CN105358982A - 用于快速确定细菌对抗生素的敏感性或耐药性的方法 - Google Patents

Abstract

在此披露一种快速评估细菌的菌株对细胞壁合成抑制抗生素的敏感性的方法，该方法是基于对响应于该细胞壁合成抑制抗生素的剂量的细胞增大的评价，这些剂量是与细菌敏感性的折点相关的。

Description

用于快速确定细菌对抗生素的敏感性或耐药性的方法

本国际专利申请要求于2013年7月4日提交的欧洲专利申请EP13382271.8的优先权的权益，该专利申请的披露内容通过引用结合在此。

发明领域

本发明广泛地涉及生物技术的领域，并且更具体地涉及关于人类健康、兽医卫生和环境卫生的微生物学。所描述的某些实施例涉及用于快速确定培养的细菌对抗生素的敏感性和耐药性的方法。

发明背景

欧洲疾病控制中心(ECDC)报告由于多重耐药性病原体(即，对若干抗生素具有耐药性的病原体)，每年有25,000人死亡。精心选择的早期抗生素治疗提供抵抗这类多重耐药性病原体的最佳防御。鉴于耐药性的高发生率，当前方法需要用于识别微生物的细菌培养物接着是抗菌谱，这常规地需要2-3天的细菌生长。培养细菌以单独构建抗菌谱的步骤通常需要约一天的孵育，或约最少18小时。因此，存在对快速确定抗生素治疗从而使得可以迅速给予有效治疗的需要。

一旦培养，常规方法通过与已建立的最低抑菌浓度(MIC)比较来评估细菌对抗生素的耐药性。该最低抑菌浓度(MIC)通常被视为如通过微量稀释法的标准技术或通过E-测试所确定的，显著抑制细菌生长的抗生素的最低剂量。像临床和实验室标准协会(CLSI)这样的国际组织建立了每种特定抗生素的浓度，这些浓度通常用作对于每种特定细菌的敏感性、中介耐药性(intermediateresistance)和耐药性的参考。例如，当鲍氏不动杆菌(Acinetobacterbaumannii)的菌株的MIC≤4μg/ml时，它被认为对亚胺培南(imipenem)敏感，当该MIC在4μg/ml与8μg/ml之间时中介，并且当该MIC≥16μg/ml时有耐药性。

由于经常在免疫受损的患者中或通常来自重症监护病房(ICU)的危重医院(医院获得性)感染性疾病递增，在全球范围内存在极大的关注。出于各种原因，这类感染可能与高死亡率相关联。病原体可以通过侵入，但在必要时通过医疗手段，如在机械通气过程中的呼吸途径，在通过导管的泌尿道或血管中，或甚至通过皮肤创伤如对于任何数量医疗方法所需要的切口来感染患者。与这些问题相关联的许多病原体属于革兰氏阴性杆菌家族。例如，通常鲍氏不动杆菌、肺炎克雷白氏杆菌(Klebsiellapneumoniae)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)以及一些肠细菌是对若干抗生素有耐药性的。鉴于执行标准抗菌谱所必要的相对长的时间，一般根据经验提供抗生素。此治疗在20％-40％的情况下可能是无效的，并且后来抗生素变化可以使成功概率降低。在这些具有增加的死亡或严重并发症风险的紧急情况下，一种确定有效抗生素治疗的快速系统是很让人感兴趣的。因此，存在对快速确定细菌对标准剂量下的抗生素的敏感性的需要，这可以挽救生命并且降低健康护理成本。

防治感染性疾病的第一防线经常依赖于基于可能涉及的病原体而通常已知是有效的抗生素。然而，抗生素滥用或过度使用可以导致越来越多的细菌耐药性菌株。为了防止滥用，实际工作者可以尝试从用于体外测试(如，抗菌谱)的血液样品或其他流体样品中分离细菌，同时分离最初的抗生素。

