ES2625632T3 - Método para la determinación rápida de la susceptibilidad o de la resistencia de las bacterias a los antibióticos - Google Patents

Abstract

Un método para evaluar de forma rápida la susceptibilidad de una cepa de bacterias aislada a un antibiótico que inhibe la síntesis de la pared celular que comprende: a) la preparación de un cultivo bacteriano a partir de una cepa de bacterias aislada; b) la combinación de una o más dosis de un antibiótico que inhibe la pared celular con diferentes partes del cultivo bacteriano, en el que la concentración de cada una de la una o más dosis se correlaciona con umbrales de resistencia a antibióticos para la cepa de bacterias aislada al antibiótico que inhibe la síntesis de la pared celular; c) la incubación del cultivo bacteriano y de la una o más dosis de antibiótico; d) la evaluación de la longitud celular o del tamaño celular de las bacterias incubadas para cada una de la una o más dosis de antibiótico que inhibe la síntesis de la pared celular; y e) la clasificación de la susceptibilidad de la cepa de bacterias aislada al antibiótico que inhibe la síntesis de la pared celular basándose en las longitudes celulares o en los tamaños celulares de las bacterias asociadas con cada dosis de las una o más dosis de antibiótico que inhibe la síntesis de la pared celular, en el que una de las dosis comprende una concentración mínima del antibiótico que inhibe la síntesis de la pared celular, determinada empíricamente, que tiene como resultado el agrandamiento celular o un aumento del tamaño celular en cepas de las bacterias que son susceptibles al antibiótico que inhibe la síntesis de la pared celular, y en el que dicha concentración mínima de antibiótico que inhibe la síntesis de la pared celular es más baja que la concentración mínima inhibitoria (CMI) de la cepa de bacterias al antibiótico que inhibe la síntesis de la pared celular para indicar susceptibilidad.

Description

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DESCRIPCION

Metodo para la determinacion rapida de la susceptibilidad o de la resistencia de las bacterias a los antibioticos Campo de la invencion

La presente invencion se refiere, en general, al campo de la biotecnologfa y, mas en particular, a la microbiologfa que concierne a la salud del ser humano, la salud veterinaria y la salud medioambiental. Ciertos modos de realizacion descritos en el presente documento se refieren a metodos para la determinacion rapida de la susceptibilidad o de la resistencia de las bacterias cultivadas a los antibioticos.

Antecedentes de la invencion

El Centro Europeo para el Control de las enfermedades (ECDC, European Center for Disease Control, por sus siglas en ingles) registra cada ano 25.000 fallecimientos debidos a patogenos multirresistentes, es decir, patogenos que resisten a varios antibioticos. Los tratamientos con antibioticos bien seleccionados y tempranos tal vez puedan evitar parte de estas muertes. Dada la alta prevalencia de resistencias, los procedimientos actuales requieren un cultivo bacteriano para identificar el microorganismo, seguido de un antibiograma, lo que habitualmente requiere entre 2 y 3 dfas para que se produzca el crecimiento bacteriano. Para construir un antibiograma, solo la etapa del cultivo bacteriano requiere, por lo general, aproximadamente un dfa de incubacion, o un mmimo de aproximadamente 18 horas. Por consiguiente, existe la necesidad de determinar rapidamente un tratamiento con antibioticos para poder administrar enseguida un tratamiento eficaz.

Tras el cultivo, segun las metodologfas convencionales, se evalua la resistencia de las bacterias a los antibioticos por comparacion con una concentracion minima inhibitoria (CMI). La concentracion minima inhibitoria (CMI) se considera generalmente la dosis minima del antibiotico que inhibe significativamente el crecimiento bacteriano segun se determina a traves de tecnicas convencionales de microdilucion o prueba E. Ciertas organizaciones internacionales como el Instituto para la Normalizacion Clmica y del Laboratorio (CLSI por sus siglas en ingles) establecen las concentraciones de cada antibiotico espedfico que se debenan utilizar como referencia de susceptibilidad, resistencia intermedia y resistencia para cada bacteria en concreto. Por ejemplo, una cepa de Acinetobacter baumannii se considera susceptible a imipenem cuando su CMI es < 4 pg/ml, intermedia cuando la CMI esta comprendida entre 4 pg/ml y 8 pg/ml, y resistente cuando la CMI es > 16 pg/ml.

Suscita una gran preocupacion en todo el mundo el progresivo aumento de enfermedades infecciosas criticas nosocomiales (adquiridas en el hospital), a menudo en pacientes inmunocomprometidos y, frecuentemente, de la Unidad de Cuidados Intensivos (UCI). Por varias razones, dichas infecciones pueden estar asociadas con una tasa de mortalidad alta. Los patogenos pueden infectar a un paciente a traves de medios intrusivos, pero necesariamente medicos, como por ejemplo las vfas respiratorias durante la ventilacion mecanica, el tracto urinario o los vasos sangumeos a traves de cateteres o incluso a traves de heridas cutaneas como puedan ser las incisiones necesarias en una serie de procedimientos medicos. Muchos patogenos asociados con estos problemas pertenecen a la familia de bacilos gram-negativos. Por ejemplo, frecuentemente Acinetobacter baumannii, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa y algunas enterobacterias son resistentes a diversos antibioticos. Dado el penodo de tiempo relativamente largo necesario para realizar un antibiograma normal, por lo general, se administran los antibioticos de manera empmca. Este tratamiento puede resultar ineficaz en el 20-40 % de los casos y un cambio de antibioticos mas adelante puede que tenga una menor probabilidad de exito. En estos escenarios de urgencia ante un mayor riesgo de muerte o de complicaciones graves, es de gran interes contar con un sistema rapido para determinar un tratamiento con antibioticos. Por lo tanto, existe la necesidad de determinar de forma rapida la susceptibilidad bacteriana a los antibioticos con lo que tal vez se salvanan vidas y se reducinan los costes en sanidad.

La primera lmea de defensa para combatir enfermedades infecciosas suele depender de la administracion de antibioticos conocidos por su eficacia basandose en la probabilidad del patogeno implicado. Sin embargo, el uso incorrecto o el abuso de un antibiotico pueden abocar en cepas de bacterias cada vez mas resistentes. Para evitar un uso incorrecto, los facultativos pueden tratar de aislar las bacterias desde muestras de sangre o muestras de otro fluido para realizar pruebas in vitro, tales como un antibiograma, simultaneamente con los antibioticos iniciales.

