와 상이한 작용제를 포함하는, 배양 용기 인서트 또는 배양 용기.
  18. 제11항, 제12항 또는 제16항 중 어느 한 항에 따른 배양 용기 인서트 또는 제14항, 제15항 또는 제16항 중 어느 한 항에 따른 배양 용기에 있어서, 상기 각 작용제 저장소(31, 33, 35; 131, 133, 135)가 동결건조 또는 건조된 형태의 작용제를 포함하는, 배양 용기 인서트 또는 배양 용기.
  19. 세포 집단(55)에 대한 작용제 상호작용 효과를 결정하기 위한 키트로서,
    제13항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 배양 용기(10; 110);
    N개의 작용제 저장소(31, 33, 35; 131, 133, 135)의 각 작용제 저장소가 각각의 작용제를 포함하고, 상기 N개의 작용제 저장소(31, 33, 35)가 조합 영역(41, 43, 45)을 에워싸는, 제13항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 상기 배양 용기(10; 110)에 첨가되어 세포 배양 기질(50)로 고형화되도록 구성된 일정 부피의 세포 배양 기질 겔;
    상기 N개의 작용제 저장소(31, 33, 35) 내의 작용제가 상기 세포 배양 기질(50)을 통해 확산하여 상기 조합 영역(41, 43, 45) 내의 상기 세포 배양 기질(50)에서는 적어도 부분적으로 중첩되는 작용제 농도 구배 및 상기 N개의 작용제 저장소(31, 33, 35) 상의 외부 경계 주변에 있는 상기 세포 배양 기질(50)에서는 실질적으로 중첩되지 않는 작용제 농도 구배를 형성하는, 상기 세포 배양 기질(50) 상에 그리고/또는 내에 세포 집단(55)을 배치한 후부터 소정의 시간 기간 후에 상기 세포 배양 기질(50)의 적어도 하나의 사진을 촬영하도록 하는 명령어;
    상기 적어도 하나의 사진으로부터, 그리고 상기 N개의 작용제 저장소(31, 33, 35; 131, 133, 135)의 각 작용제 저장소(31, 33, 35; 131, 133, 135)에 대해, 상기 세포 집단(55)의 임의의 성장이 실질적으로 결여되는 저해 구역(60, 62, 64)의 저해 종말점(61, 63, 65)으로서, 상기 작용제 저장소(31, 33, 35; 131, 133, 135)에 대해 주변에 위치하는 상기 저해 종말점(61, 63, 65)을 결정하고, 상기 적어도 하나의 사진으로부터, 그리고 상기 N개의 작용제 저장소(31, 33, 35; 131, 133, 135)의 2개의 인접한 작용제 저장소(31, 33, 35; 131, 133, 135)의 각 조합에 대해, 상기 적어도 2개의 인접한 작용제 저장소(31, 33, 35; 131, 133, 135)에 함유된 상기 작용제의 적어도 부분적으로 중첩되는 작용제 농도 구배를 갖는 조합 영역(41, 43, 45) 내에서 상기 세포 집단(55)의 성장을 포함하는 성장 구역(70, 72, 74)의 성장 종말점(71, 73, 75)을 결정하게 하는 명령어;
    상기 세포 배양 기질(50)에 관하여 상기 N개 작용제 저장소(31, 33, 35; 131, 133, 135)에 함유된 상기 작용제에 대한 확산 계수를 정의하는 정보; 및
    2개의 인접한 작용제 저장소(31, 33, 35; 131, 133, 135)의 각 조합에 대해, 상기 2개의 인접한 작용제 저장소(31, 33, 35; 131, 133, 135)에 대해 결정된 상기 저해 종말점(61, 63, 65), 상기 2개의 인접한 작용제 저장소(31, 33, 35; 131, 133, 135)에 대해 결정된 상기 성장 종말점(71, 73, 75) 및 확산 계수를 정의하는 상기 정보에 기초하여, 상기 2개의 인접한 작용제 저장소(31, 33, 35; 131, 133, 135)에 함유된 상기 작용제 사이의 작용제 상호작용 효과를 결정하게 하는 명령어
    을 포함하는, 키트.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 N개의 작용제; 및
    상기 N개의 작용제와 혼합되고 상기 N개의 작용제 저장소에서 각각의 작용제 포함 플러그로 고형화되는 겔
    을 더 포함하는, 키트.