抗菌谱由体外临床测试细菌的分离菌株对抗生素的敏感性而得到。一种用于基于扩散来构建抗菌谱的常见方法是柯-鲍二氏法(鲍尔AW、卡比WMM、雪莉JC、图尔克M，通过一种标准单盘方法的抗生素敏感性测试，美国临床病理学杂志，1966；45:493-496(BauerAW,KirbyWMM,SherrisJC,TurckM.Antibioticsusceptibilitytestingbyastandardizedsinglediscmethod.AmJClinPathol1966；45:493-496))。在半定量柯-鲍二氏法中，若干含有不同抗生素的圆盘被放置在营养丰富的细菌培养物的不同区域中。因为抗生素离开圆盘扩散到琼脂内，所以不生长细菌的围绕圆盘的直径表示所述抗生素对所培养的细菌菌株的最低抑菌浓度(MIC)。一种定量方法可以依赖于具有逐渐降低浓度的所讨论的抗生素的一系列小瓶。具有其中细菌不能生长的最低浓度抗生素的小瓶提供所述抗生素对所测试的细菌菌株的最低抑菌浓度。

每种扩散和稀释方法依赖于在营养丰富的培养基中抑制细菌增殖的原则并且这需要足够的时间用于细菌的许多生殖周期。这样，这两种方法可能需要在18小时与24小时之间的最少时间。

为了提高评估细菌对抗生素敏感性的速度的先前尝试未能在满足上述需求所需的时间上提供显著减少。WO/1992/019763描述一种先前方法，该方法结合具有荧光报告子的含营养物的荧光化合物。在抗生素存在下继续生长的微生物使该化合物代谢，从而释放该荧光报告子，而敏感菌株的代谢过程释放较少的荧光报告子。此方法仍需要足够的孵育时间，从而允许足够数量的荧光报告子释放，并且可能花费大约八小时来获得结果。

上述方法是基于对微生物生长的评估。可以使用时差显微术(time-lapsemicroscopy)或实时显微术方法来加速从此类测定中得到结果。可以采用软件来协助这些结果的解译。像MicroScanWalkAway、Vitek和Wider这样的商业化系统可以能够在大约6-9小时内从特定微生物中确定对抗生素的敏感性或耐药性。

用于评价细菌菌株对抗生素的响应的另一种方法是使用实时定量聚合酶链式反应测定(q-PCR)来连续评估特定细菌DNA序列的增加，该DNA序列的增加与细菌的数量直接相关。可以在培养6小时后获得抗生素对细菌生长的可能影响的结果(罗岚JM、马莱特MN、福尼尔PE、拉乌尔D，用于通用抗生素敏感性测试的实时PCR，抗微生物化学疗法杂志，2004；54:538–541(RolainJM,MalletMN,FournierPE,RaoultD.Real-timePCRforuniversalantibioticsusceptibilitytesting.JAntimicrobChemother2004；54:538–541))。

另一种实验方法可以称为介电电泳系统，该介电电泳系统在给予抗生素后检测细胞的电生理学变化(霍特吉斯KF、黛尔JW、休斯MP，使用介电电泳快速确定大肠杆菌的抗生素耐药性，医药与生物学物理，2007；52:6001-6009(HoettgesKF,DaleJW,HughesMP.RapiddeterminationofantibioticresistanceinE.coliusingdielectrophoresis.PhysMedBiol2007；52:6001-6009))。其他可能性是使用微量量热法系统来测量由细菌培养物释放的热量(巴尔多尼D、赫尔曼H、弗雷R、特兰普斯A、施泰因胡贝尔A，用于早期检测金黄色葡萄球菌的临床分离株中的甲氧西林耐药性的微量量热法的性能，临床微生物学杂志，2009；47:774-776(BaldoniD,HermannH,FreiR,TrampuzA,SteinhuberA.PerformanceofmicrocalorimetryforearlydetectionofmethicillinresistanceinclinicalisolatesofStaphylococcusaureus.JClinMicrobiol2009；47:774-776))。