Un antibiograma es el resultado de un ensayo clmico de una cepa de bacterias aislada in vitro para determinar su susceptibilidad a antibioticos. Una metodologfa habitual para construir un antibiograma basado en la difusion es el metodo de Kirby-Bauer (Bauer A W, Kirby WMM, Sherris JC, Turck M. Antibiotic susceptibility testing by a standardized single disc method. Am J Clin Pathol 1966; 45:493-496). En el metodo de Kirby-Bauer semi- cuantitativo, se colocan varios discos que contienen diferentes antibioticos en diferentes zonas de un cultivo bacteriano rico en nutrientes. Como el antibiotico se difunde en el agar hacia fuera del disco, el diametro alrededor del disco en el que no crecen las bacterias es indicativo de la concentracion minima inhibitoria (CMI) de ese antibiotico a la cepa de bacterias cultivada. Un metodo cuantitativo puede basarse en una serie de viales que tienen concentraciones del antibiotico en cuestion progresivamente mas bajas. El vial con la concentracion de antibiotico

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mas baja en la que la bacteria no puede crecer proporciona la concentracion minima inhibitoria de ese antibiotico para la cepa de bacterias ensayada.

Los metodos de difusion y dilucion se basan cada uno de ellos fundamentalmente en la inhibicion de la proliferacion de bacterias en un medio rico en nutrientes y requieren un penodo de tiempo suficiente para que tengan lugar muchos ciclos de reproduccion de las bacterias. Siendo asf, ambas metodologfas pueden requerir un mmimo de 18 horas a 24 horas.

Las anteriores tentativas para mejorar la velocidad de evaluacion de la susceptibilidad bacteriana a antibioticos no han conseguido proporcionar una significativa reduccion del penodo de tiempo requerido para satisfacer las necesidades antes descritas. El documento WO/1992/019763 describe un metodo anterior en el que se incorpora un compuesto fluorogenico que contiene nutriente que tiene un indicador fluorescente. Un microorganismo que continua creciendo en presencia de un antibiotico metaboliza el compuesto liberando el indicador fluorescente, mientras que los procesos metabolicos de cepas susceptibles liberan menos indicadores fluorescentes. Esta metodologfa sigue requiriendo un penodo de incubacion suficiente que permita la liberacion de un numero suficiente de indicadores fluorescentes y es posible que se tarde en torno a ocho horas para obtener resultados.

Las metodologfas que se han descrito se basan en la evaluacion del crecimiento microbiano. Los resultados de los ensayos se pueden acelerar aplicando un enfoque de microscopfa de lapso de tiempo o microscopfa en tiempo real. Se puede emplear un software para facilitar la interpretacion de estos resultados. Sistemas comercializados como MicroScan WalkAway, Vitek y Wider pueden ser capaces de determinar la susceptibilidad o resistencia a antibioticos de microorganismos concretos en alrededor de 6-9 horas.

Otro enfoque para evaluar la respuesta de una cepa bacteriana a un antibiotico consiste en la evaluacion secuencial del aumento de secuencias de ADN bacteriano espedficas, que esta directamente relacionado con el numero de bacterias, utilizando un ensayo de reaccion en cadena de la polimerasa cuantitativa (q-PCR). Se pueden obtener resultados de la posible influencia en el crecimiento bacteriano de los antibioticos al cabo de 6 horas de cultivo (Rolain JM, Mallet MN, Fournier PE, Raoult D. Real-time PCR for universal antibiotic susceptibility testing. J Antimicrob Chemother 2004; 54: 538-541).

Otro enfoque experimental puede caracterizarse por un sistema de electroforesis que detecta cambios en la electrofisioiogfa de las celulas tras la administracion de los antibioticos (Hoettges KF, Dale JW, Hughes MP. Rapid determination of antibiotic resistance in E. coli using dielectrophoresis. Phys Med Biol 2007; 52: 6001-6009). Otra posibilidad consiste en medir el calor desprendido por el cultivo bacteriano utilizando sistemas de microcalorimetna (Baldoni D, Hermann H, Frei R, Trampuz A, Steinhuber A. Performance of microcalorimetry for early detection of methicillin resistance in clinical isolates of Staphylococcus aureus. J Clin Microbiol 2009; 47: 774-776).

En el caso de antibioticos que actuan al nivel de pared celular, tales como las p-lactamas, en la patente europea EP0135023, se describen sustratos espedficos para detectar la actividad de protemas o enzimas citoplasmicas liberadas al medio cuando el antibiotico era efectivo. Otra posibilidad es la evaluacion de fragmentos de ADN liberados al medio (Santiso R, Tamayo M, Gosalvez J, Bou G, Fernandez MC, Fernandez JL. A rapid in situ procedure for determination of bacterial susceptibility or resistance to antibiotics that inhibit peptidoglycan biosynthesis. BMC Microbiol 2011; 11:19). Se encierran las bacterias en un microgel de agarosa sobre un portaobjetos y se incuban con una solucion de lisis que solamente afecta a las celulas cuya pared celular ha sido afectada y/o debilitada por el antibiotico. Unicamente estas bacterias liberan el nucleoide, que se visualiza por microscopfa fluorescente tras la tincion de ADN con fluorocromo de alta sensibilidad. La solucion de lisis no afecta a las bacterias resistentes al antibiotico, que no liberan el nucleoide y mantienen pues su forma normal. Se puede adaptar este procedimiento tambien para determinar la susceptibilidad o resistencia a antibioticos que inducen la fragmentacion del ADN bacteriano, como las quinolonas. Para este fin, la solucion de lisis debe estar mas concentrada, de manera que todas las bacterias liberen los nucleoides de manera detectable. Las bacterias susceptibles a la quinolona presentan ADN fragmentado, es decir, fragmentos de ADN difundidos, en cambio las que son resistentes revelan nucleoides intactos (Santiso R, Tamayo M, Fernandez JL, Fernandez MC, Molina F, Gosalvez J, Bou G. Rapid and simple determination of ciprofloxacin resistance in clinical strains of Escherichia coli. J Clin Microbiol 2009; 47: 2593-2595). Sin embargo, esta metodologfa puede tener como resultado ocasionalmente la identificacion de una cepa susceptible falso positivo, lo que puede suponer en consecuencia tratamientos con antibioticos ineficaces. Por ejemplo, ciertas cepas de P. aeruginosa encuadradas en la categona de intermedios o resistentes a carbapenemos, siguiendo los criterios del CLSI, pueden liberar el nucleoide por la afectacion de pared celular, de manera que pueden identificarse erroneamente como susceptibles.

Por otra parte, HAJIME HASHIMOTO et al ("Rapid Bacterial Testing Measurement with Method Laser L by Size Distribution Light Scattering", Transactions of the Institute of Electronics and Communication Engineers of Japan. Seccion E, vol. 68, 5 de mayo 1985 (1985-05-05), paginas 304-308), describen el efecto de un antibiotico que inhibe la smtesis de la pared celular (cloranfenicol, ampicilina) en la distribucion del tamano de celulas bacterianas (E.coli y

S. marcescens) en presencia de dicho antibiotico y describen como la distribucion del tamano se correlaciona con la prueba de CMI llevada a cabo con un metodo de tubo convencional.