  21. 명령어를 포함하는 컴퓨터 프로그램(240)으로서, 상기 명령어는, 적어도 하나의 프로세서(210)에 의해 실행될 때, 상기 적어도 하나의 프로세서(210)로 하여금,
    세포 배양 기질(50) 상에 그리고/또는 내에 세포 집단(55)을 배치한 후 소정의 시간 기간에서 배양 용기(10) 중의 세포 배양 기질(50)을 촬영한 적어도 하나의 사진을 나타내는 이미지 데이터를 제공하게 하되, 상기 배양 용기(10)는 서로에 대해 소정의 위치에 N개의 작용제 저장소(31, 33, 35)를 포함하고, 상기 N개의 작용제 저장소(31, 33, 35)의 각 작용제 저장소(31, 33, 35)는 작용제를 포함하며, 상기 N개의 작용제 저장소(31, 33, 35)는 조합 영역(41, 43, 45)을 에워싸고, N은 3 이상의 정수이며, 상기 N개의 작용제 저장소(31, 33, 35) 내의 상기 작용제는 상기 세포 배양 기질(50)을 통해 확산하여 상기 조합 영역(41, 43, 45) 내의 상기 세포 배양 기질에 적어도 부분적으로 중첩되는 작용제 농도 구배 및 상기 N개의 작용제 저장소(31, 33, 35) 상의 외부 경계 주변에 있는 상기 세포 배양 기질(50)에 실질적으로 중첩되지 않는 작용제 농도 구배를 형성하며;
    상기 이미지 데이터에 기초하여, 그리고 상기 N개의 작용제 저장소(31, 33, 35)의 적어도 2개의 인접한 작용제 저장소(31, 33, 35)의 각 작용제 저장소(31, 33, 35)에 대해, 상기 세포 집단(55)의 임의의 성장이 실질적으로 결여되는 저해 구역(60, 62, 64)의 저해 종말점(61, 63, 65)으로서, 상기 작용제 저장소(31, 33, 35)의 외부 경계 주변에 위치하는 상기 저해 종말점(61, 63, 65)을 결정하게 하고;
    상기 이미지 데이터에 기초하여, 그리고 상기 적어도 2개의 인접한 작용제 저장소(31, 33, 35)에 대해, 상기 적어도 2개의 인접한 작용제 저장소(31, 33, 35)에 함유된 상기 작용제의 적어도 부분적으로 중첩되는 작용제 농도 구배를 갖는 조합 영역(41, 43, 45) 내에서 상기 세포 집단(55)의 성장을 포함하는 성장 구역(70, 72, 74)의 성장 종말점(71, 73, 75)을 결정하게 하며; 그리고
    상기 저해 종말점(61, 63, 65) 및 상기 성장 종말점(71, 73, 75)에 기초하여, 상기 적어도 2개의 인접한 작용제 저장소(31, 33, 35)에 함유된 상기 작용제 사이의 작용제 상호작용 효과를 결정하게 하는, 컴퓨터 프로그램.
  22. 제21항에 있어서, 적어도 하나의 프로세서(210)에 의해 실행될 때, 상기 명령어는, 상기 적어도 하나의 프로세서(210)로 하여금,
    상기 이미지 데이터에 기초하여, 그리고 상기 적어도 2개의 인접한 작용제 저장소(31, 33, 35)의 각 작용제 저장소(31, 33, 35)에 대해, 상기 저해 종말점(61, 63, 65)에 기초한 상기 세포 집단(55)에 관한 상기 작용제 저장소(31, 33, 35)에 함유된 상기 작용제의 최소 저해제 농도(MIC)를 결정하게 하고;
    상기 이미지 데이터에 기초하여, 그리고 상기 적어도 2개의 인접한 작용제 저장소(31, 33, 35)의 각 작용제 저장소(31, 33, 35)에 대해, 상기 성장 종말점(71, 73, 75)에 기초한 상기 적어도 2개의 인접한 작용제 저장소(31, 33, 35)에 함유된 상기 작용제의 혼합물에서 상기 작용제 저장소(31, 33, 35)에 함유된 상기 작용제의 MIC를 결정하게 하고; 그리고
    상기 MIC에 기초하여 분할 저해 농도 지수(FICi)를 결정하게 하는, 컴퓨터 프로그램.
  23. 제22항에 있어서, 상기 명령어는, 상기 적어도 하나의 프로세서(210)에 의해 실행될 때, 상기 적어도 하나의 프로세서(210)로 하여금,
    상기 이미지 데이터에 기초하여, 그리고 상기 적어도 2개의 인접한 작용제 저장소(31, 33, 35)의 각 작용제 저장소(31, 33, 35)에 대해, 상기 세포 배양 기질(55)과 관련하여 상기 작용제 저장소(31, 33, 35)에 함유된 상기 작용제의 확산 계수 및 상기 저해 종말점(61, 63, 65)에 기초하여 상기 작용제 저장소(31, 33, 35)에 함유된 상기 작용제의 MIC를 결정하게 하고; 그리고
    상기 이미지 데이터에 기초하여, 그리고 상기 적어도 2개의 인접한 작용제 저장소(31, 33, 35)의 각 작용제 저장소(31, 33, 35)에 대해, 상기 확산 계수 및 상기 성장 종말점(71, 73, 75)에 기초하여 상기 적어도 2개의 인접한 작용제 저장소(31, 33, 35)에 함유된 상기 작용제의 혼합물에서 상기 작용제 저장소(31, 33, 35)에 함유된 상기 작용제의 MIC를 결정하게 하는, 컴퓨터 프로그램.
  24. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 명령어는, 적어도 하나의 프로세서(210)에 의해 실행될 때, 상기 적어도 하나의 프로세서(210)로 하여금, 카메라(260)를 제어하여, 상기 세포 배양 기질(50)의 표면(51) 상에 상기 세포 집단(55)을 배치한 후 소정의 시간 기간에서 배양 용기(10)에 함유된 상기 세포 배양 기질(50)의 표면(55)을 촬영하여 적어도 하나의 사진을 갖게 하는, 컴퓨터 프로그램.
  25. 제21항 내지 제24항 중 어느 한 항에 따른 컴퓨터 프로그램을 포함하는 컴퓨터-판독 가능 저장 매체(250).
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