对于在细胞壁水平下起作用的抗生素(像β-内酰胺)的情况，欧洲专利EP0135023描述用于检测胞浆蛋白或酶的活性的特定底物，当抗生素有效时这些胞浆蛋白或酶被释放到培养基中。另一种可能性是评估释解到培养基中的DNA片段(桑蒂索R、塔马约M、戈萨瓦兹J、博乌G、费尔南德斯MC、费尔南德斯JL，用于确定细菌对抑制肽聚糖生物合成的抗生素的敏感性或耐药性的快速原位方法，BMC微生物学，2011；11:19(SantisoR,TamayoM,GosálvezJ,BouG,FernándezMC,FernándezJL.Arapidinsituprocedurefordeterminationofbacterialsusceptibilityorresistancetoantibioticsthatinhibitpeptidoglycanbiosynthesis.BMCMicrobiol2011；11:19))。细菌被包裹在载玻片上的琼脂糖微凝胶中并且用一种裂解溶液孵育，该裂解溶液仅影响细胞壁被抗生素影响和/或削弱的这些细胞。仅这些细菌释放类核，该类核在用高灵敏度荧色物进行DNA染色后在荧光显微术下是可视的。对抗生素有耐药性的细菌不受裂解溶液影响并且不释放类核，因此保持它们的标准形状。此方法还可以适用于确定对诱导细菌DNA碎裂的抗生素(如喹诺酮类)的敏感性或耐药性。为了这个目的，裂解溶液必须更强，从而使得所有细菌都以可检测的方式释放类核。那些对喹诺酮敏感的细菌显示破碎的DNA(即，扩散的DNA碎片)，而那些有耐药性的细菌显示完整的类核(桑蒂索R、塔马约M、费尔南德斯JL、费尔南德斯MC、莫利纳F、戈萨瓦兹J、博乌G，快速简单地确定大肠杆菌临床菌株中的环丙沙星耐药性，临床微生物学杂志，2009；47:2593-2595(SantisoR,TamayoM,FernándezJL,FernándezMC,MolinaF,GosálvezJ,BouG.RapidandsimpledeterminationofciprofloxacinresistanceinclinicalstrainsofEscherichiacoli.JClinMicrobiol2009；47:2593-2595))。然而，此方法可能偶然地导致对敏感菌株的假阳性识别，这可能因此导致无效的抗生素治疗。例如，按照CLSI标准被归类为对碳青霉烯类中介或有耐药性的铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)的一些菌株可以通过影响细胞壁来释放类核，所以它们可能被错误识别为敏感的。

每种实验方法未能提供细菌对标准剂量抗生素的敏感性的快速准确的测量，并且该领域通常继续依赖于构建抗菌谱的稀释和扩散方法。

发明概述

下文概述了要求保护的本发明的某些实施例。这些实施例不意图限制要求保护的本发明的范围，而是用作本发明的可能形式的简述。本发明可以涵盖与这些概述不同的各种形式。

一些实施例涉及一种快速评估细菌的分离菌株对细胞壁合成抑制抗生素的敏感性的方法。可以通过建立细菌的分离菌株的细菌培养物并且通过将一个或多个剂量的细胞壁合成抑制抗生素结合到该细菌培养物的不同部分上来开始此方法。一个或多个剂量中的每一个的浓度可以与分离的细菌对细胞壁合成抑制抗生素的抗生素耐药性的阈值相关。随后可以将细菌培养物与一个或多个抗生素剂量进行孵育。在孵育后，针对一个或多个细胞壁合成抑制抗生素剂量中的每个，可以评价所孵育的细菌的细胞长度或细胞大小。基于与一个或多个剂量的细胞壁合成抑制抗生素中的每个剂量相关联的细菌的细胞长度或细胞大小，可以将分离细菌对细胞壁合成抑制抗生素的敏感性进行分类。

附图简要说明

图1示出根据在此描述的某些实施例的一种方法的流程图。

图2示出根据在此描述的某些实施例用抗生素孵育的鲍氏不动杆菌(A.baumannii)菌株的图像。

虽然本发明可以通过不同的修改和替代形式体现，但在附图中示出了并在此通过示意性实例的方式描述了具体实施例。应当理解，附图和详细说明并不意图将本发明的范围限制为所披露的具体形式，但所有落入权利要求书的精神和范围内的修改、替代方案、以及等效物都意图被包含。