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HAJIME HASHIMOTO et al: "Measurement of bacterial size distribution using laser light scattering", XP002715843 Compendex, No. de acceso a la base de datos EIX85080112894; y HAJIME HASHIMOTO et al: "Measurement of bacterial size distribution using laser light scattering.", Japanese Journal of Medical Electronics and Biological Engineering 1984 abr JAPAN SOC OF MEDICAL ELECTRONICS & BIOLOGICAL ENGINEERING, vol. 22, abril 1984 (1984-04), paginas 782-783, describen el concepto de medicion de la sensibilidad de bacterias a antibiotico que inhibe la smtesis de la pared celular, midiendo las variaciones del tamano celular tras la exposicion de las bacterias a dicho antibiotico.

Ninguno de estos enfoques experimentales ha conseguido proporcionar una medida rapida y precisa de la susceptibilidad bacteriana a antibioticos y en este campo se sigue dependiendo de los metodos de dilucion y difusion para construir un antibiograma.

Sumario de la invencion

La presente invencion queda definida con las reivindicaciones adjuntas. Por tanto, la invencion se refiere a:

1. Un metodo para evaluar de forma rapida la susceptibilidad de una cepa de bacterias aislada a un antibiotico que inhibe la smtesis de la pared celular que comprende:

a) la preparacion de un cultivo bacteriano a partir de una cepa de bacterias aislada;

b) la combinacion de una o mas dosis de un antibiotico que inhibe la pared celular con diferentes partes del cultivo bacteriano, en la que la concentracion de cada una de la una o mas dosis se correlaciona con umbrales de resistencia a antibiotico para la cepa de bacterias aislada al antibiotico que inhibe la smtesis de la pared celular;

c) la incubacion del cultivo bacteriano y de la una o mas dosis de antibiotico;

d) la evaluacion de la longitud celular o del tamano celular de las bacterias incubadas para cada una de la una o mas dosis de antibiotico que inhibe la smtesis de la pared celular; y

e) la clasificacion de la susceptibilidad de la cepa de bacterias aislada al antibiotico que inhibe la smtesis de la pared celular, basandose en las longitudes celulares o en los tamanos celulares de las bacterias asociadas con cada dosis de las una o mas dosis de antibiotico que inhibe la smtesis de pared celular,

en el que una de las dosis comprende una concentracion minima de antibiotico que inhibe la smtesis de la pared celular determinada empmcamente que tiene como resultado el agrandamiento de la celula o un aumento del tamano celular en cepas de las bacterias que son susceptibles al antibiotico que inhibe la smtesis de la pared celular, y en el que dicha concentracion minima de antibiotico que inhibe la smtesis de la pared celular es mas baja que la concentracion minima inhibitoria (CMI) de la cepa de bacterias al antibiotico que inhibe la smtesis de la pared celular para indicar susceptibilidad.

2. El metodo segun se reivindica en la reivindicacion 1, en el que la etapa de preparacion de un cultivo bacteriano a partir de una cepa de bacterias aislada comprende ademas preparar un cultivo bacteriano de crecimiento exponencial.

3. El metodo segun se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la concentracion de cada una de las una o mas dosis del antibiotico que inhibe la pared celular se correlaciona con los valores lfmite de las clasificaciones susceptible-intermedio-resistente.

4. El metodo segun se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las concentraciones para cada una de las una o mas dosis se correlacionan, segun una determinacion de la respuesta a dosis de la presencia o no de agrandamiento celular o aumento del tamano celular de multiples cepas de una bacteria, en el que las multiples cepas presentan un intervalo de resistencias a antibiotico determinado previamente.

5. El metodo segun se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la una o mas dosis del antibiotico que inhibe la smtesis de la pared comprende una unica dosis proporcionada a una concentracion que induce el agrandamiento celular o un aumento del tamano de la celula en cepas de las bacterias que son susceptibles al antibiotico que inhibe la smtesis de la pared.

6. El metodo segun se reivindica en la reivindicacion 5 en el que la cepa bacteriana se clasifica como susceptible al antibiotico que inhibe la smtesis de la pared celular si se evalua un aumento de la longitud celular o del tamano celular.

7. El metodo segun se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende ademas la etapa de inmovilizacion de una muestra de cultivo celular sobre un portaobjetos antes de la etapa d).

8. El metodo segun se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la etapa de evaluar la longitud celular o el tamano celular se realiza por microscopia de campo brillante, microscopfa de campo oscuro, microscopfa fluorescente, microscopia de contraste de fases o microscopia de luz polarizada.

9. El metodo segun se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la etapa de evaluacion de la longitud celular o el tamano celular comprende ademas la difusion a traves de un filtro.

10. El metodo segun se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la etapa de evaluacion de la longitud celular o del tamano celular comprende ademas la tincion de la bacteria que se esta evaluando.

11. El metodo segun se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o la reivindicacion 9, en el que la etapa de evaluacion de la longitud celular o del tamano celular se realiza por citometna de flujo.

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12. El metodo segun se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las etapas b) a e) de la reivindicacion 1 se realizan en dos horas, en una hora y media o en una hora.

13. El metodo segun se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la etapa de preparacion de un cultivo bacteriano a partir de una cepa de bacterias aislada comprende ademas el aislamiento de bacterias responsables de producir una enfermedad infecciosa en un paciente.

14. El metodo segun se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el antibiotico que inhibe la smtesis de la pared celular comprende un antibiotico que inhibe la smtesis de peptidoglicano.

15. El metodo segun se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el antibiotico que inhibe la smtesis de la pared celular comprende un antibiotico de la familia de las p-lactamas o un glicopeptido.

16. El metodo segun se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el antibiotico que inhibe la smtesis de la pared celular comprende una cefalosporina o un carbapenem.

17. el metodo segun se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la bacteria comprende bacilos gram-negativos.

18. El metodo segun se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la etapa de preparacion de un cultivo bacteriano se realiza en un caldo de cultivo lfquido o en un medio con agar.

Breve descripcion de las figuras

La FIG. 1 ilustra un diagrama de flujo de un metodo de acuerdo con ciertos modos de realizacion que se describen en el presente documento.

La FIG.2 ilustra imagenes de cepas de A. baumannii incubadas con antibioticos de acuerdo con ciertos modos de realizacion descritos en el presente documento.

Si bien la presente invencion puede realizarse introduciendo diversas modificaciones y formas alternativas, se ilustra en las figuras y se describen en el presente documento modos de realizacion concretos a modo de ejemplos ilustrativos.

Modos de realizacion de la presente invencion

Tal como se utiliza a lo largo de la presente descripcion, el termino “crecimiento” cuando se utiliza en conjuncion con bacteria, bacteriano, microbio, microorganismo y similares, debera entenderse como un aumento del numero de celulas, como por ejemplo la proliferacion de las bacterias en un cultivo.

De manera similar, debera entenderse que terminos como “inhibicion de crecimiento” se refieren a la inhibicion del aumento del numero de celulas, como por ejemplo la inhibicion de la proliferacion bacteriana en un cultivo bacteriano.

Tal como se utiliza a lo largo de la presente descripcion y las reivindicaciones, el termino “agrandamiento” cuando se utiliza en conjuncion con microorganismo, bacterias, y similares, debera entenderse como un aumento de la longitud y/o tamano de microorganismos individuales.

Los modos de realizacion de la presente invencion han demostrado que se puede determinar de forma fiable la actividad de ciertos antibioticos y, en particular, antibioticos que inhiben la smtesis de pared celular o que inhiben la smtesis de peptidoglicano en diferentes bacterias, a traves de la evaluacion del agrandamiento del tamano o la longitud de la celula. Para distinguir cepas susceptibles de cepas intermedias o resistentes, se puede incubar las bacterias con dosis de antibioticos que son mucho mas bajas que las empleadas como valores lfmite de susceptible, intermedio o resistente, establecidos por organizaciones internacionales como el Instituto para la Normalizacion Clmica y de laboratorio (CLSI) para los antibiogramas normalizados basados en la evaluacion del crecimiento bacteriano por microdilucion o prueba E. Las concentraciones de antibioticos establecidas por el CLSI son adecuadas para discriminar entre susceptibilidad o resistencia basandose en el efecto lttico de la celula y en la inhibicion del crecimiento celular.

Las concentraciones lfmite de diferentes antibioticos que inhiben la smtesis de la pared celular indicadas por el CLSI son mas altas que las concentraciones que tienen como resultado agrandamiento. Se puede observar un agrandamiento celular por la actividad de antibioticos que inhiben la smtesis de la pared celular cuando se incuban con las concentraciones establecidas por el CLSI para susceptibilidad, incluso en cepas de bacterias resistentes. Sorprendentemente, la presente invencion da evidencia de que es posible establecer una correlacion entre las concentraciones de los valores lfmite del CLSI para susceptibilidad bacteriana y la concentracion de nuevos valores lfmite basandose en el efecto del agrandamiento/no agrandamiento como respuesta a un antibiotico que inhibe la smtesis de la pared celular. Si bien se ha sabido que diversos antibioticos tienen efectos en la longitud de la celula bacteriana, nunca se ha considerado el agrandamiento de la celula bacteriana como parametro para determinar la susceptibilidad/resistencia de bacterias a estos antibioticos. Para este fin, es necesario identificar una concentracion minima del antibiotico a partir de la cual empieza a ser significativo el agrandamiento del tamano o longitud de la celula, en una cepa espedfica de una especie espedfica de bacterias.

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Se puede establecer de forma empmica una correlacion de las concentraciones mmimas de antibioticos que discriminan cepas susceptibles, intermedias y resistentes (o incluso solamente cepas susceptibles y resistentes) a diversos antibioticos que inhiben la smtesis de la pared celular para cada especie de microorganismos a diversos antibioticos. A modo de ejemplo, se pueden incubar distintas concentraciones de antibiotico con un gran numero de cepas bacterianas determinadas como susceptibles, segun la prueba CMS-CLSI. La prueba CMI-CLSI puede incorporar metodologfas de antibiograma tradicionales, como crecimiento/ausencia de crecimiento obtenido por difusion, micro-dilucion y/o prueba E. La concentracion minima de antibiotico que tiene como resultado el agrandamiento de estas cepas de bacterias se puede considerar como una concentracion correlacionada con el valor CMI-CLSI para cepas susceptibles. Naturalmente, dosis de antibioticos mas altas, tales como las dosis correlacionadas como valores lfmite de resistencia intermedia o resistencia, tambien demostraran agrandamiento celular.

Para las bacterias que tienen valores CMI-CLSI que indican cepas intermedias, se puede incubar varias concentraciones de un antibiotico con un gran numero de cepas bacterianas, determinadas cada una de ellas como de resistencia intermedia segun la prueba CMI-CLSI. La concentracion minima de antibiotico que tiene como resultado el agrandamiento de esas cepas de bacterias se puede considerar como una concentracion correlacionada con el umbral CMI-CLSI para resistencia intermedia. Naturalmente, dosis mas altas, como por ejemplo una dosis correlacionada con los valores lfmite de resistencia, tambien tendran como resultado agrandamiento celular.

Finalmente, se pueden incubar distintas concentraciones de antibiotico con un gran numero de cepas bacterianas, determinadas cada una de ellas como resistentes segun la prueba CMI-CLSI. La concentracion minima de antibiotico que tiene como resultado el agrandamiento de esas cepas de bacterias se puede considerar como una concentracion correlacionada con el valor CMI-CLSI para cepas resistentes. Las dosis a esa concentracion o por encima de ellas correlacionadas con el valor lfmite de cepas resistentes pueden tener como resultado o no el agradamiento celular, dependiendo del nivel de resistencia en particular de una cepa en particular.

Se pueden incorporar los metodos descritos para determinar diversos antibioticos que tienen como resultado agrandamiento bacteriano y que pueden ser particularmente beneficiosos para someter a ensayo antibioticos que inhiben la smtesis de la pared celular. Una pared celular bacteriana se construye sobre un armazon que puede estar compuesto de peptidoglicano o murema, que es una cadena lineal constituida por N-acetilglucosamina (NAG) y acido N-acetilmuramicmico (NAM) alternos. Se une un tetrapeptido a NAM y forma un enlace interpeptfdico con el tetrapeptido de la cadena mas proxima, estabilizando y reforzando la pared celular.

La principal familia de antibioticos que inhiben la smtesis de pared celular corresponde a las p-lactamas. Estos agentes bactericidas interfieren en la formacion de los enlaces interpeptfdicos a traves de reacciones irreversibles que inhiben protemas de union a la penicilina (PUP), serina proteasas o transpeptidasas. Las cefalosporinas son una subfamilia de p-lactamas espedfica, que comprende mas de 60 antibioticos, agrupados en cinco “generaciones”, aunque el numero de generaciones sigue en debate. Las cefalosporinas, como la ceftazidima, se unen a varias PUP, si bien a veces presentan afinidad por las espedficas, como PUP 3. Esta accion tiene como resultado el agrandamiento celular o la filamentacion de la bacteria al inhibir el desarrollo del tabique intercelular, que es necesario para la division celular.