执行本发明的模式

如贯穿本说明书所使用的，术语“生长”当与细菌、细菌的、微生物等结合使用时，应理解为细胞数量增加，如细菌在培养物中增殖。

类似地，如“生长抑制”的术语应理解为涉及抑制细胞数量增加，如抑制细菌在细菌培养物中增殖。

如贯穿本说明书和权利要求书所使用，术语“增大”当与微生物、细菌等结合使用时，应理解为各个微生物、细菌等的长度和/或大小的增加。

本发明的实施例已经证实，某些抗生素(并且具体地在不同细菌中抑制细胞壁合成或抑制肽聚糖合成的抗生素)的活性可以可靠地通过评价细胞大小或长度的增大来确定。为了从中介或有耐药性的菌株中区分敏感菌株，可以使用比用作敏感、中介或耐药性的折点的那些剂量低得多的剂量的抗生素来孵育细菌，这些折点剂量由像临床和实验室标准协会(CLSI)这样的国际组织对于基于通过微量稀释法或E-测试评估细菌生长的标准抗菌谱所建立。由CLSI建立的抗生素浓度足够基于细胞裂解效果和细胞生长抑制来区分敏感性或耐药性。

由CLSI所指示的不同细胞壁合成抑制抗生素的折点浓度高于引起增大的那些浓度。当用由CLSI对于敏感性所建立的浓度孵育时，甚至在细菌的耐药性菌株中，可以观察到通过细胞壁合成抑制抗生素的活性引起的细胞增大。出人意料地，本发明提供以下证据：在对于细胞敏感性的CLSI折点浓度与基于响应于细胞壁合成抑制抗生素的细胞增大的存在或不存在的新折点浓度之间建立关联是可能的。虽然已知不同抗生素对细菌细胞长度有影响，但细菌细胞增大从未被认为是用于确定细菌对这些抗生素的敏感性/耐药性的参数。为此，识别抗生素的最低浓度是有必要的，高于该最低浓度时，在来自特定种类的细菌的特定菌株中细菌细胞大小或长度增大开始变得明显。

对于每个种类的微生物，区分对不同细胞壁合成抑制抗生素敏感、中介和有耐药性的菌株(或甚至只是敏感和有耐药性的菌株)的抗生素的最低浓度可以根据经验与不同抗生素相关。作为一个实例，可以将若干浓度的抗生素与大量已经由MIC-CLSI测试被确定为敏感的细菌菌株一起孵育。MIC-CLSI测试可以结合传统的抗菌谱方法，如通过扩散、微量稀释法和/或E-测试获得的生长/不生长。引起根据MIC-CLSI测试被识别为敏感的细菌菌株增大的抗生素的最低浓度可以被认为是与对于敏感菌株的MIC-CLSI值相关的浓度。自然地，更高剂量的抗生素(如作为中介耐药性和有耐药性的折点相关的剂量)也将展现细胞增大。可替代地，敏感性折点可以与其他标准的敏感性确定，或甚至独立的敏感性确定相关。

对于具有指示中介菌株的MIC-CLSI值的那些细菌，可以将若干浓度的抗生素与大量已经由MIC-CLSI测试被确定为中介耐药性的细菌菌株一起孵育。引起那些细菌菌株增大的抗生素的最低浓度被认为是与对于中介耐药性的MIC-CLSI阈值相关的浓度。自然地，更高的剂量(如与耐药性折点相关的剂量)也将引起细胞增大。可替代地，中介折点可以与其他标准的中介耐药性确定，或甚至独立的中介耐药性确定相关。

最后，可以将若干浓度的抗生素与大量已经由MIC-CLSI测试被确定为耐药性的细菌菌株一起孵育。引起那些细菌菌株增大的抗生素的最低浓度被认为是与对于耐药性菌株的MIC-CLSI值相关的浓度。处于或高于与耐药性菌株的折点相关的浓度的剂量取决于特定菌株的特定耐药性水平，可以或可以不引起细胞增大。可替代地，耐药性折点可以与其他标准的耐药性细菌确定，或甚至独立的耐药性细菌确定相关。