Los carbapenemos son otras p-lactamas que, a diferencia de las penicilinas y las cefalosporinas, presentan un atomo de carbono en la posicion 1 del anillo de p-lactama, en lugar azufre. Imipenem, meropenem, ertapenem, faropenem, doripenem, panipenem, y panipenem/betamipron son carbapenemos corrientes. Debera apreciarse que tambien se contemplan otros antibioticos para su uso en determinados modos de realizacion de la invencion que se reivindica. Por ejemplo, se espera que otros antibioticos que inhiben la smtesis de pared celular proporcionen correlaciones similares con los valores lfmite del CLSI. En particular, se espera que los antibioticos que actuan para inhibir la produccion de peptidoglicano funcionen de manera similar.

La FIG.1 ilustra un diagrama de flujo de un metodo de acuerdo con ciertos modos de realizacion de la invencion. El metodo puede empezar en 110 con la etapa de preparacion de un cultivo bacteriano a partir de una cepa de bacteria aislada. La bacteria se puede recoger de fluidos del cuerpo de un paciente o un animal para cultivo in vitro a traves de tecnicas y protocolos conocidos. Se puede formar el cultivo bacteriano en un caldo de cultivo lfquido, asf como en agar rico en nutrientes o incluso en agar mmimo. En un modo de realizacion, las bacterias se pueden formar en un cultivo puro que presente crecimiento exponencial. En el caso de que el cultivo bacteriano no crezca de forma exponencial, se puede clocar el cultivo en un lfquido rico en nutrientes, como por ejemplo un caldo de cultivo, e incubar durante una hora y media antes de las siguientes etapas. Las bacterias recogidas para una rapida deteccion pueden consistir en cualquier bacteria que cause infeccion a un paciente, o que se presenta en el tejido o fluidos corporales de un paciente. Sin limitar la invencion que se reivindica, las infecciones que pueden ser problematicas y que se pueden beneficiar perfectamente de la metodologfa explicada son las producidas por bacilos gram negativos. Otros ejemplos no exhaustivos de bacterias pueden incluir Acinetobacter baumannii, Klebsiella pneumonia, Pseudomonas aeruginosa, u otras especies de la familia de enterobacterias.

En la etapa 120, se puede combinar el cultivo bacteriano con una o mas dosis de un antibiotico. El antibiotico puede comprender un antibiotico que inhibe la smtesis de la pared celular, como por ejemplo una p-lactama (Betalactama)

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o un glicopeptido. En otro modo de realizacion no exhaustivo, el antibiotico se puede seleccionar entre una cefalosporina o un carbapenem. Las concentraciones para cada dosis de antibioticos pueden establecerse antes del despliegue del presente metodo a partir de la evaluacion empmca de multiples cepas de la bacteria incluyendo una amplia gama de CMI, incluyendo cepas susceptibles, intermedias y resistentes de acuerdo con el CLSI, o de otro organismo complemente que establezca definiciones similares, como por ejemplo, el Comite Europeo sobre Pruebas de Susceptibilidad a los Antimicrobianos (EUCAST por sus siglas en ingles) o la British Society of Antimicrobial Chemotherapy BSAC). Por ejemplo, se puede establecer una concentracion minima del antibiotico que induzca el agrandamiento celular unicamente en las cepas de bacterias clasificadas como susceptibles de acuerdo con las normas CMI-CLSI. Esta concentracion se puede considerar correlacionada con la norma CMI-CLSI para una cepa de bacteria susceptible. En un modo de realizacion, esta concentracion correlacionada con la clasificacion de una cepa susceptible puede ser la unica concentracion de ese antibiotico empleada para una rapida determinacion de si la cepa de la bacteria es susceptible o no susceptible a un antibiotico en particular. Dicho modo de realizacion, puede proporcionar la informacion fundamental que necesita el profesional clmico urgentemente. Alternativamente, se pueden emplear multiples dosis a concentraciones que guardan una correlacion con las concentraciones mmimas para diferenciar cepas de bacterias susceptibles, intermedias y resistentes.

La etapa de combinacion de una o mas dosis puede incluir introducir una o mas concentraciones del antibiotico en localizaciones ffsicas distintas de una placa, por ejemplo un plato Petri, u otra superficie de cultivo plana. La etapa de combinacion de una o mas dosis puede incluir tambien introducir dosis en recipientes por separado, tales como tubos de ensayo que tienen un caldo de cultivo.

Se pueden describir varias etapas del metodo y ejemplos en lo que se refiere a un unico antibiotico y una unica cepa de bacterias, pero se debera apreciar que es posible someter a ensayo multiples antibioticos a la vez de acuerdo con la invencion que se reivindica. Por ejemplo, la una o mas dosis puede comprender una unica concentracion determinada previamente a partir de multiples antibioticos, o puede comprender multiples concentraciones desde una variedad de diferentes antibioticos.

Una vez combinados, el antibiotico y el cultivo bacteriano se pueden incubar en la etapa 130. Tras una hora de incubacion con el antibiotico, se pueden evaluar las bacterias en cuanto a su agrandamiento en lo que se refiere a la longitud de la celula o el tamano de la celula en la etapa 140. La longitud celular y/o tamano celular se pueden evaluar basandose en las diferencias relativas, por ejemplo por comparacion frente a una dosis de control (es decir, concentracion de antibiotico de 0 pg/ml) o incluso por comparacion con medidas tomadas antes de la incubacion con el antibiotico. La evaluacion puede basarse tambien en medidas cuantitativas. La evaluacion del agradamiento celular puede realizarse con cualquier sistema de microscopfa posible, como por ejemplo de campo brillante, de campo oscuro, de contraste de fases, de contraste interferencial, de fluorescencia, etc. En un modo de realizacion, se pueden emplear un software que sea capaz de determinar la longitud celular o el tamano celular y que puede incluir ademas instrucciones para clasificar la susceptibilidad basandose en medidas cuantitativas o en comparaciones relativas. Dicha evaluacion se puede realizar asimismo con diversos sistemas de citometna, como por ejemplo citometna de flujo o filtracion a traves de membranas de diferentes tamanos de poro o a traves de cualquier otra metodologfa que discrimine tamanos de celulas. En un modo de realizacion, se pueden modificar los distintos kits que existen. Por ejemplo, se pueden suspender bacterias en un microgel sobre un portaobjetos e incubar en banos de crecientes de alcohol, secar y examinar por microscopio. La microscopfa fluorescente tras la tincion de la bacteria encerrada en microgeles deshidratados, con un fluorocromo, como por ejemplo SYBR Gold, proporciona la ventaja de obtener imagenes mtidas perfectas, sin fondo, con una gran calidad para establecer de forma precisa y fiable el tamano o longitud celular. La adaptacion del procedimiento de microgel da cabida a un sistema tecnologico integrado, presentado como un kit que complementa los existentes para una determinacion rapida de la susceptibilidad o resistencia a antibioticos que actuan en la pared celular.

Una vez evaluada la longitud celular o el agrandamiento celular, ya sea por comparacion relativa o a traves de medidas cuantitativas, se puede clasificar la cepa de bacterias. A modo de ejemplo, se pueden clasificar las bacterias como susceptibles, intermedias o resistentes, de acuerdo con las definiciones establecidas por el CLSI. En lo que se refiere a la FIG.2, se pueden realizar clasificaciones rapidamente basandose en la evaluacion del agrandamiento como respuesta a una o mas dosis del antibiotico. Sin embargo, tambien se pueden emplear otras definiciones de otras agencias. Las concentraciones de dosis pueden correlacionarse de forma empmca a traves de la misma metodologica que la que se ha descrito. Tambien, por ejemplo, las concentraciones del valor lfmite de CMI del antibiotico establecidas por el CLSI u otras organizaciones reguladoras pueden ser revisadas periodicamente y podnan cambiar. En tal caso, las concentraciones de valor lfmite para el criterio de agrandamiento /no alargamiento debenan correlacionarse con los nuevos valores lfmite de CMI.

Las etapas 110 a 150 se pueden realizar en una hora y media, que incluye una hora para la incubacion con el antibiotico y aproximadamente 15 minutos para la preparacion del microgel, la deshidratacion con alcoholes, el secado y la tincion para determinar el agrandamiento celular. Sin embargo, en caso de que no creciera exponencialmente el cultivo bacteriano, es posible que se requiera una hora y media extra de incubacion en un caldo de cultivo para establecer el crecimiento exponencial.

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Ejemplo 1

Se correlacionaron las concentraciones del antibiotico cefalosporina ceftazidima con los valores Ifmite para la clasificacion de cepas de Acinetobacter baumannii susceptibles, intermedias y resistentes, de acuerdo con los criterios del CLSI. En la FIG. 2 se muestran imagenes de diferentes cepas de A. baumannii, incluyendo una cepa susceptible, una cepa intermedia y dos cepas resistentes a la ceftazidima, de acuerdo con los criterios CMI-CLSI. Se incubaron varias cepas de A. baumannii con ceftazidima durante una hora, a continuacion, se encerraron en un microgel sobre un portaobjetos, se deshidrataron, se tineron con SYBR Gold y se observaron con un microscopio de fluorescencia.

La primera fila de la FIG. 2 ilustra imagenes de una cepa de A. baumannii susceptible (que tiene una CMI de 2,5 |jg/ml) expuesta a un control sin antibiotico, una segunda concentracion de 2 jg/ml de ceftazidima, una tercera concentracion de 4 jg/ml de ceftazidima y una cuarta concentracion de 8 jg/ml de ceftazidima. La segunda fila de la FIG. 2 ilustra imagenes de una cepa de A. baumannii intermedia (que tiene una CMI de 12 jg/ml) expuesta a las mismas concentraciones de ceftazidima. La tercera fila ilustra imagenes de una cepa de A. baumannii resistente (que tiene una CMI de 32 jg/ml) expuesta a las mismas concentraciones de ceftazidima y la cuarta fila ilustra una cepa altamente resistente. De acuerdo con los criterios del CLSI, se clasifica una cepa de A. baumannii como susceptible cuando sus CMI < 8 jg/ml; intermedia cuando 8 jg/ml > CMI < 16 jg/ml; y resistente cuando CMI > 32 jg/ml.

Se establecieron las concentraciones del nuevo valor lfmite de ceftazidima a partir de la inspeccion de los portaobjetos ilustrados en la FIG. 2. Por ejemplo, la cepa susceptible ilustrada en la fila de arriba presento agrandamiento a partir de concentraciones de 2 jg/ml y superiores. La CMI determinada por prueba E para la cepa susceptible fue 2,5 jg/ml. La cepa intermedia ilustrada en la segunda fila presento un agrandamiento iniciado a concentraciones de 8 jg/ml y superiores. La CMI determinada por la prueba E para la cepa intermedia fue 12 jg/ml. La cepa resistente ilustrada en la tercera fila presento un agrandamiento a partir de concentraciones de 8 jg/ml y superior. La CMI determinada por la prueba E para la cepa susceptible fue 32 jg/ml. La cepa altamente resistente ilustrada en la cuarta fila no presento agrandamiento en ninguna de las concentraciones de ensayo. La CMI determinada por la prueba E para la cepa altamente resistente fue superior a 256 jg/ml.

En suma, las concentraciones de valor lfmite de ceftazidima siguiendo el criterio de agrandamiento celular (concentraciones de antibiotico encima de las columnas) son 4 veces mas bajas que las indicadas por el CLSI para CMI. De acuerdo con el CLSI, las CMS de valor lfmite fueron < 8-16-> 32 jg/ml (susceptible-intermedia-resistente), que son equivalentes a concentraciones de < 2-4-> 8 jg/ml en el caso de agradamiento celular. Es decir, en lugar de of 8 jg/ml del CLSI, se podna incubar con 2 jg/ml, que discrimina perfectamente las cepas susceptibles de las no susceptibles, basandose en el agrandamiento/no agrandamiento celular como criterio.

Ejemplo 2

Para validar las concentraciones de valor lfmite correlacionadas establecidas en el ejemplo 1, se trataron 320 cepas de A. baumannii, de las cuales se determino que 51 cepas eran susceptibles a ceftazidima de acuerdo con CMI- CLSI establecido segun una prueba E, 35 cepas eran intermedias y 234 cepas eran resistentes.

Se incubo con ceftazidima cada una de las 320 cepas de Acinetobacter baumannii durante una hora. Cada dosis se correlaciono con los valores lfmite de susceptibilidad establecidos en el Ejemplo 1. Para determinar el agrandamiento se evaluaron las muestras incubadas con un microscopio. Se determino el criterio de alargamiento/no alargamiento por comparacion con una dosis de control de 0 jg/ml. Se considero que las cepas eran susceptibles cuando presentaron un agrandamiento como respuesta a concentraciones de 2 jg/ml y superiores. Se considero que las cepas eran intermedias cuando presentaron un agrandamiento como respuestas a concentraciones de 4 jg/ml y superiores. Se considero que las cepas eran resistentes, cuando presentaron un agrandamiento como respuesta unicamente a 8 jg/ml de dosis, o no lo presentaron con ninguna concentracion. Valiendose del criterio de agrandamiento/no agrandamiento y las concentraciones de valor lfmite correlacionadas, se identifico correctamente cada una de las 320 cepas.