可以结合所描述的方法用于测试引起细菌增大的不同抗生素，并且可以在测试细胞壁合成抑制抗生素方面特别有益。细菌细胞壁被建造在一种支架上，该支架可以由肽聚糖或胞壁质构成。这是一种由N-乙酰葡糖胺(NAG)与N-乙酰胞壁酸(NAM)交替构成的直链。将四肽附接到NAM上以与最接近的链的四肽形成肽间键，从而稳定并增强细胞壁。

抑制细胞壁合成的主要抗生素家族对应于β-内酰胺。这些杀菌剂通过抑制青霉素结合蛋白(PBP)、丝氨酸蛋白酶或转肽酶的不可逆反应来干扰肽间键的形成。头孢菌素是β-内酰胺的一个特定子族，包括分为五“代”的多于60种抗生素，虽然代数还正在讨论中。头孢菌素(像头孢他啶(ceftazidime))结合若干PBP，虽然有时显示对特定PBP(像PBP3)有亲和力。通过抑制对于细胞分裂所必需的细胞间隔膜形成，此作用可以引起细菌的细胞增大或丝状形成。

碳青霉烯类是另一种β-内酰胺，与青霉素和头孢菌素不同，该碳青霉烯类在β-内酰胺环的位置1处显示一个碳原子，而不是硫。亚胺培南、美洛培南、厄他培南、法罗培南、多利培南、帕尼培南，以及帕尼培南/倍他米隆是常见的碳青霉烯类。应理解的是，也考虑将其他抗生素用于要求保护的本发明的某些实施例。例如，期待抑制细胞壁合成的其他抗生素提供与CLSI折点的类似相关性。具体地说，期待用于抑制肽聚糖产生的那些抗生素以类似的方式起作用。

图1示出根据本发明的某些实施例的一种方法的流程图。此方法可以在110处以从细菌的分离菌株建立细菌培养物的步骤开始。可以从患者或动物的体液收集细菌用于通过已知的技术和方案来进行体外培养。该细菌培养物可以在液体肉汤，以及在营养丰富的琼脂或甚至低限琼脂中形成。在一个实施例中，细菌可以被形成为展现指数生长的纯培养物。在细菌培养物不呈指数生长的情况下，可以将该培养物放置在一种营养丰富的液体(如肉汤培养液)中，并且在进一步的步骤前孵育一个半小时。用于快速检测而收集的细菌可以是在患者中导致感染、或存在于患者的组织或体液中的任何细菌。虽然不限制要求保护的本发明，但可能有问题的感染以及可以从前述方法受益的感染可以存在革兰阴性杆菌。作为另外的非限制性实例，该细菌可以是鲍氏不动杆菌、克雷白氏肺炎杆菌、铜绿假单胞菌、或在肠杆菌家族中的其他种类。

在步骤120处，可以将该细菌培养物与一个或多个剂量的抗生素结合。该抗生素可以包括一种细胞壁合成抑制抗生素，如β-内酰胺(β-内酰胺(Beta-lactam))或一种糖肽。在一个另外的非限制性实施例中，该抗生素可以是选自头孢菌素或碳青霉烯。在一个实施例中，可以在部署此方法前，从包括广范围MIC的多个细菌菌株(包括根据CLSI的敏感、中介和耐药性菌株)的经验评估，或从另一个公布类似定义的主管机构(如欧洲抗菌敏感试验委员会(EUCAST)或英国抗菌化学治疗学会(BSAC))来建立用于每个剂量的抗生素的浓度。例如，可以建立抗生素的最低浓度，该最低浓度仅在根据MIC-CLSI标准被分类为敏感的那些细菌菌株中诱导细胞增大。此浓度可以被认为与细菌的敏感菌株的MIC-CLSI标准相关。在一个实施例中，与敏感菌株的分类相关的此浓度可以是为了快速确定细菌的菌株对特定抗生素是否敏感或不敏感所采用的所述抗生素的唯一浓度。这样一个实施例可以快速地提供临床医生迫切需要的基本信息。可替代地，可以在与用于区分细菌敏感、中介和耐药性菌株的最低浓度相关的多个浓度下采用多个剂量。在又另一个实施例中，提供抗生素剂量使得提供的至少一个剂量将明显抑制敏感细菌菌株的细菌生长，并且提供的至少一个第二剂量将明显地抑制敏感或中介细菌，而不是耐药性细菌的细菌生长。