Ejemplo 3

Se evaluo tambien Klebsiella pneumoniae, otro patogeno importante en situaciones clmicas. De acuerdo con los criterios del CLSI, se clasifica una cepa de K. pneumoniae como susceptible a ceftazidima cuando la CMI < 4 jg/ml y resistente cuando CMI > 16 jg/ml. Cuando se utiliza la longitud bacteriana (agrandamiento), se correlacionaron empmcamente las concentraciones de nuevo valor lfmite para ceftazidima de manera similar a la descrita en el Ejemplo 1, con la excepcion de que de acuerdo con las normas CMI-CLSI, no se determino un valor adicional para resistencia intermedia. Dichas concentraciones de valor lfmite correlacionadas para el agrandamiento fueron 0,5 jg/ml para cepas susceptibles y mas de 1,25 jg/ml para cepas resistentes. Dicho de otra forma, se considero que las cepas eran susceptibles cuando presentaron un agrandamiento celular como respuesta a concentraciones de 0,5 jg/ml y 1,25 jg/ml y se considero que eran intermedias cuando presentaron un agrandamiento celular como respuesta unicamente a la dosis de 1,25 jg/ml. Se considero que las cepas eran resistentes cuando no hubo

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agrandamiento en ninguna ni en una ni en otra concentracion. Se estudiaron las 61 cepas de K. pneumoniae que inclman 31 susceptibles, 16 intermedias y 14 resistentes a ceftazidima, de acuerdo con el criterio normal de influencia en el crecimiento tal como indica CMI-CLSI.

Se incubo cada cepa con 0,5 pg/ml y 1,25 pg/ml de ceftazidima y se evaluo para determinar el agrandamiento de la misma manera que se ha descrito en el Ejemplo 2. Se identifico correctamente cada una de las sesenta y una cepas utilizando las concentraciones del nuevo valor lfmite y valorando el agrandamiento /no agrandamiento.

Ejemplo 4

Se evaluo tambien Pseudomonas aeruginosa, una fuente comun de infecciones nosocomiales peligrosas. De acuerdo con los criterios del CLSI, una cepa de Pseudomonas aeruginosa se clasifica como susceptible a ceftazidima cuando la CMI < 8 pg/ml y resistente cuando la CMI > 32 pg/ml. Se correlacionaron las concentraciones de nuevo valor lfmite para ceftazidima basandose en el agrandamiento celular, tal como se ha descrito en el Ejemplo 3. Dichas concentraciones de valor lfmite correlacionadas para el agrandamiento fueron 0,5 pg/ml para cepas susceptibles y mas de 1,0 pg/ml para cepas resistentes.

Se estudiaron las 130 cepas de P. aeruginosa, que inclman 117 cepas susceptibles a ceftazidima, 8 cepas intermedias y 5 cepas clasificadas como resistentes a ceftazidima de acuerdo con los criterios de CLSI. Tras la incubacion durante una hora con 0,5 pg/ml de ceftazidima y 1 pg/ml de ceftazidima, se clasifico correctamente cada una de las cepas basandose en la evaluacion del agrandamiento /no agrandamiento. Las cepas susceptibles resultaron agrandadas tras la incubacion con 0,5 pg/ml y 1 pg/ml, las cepas intermedias solamente tras 1 pg/ml, en cambio las cepas resistentes no resultaron agrandadas en ningun momento tras ninguna de las dos dosis.

Ejemplo 5

Se evaluo P. aeruginosa en cuanto al efecto de carbapenemos, meropenem e imipenem, que, segun lo corroboran los autores de la invencion, inducen agrandamiento celular en cepas de esta bacteria susceptibles. Las concentraciones de valor lfmite de CLSI de susceptibilidad y resistencia corresponden a CMI < 2 - > 8 pg/ml, respectivamente. Para agrandamiento celular, las concentraciones del nuevo valor lfmite fueron mucho mas bajas: < 0,2 - > 0,5 pg/ml, para susceptibilidad y resistencia, respectivamente. Se estudiaron 130 cepas de P. aeruginosa obteniendo 97 susceptibles, 14 intermedias y 19 resistentes a meropenem, siguiendo el criterio normal de influencia en el crecimiento tal como indica CMI-CLSl. Todas estas cepas fueron clasificadas correctamente utilizado los nuevos valores lfmite para agrandamiento/no agrandamiento. Las cepas susceptibles resultaron agrandadas tras la incubacion con 0,2 pg/ml y 0,5 pg/ml, las cepas intermedias unicamente tras 0,5 pg/ml, en cambio las cepas resistentes no resultaron agrandadas en ningun momento tras ninguna de las dos dosis.

Los Ejemplos 2 y 3 demuestran que tras la incubacion de un cultivo de crecimiento exponencial con 2 pg/ml o 0,5 pg/ml de ceftazidima durante 1 hora, es posible distinguir si una cepa de A. baumannii o K. pneumoniae respectivamente, es susceptible o no a la cefalosporina, a traves del examen del agrandamiento celular. Esto constituye una informacion relevante y urgente que necesita el profesional clmico para determinar tratamientos con antibioticos, como continuar o no con el uso de una cefalosporina o cambiar de antibiotico. De manera similar, los Ejemplos 4 y 5 ilustran que es posible explorar de manera rapida numerosas especies de microorganismos para determinar su susceptibilidad a antibioticos una vez correlacionados los valores con medidas de susceptibilidad y resistencia aceptadas. Es posible valerse del tamano o la longitud de la celula bacteriana para discriminar rapidamente la susceptibilidad o resistencia a otros antibioticos y especies de bacterianas, una vez obtenidas las concentraciones del valor lfmite para el agrandamiento celular que se correlaciona con las concentraciones del valor lfmite normal establecido para crecimiento celular por organismos reguladores espedficos, a traves de las metodologfas que se han descrito.

Asimismo, para los fines de la presente descripcion y las reivindicaciones, el termino “un” o “uno” como determinante de una entidad, se refiere a uno o mas de dichas entidades; por ejemplo “un antibiotico” se refiere a uno o mas antibioticos. Segun esto, los terminos o expresiones “un” o “uno”, “uno o mas” y “al menos uno” deben entenderse como intercambiables, tal como se utilizan en el presente documento.

Se asume que todos los valores numericos que aparecen en el presente documento estan modificados por el termino “aproximadamente”, ya se indique de forma explfcita o no. Para los fines de la presente invencion, los intervalos se pueden expresar desde “aproximadamente” un valor en particular hasta “aproximadamente” otro valor en particular. Cuando se expresa un intervalo asf, otro modo de realizacion incluye del valor citado en particular al otro valor citado en particular. La cita de los intervalos numericos por los extremos incluye todos los valores numericos incluidos dentro de dicho intervalo. El intervalo numerico de uno a cinco incluye por ejemplo los valores numericos 1, 1,5, 2, 2,75, 3, 3,80, 4, 5, etc. Debe entenderse que los extremos de cada uno de los intervalos son importantes tanto en relacion con el otro extremo, como independientemente del otro extremo. Cuando el valor se expresa como una aproximacion utilizando el antecedente “aproximadamente”, debe entenderse que el valor en particular forma otro modo de realizacion.

Asimismo, en lo que se refiere a cada uno de los terminos utilizados, debera entenderse que, en la descripcion de cada termino se incluyen las definiciones tal como aparecen en el diccionario Random House Webster's Unabridged Dictionary, segunda edicion, a no ser que su utilizacion en la presente solicitud contradiga dicha interpretacion.

5 La seccion de antecedentes de la presente solicitud de patente proporciona una declaracion del campo de emprendimiento en el que se enmarca la invencion. En dicha seccion se puede incorporar o parafrasear determinadas patentes, solicitudes de patentes, publicaciones de Estados Unidos de la materia objeto de la invencion que se reivindica, utiles en lo que se refiere a informacion, problemas, o preocupaciones acerca del estado de la tecnologfa que aborda la invencion. No se pretende que ninguna patente, solicitud de patente, publicacion 10 estadounidense, declaracion u otra informacion citada en el presente documento sea interpretada o considerada o estimada como admitida como tecnica anterior en lo que respecta a la invencion.

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   REIVINDICACIONES

   1. Un metodo para evaluar de forma rapida la susceptibilidad de una cepa de bacterias aislada a un antibiotico que inhibe la smtesis de la pared celular que comprende:

   a) la preparacion de un cultivo bacteriano a partir de una cepa de bacterias aislada;

   b) la combinacion de una o mas dosis de un antibiotico que inhibe la pared celular con diferentes partes del cultivo bacteriano, en el que la concentracion de cada una de la una o mas dosis se correlaciona con umbrales de resistencia a antibioticos para la cepa de bacterias aislada al antibiotico que inhibe la smtesis de la pared celular;

   c) la incubacion del cultivo bacteriano y de la una o mas dosis de antibiotico;

   d) la evaluacion de la longitud celular o del tamano celular de las bacterias incubadas para cada una de la una o mas dosis de antibiotico que inhibe la smtesis de la pared celular;

   y

   e) la clasificacion de la susceptibilidad de la cepa de bacterias aislada al antibiotico que inhibe la smtesis de la pared celular basandose en las longitudes celulares o en los tamanos celulares de las bacterias asociadas con cada dosis de las una o mas dosis de antibiotico que inhibe la smtesis de la pared celular,

   en el que una de las dosis comprende una concentracion minima del antibiotico que inhibe la smtesis de la pared celular, determinada empmcamente, que tiene como resultado el agrandamiento celular o un aumento del tamano celular en cepas de las bacterias que son susceptibles al antibiotico que inhibe la smtesis de la pared celular, y en el que dicha concentracion minima de antibiotico que inhibe la smtesis de la pared celular es mas baja que la concentracion minima inhibitoria (CMI) de la cepa de bacterias al antibiotico que inhibe la smtesis de la pared celular para indicar susceptibilidad.
2. 2. El metodo segun se reivindica en la reivindicacion 1, en el que la etapa de preparacion de un cultivo bacteriano partir de una cepa de bacterias aislada comprende ademas preparar un cultivo bacteriano de crecimiento exponencial.
3. 3. El metodo segun se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la concentracion de cada una de las una o mas dosis del antibiotico que inhibe la pared celular se correlaciona con valores lfmite de las clasificaciones susceptible-intermedio-resistente.
4. 4. El metodo segun se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las concentraciones para cada una de las una o mas dosis se correlacionan, segun una determinacion de la respuesta a dosis de la presencia o no de agrandamiento celular o de aumento del tamano celular de multiples cepas de una bacteria, en el que las multiples cepas presentan un intervalo de resistencias a antibiotico previamente determinado.
5. 5. El metodo segun se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la una o mas dosis del antibiotico que inhibe la smtesis de la pared comprende una unica dosis proporcionada a una concentracion que induce el agrandamiento celular o un aumento del tamano celular en cepas de las bacterias que son susceptibles al antibiotico que inhibe la smtesis de la pared.
6. 6. El metodo segun se reivindica en la reivindicacion 5, en el que la cepa bacteriana se clasifica como susceptible al antibiotico que inhibe la smtesis de la pared celular si se evalua un aumento de la longitud celular o del tamano celular.
7. 7. El metodo segun se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende ademas la etapa de inmovilizacion de una muestra de cultivo celular sobre un portaobjetos antes de la etapa d).
8. 8. El metodo tal como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la etapa de evaluar la longitud celular o el tamano celular se realiza por microscopia de campo brillante, microscopfa de campo oscuro, microscopfa fluorescente, microscopia de contraste de fases o microscopia de luz polarizada.
9. 9. El metodo segun se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la etapa de evaluar la longitud celular o el tamano celular comprende ademas la difusion a traves de un filtro.
10. 10. El metodo segun se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la etapa de evaluar la longitud celular o el tamano celular comprende ademas la tincion de la bacteria que se esta evaluando.
11. 11. El metodo segun se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o en la reivindicacion 9, en el que la etapa de evaluacion de la longitud celular o el tamano celular se realiza por citometna de flujo.
12. 12. El metodo segun se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las etapas b) a e) de la reivindicacion 1 se realizan en dos horas, en una hora y media o en una hora.
13. 13. El metodo segun se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la etapa de preparacion de un cultivo bacteriano a partir de una cepa de bacterias aislada comprende ademas el aislamiento de bacterias responsables de producir una enfermedad infecciosa en un paciente.

    5 14. El metodo segun se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el antibiotico que inhibe

    la smtesis de la pared celular comprende un antibiotico que inhibe la smtesis de peptidoglicano.
14. 15. El metodo segun se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el antibiotico que inhibe la smtesis de la pared celular comprende un antibiotico de la familia de las p-lactamas o un glicopeptido.

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15. 16. El metodo segun se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el antibiotico que inhibe la smtesis de la pared celular comprende una cefalosporina o un carbapenem.
16. 17. El metodo segun se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la bacteria comprende 15 bacilos gram-negativos.
17. 18. El metodo segun se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la etapa de preparacion de un cultivo bacteriano se realiza en un caldo de cultivo lfquido o en un medio con agar.