结合一个或多个剂量的步骤可以包括将一个或多个浓度的抗生素引入到板(如培养皿，或其他平板培养表面)上的单独物理位置。结合一个或多个剂量的步骤还可以包括将剂量引入到单独的容器(如具有肉汤培养液的试管)内。

可以按照单一抗生素和单一细菌菌株来描述不同方法步骤和实例，但应理解的是，可以根据要求保护的本发明同时测试多种抗生素。例如，该一个或多个剂量可以包括来自多种抗生素的单一预先确定的浓度，或可以包括来自各种不同抗生素的多个浓度。

一旦结合，可以在步骤130处孵育抗生素与细菌培养物。在用抗生素孵育一个小时后，可以在步骤140处按照细胞长度或细胞大小来评价细菌的增大。可以基于如针对一个对照剂量(即，0μg/ml的抗生素浓度)进行比较，或甚至与在用抗生素孵育前进行的测量比较的相对差异来评价细胞长度和/或细胞大小。此评价还可以是基于定量测量。可以通过每个可能的显微术系统来进行细胞增大的评价，如明视野、暗视野、相衬、干扰对比、荧光等。在一个实施例中，可以采用能够确定细胞长度或细胞大小的软件，并且该软件可以进一步包括用于基于定量测量或相对比较来分类敏感性的指令。还可以用不同细胞计量术系统(像流式细胞术)，或通过不同孔隙大小的膜过滤，或通过区分细胞大小的任何其他方法来进行这样一种评价。在一个实施例中，可以修改不同的现有的试剂盒。例如，可以将细菌悬浮在载玻片上的微凝胶中并且在递增的醇浴中孵育，干燥并且在显微术下进行检验。在用荧光染料(像SYBRGold)将包裹在干燥微凝胶中的细菌染色后，荧光显微术提供获得具有卓越品质的没有背景的完美清晰图像的优势，以便准确地并且确信地建立细胞大小或长度。微凝胶方法的适应允许一种集成的技术系统，该集成的技术系统表现为对现有用于快速确定对在细胞壁中起作用的抗生素的敏感性或耐药性的那些试剂盒进行补充的一种试剂盒。

一旦评价细胞长度或细胞增大，不论通过相对比较或通过定量测量，可以将细菌的菌株进行分类。作为一个实例，根据由CLSI提供的定义，可以将细菌分类为敏感、中介、或耐药性的。参照图2，基于对响应于一个或多个剂量抗生素的增大的评价可以迅速地进行分类。然而，还可以采用来自其他机构的其他定义。可以通过先前所述的相同方法，根据经验使剂量浓度相关。作为另一个实例，由CLSI或其他管理组织建立的抗生素MIC折点浓度可以是定期修订的并且可以改变。在这种情况下，针对增大/不增大的标准的折点浓度应与新MIC折点相关。例如，先前所述的方法可用于使测试剂量与敏感性折点相关，如在以下所述的敏感性折点：用于抗菌敏感试验的性能标准：第二十三版资料增刊(Performancestandardsforantimicrobialsusceptibilitytesting:twenty-thirdinformationalsupplement).临床和实验室标准协会，第33卷第1期.CLSI文件M100-S23，2013年1月，该文件的内容通过引用结合在此。类似地，可以使测试剂量与由其他组织，如欧洲抗菌敏感试验委员会(EUCAST)定义的敏感性折点相关。不论所使用的敏感性折点，通过所述的步骤实现对相同信息的更快的确定。

可以在一个半小时内进行步骤110至150，包括一个小时用于用抗生素孵育，以及约15分钟制备微凝胶、用醇类脱水、干燥、染色以用于确定细胞增大。然而，在细菌培养物不呈指数生长的情况下，可以需要在液体肉汤中孵育另外的一个半小时以建立呈指数生长。

实例1

使头孢菌素抗生素头孢他啶的浓度与用于根据CLSI标准对鲍氏不动杆菌的敏感、中介和耐药性菌株进行分类的折点相关。图2示出不同鲍氏不动杆菌菌株的图像，包括根据MIC-CLSI标准的一个敏感菌株，一个中介菌株以及两个对头孢他啶有耐药性的菌株。用头孢他啶孵育鲍氏不动杆菌的若干菌株一个小时，然后包裹在载玻片上的微凝胶中，脱水，用SYBRGold染色，并且在荧光显微术下进行观察。

图2的第一行示出暴露于不具有抗生素的对照、具有2μg/ml头孢他啶的第二浓度、具有4μg/ml头孢他啶的第三浓度，以及具有8μg/ml头孢他啶的第四浓度中的鲍氏不动杆菌的敏感菌株(具有2.5μg/ml的MIC)的图像。图1的第二行示出暴露于相同浓度的头孢他啶中的鲍氏不动杆菌的中介菌株(具有12μg/ml的MIC)的图像。第三行示出暴露于相同浓度的头孢他啶中的鲍氏不动杆菌的耐药性菌株(具有2.5μg/ml的MIC)的图像并且第四行示出高度耐药性的菌株。根据CLSI标准，当鲍氏不动杆菌的菌株的MIC≤8μg/ml时，它被分类为敏感的；当8μg/ml≥MIC≤16μg/ml时为中介的；并且当MIC≥32μg/ml时为耐药性的。

从检查图2中示出的载玻片来确定头孢他啶的新折点浓度。例如，在最上面一行示出的敏感菌株从浓度2μg/ml及以上展现增大。对于敏感菌株，由E-测试确定的MIC是2.5μg/ml。在第二行示出的中介菌株从浓度8μg/ml及以上开始展现增大。对于中介菌株，由E-测试确定的MIC是12μg/ml。在第三行示出的耐药性菌株从浓度8μg/ml及以上展现增大。对于敏感菌株，由E-测试确定的MIC是32μg/ml。在第四行示出的高度耐药性菌株在任何测试的浓度下不展现增大。对于高度耐药性菌株，由E-测试确定的MIC大于256μg/ml。

概括地说，按照细胞增大标准的头孢他啶的折点浓度(在这些列上方的抗生素浓度)比由CLSI指示的MIC的那些浓度低4倍。根据CLSI，折点MIC是≤8-16-≥32μg/ml(敏感-中介-耐药性)，在细胞增大的情况下，这些浓度被经验地调整成≤2-4-≥8μg/ml的浓度。根据经验相关值、细胞增大/未增大标准，可以使用在2μg/ml的抗生素下孵育，而不是前者CLSI所需要的在8μg/ml抗生素下孵育来确定细菌的敏感和不敏感菌株。更重要地是，与先前方法相比，使进行增大/未增大确定所需要的时间大幅减少。

实例2

为了验证在实例1中建立的相关折点浓度，处理320个鲍氏不动杆菌菌株。根据由E-测试建立的MIC-CLSI，那些菌株中的51个被确定是对头孢他啶敏感的，35个菌株被确定是中介的并且234个菌株被确定是耐药性的。

用头孢他啶孵育320个鲍氏不动杆菌菌株中的每个菌株一个小时。使每个剂量与在实例1中建立的敏感性折点相关。然后在显微术下评价孵育的样品的增大。通过与具有0μg/ml的对照剂量比较来确定增大/未增大的标准。当菌株响应于浓度2μg/ml及以上而展现增大时，它们被认为是敏感的。当菌株响应于浓度4μg/ml及以上而展现增大时，它们被认为是中介的。当菌株仅响应于8μg/ml剂量或不在任何浓度下展现增大时，它们被认为是耐药性的。使用增大/未增大的标准以及相关的折点浓度，正确识别出320个菌株中的每一个。

实例3

还评估了肺炎克雷白氏杆菌，该肺炎克雷白氏杆菌是临床环境中的另一种重要的病原体。根据CLSI标准，当MIC≤4μg/ml时，肺炎克雷白氏杆菌的菌株被分类为对头孢他啶敏感并且当MIC≥16μg/ml时有耐药性。当使用细菌长度(增大)时，以如实例1中所述的类似方式根据经验使针对头孢他啶的新折点浓度相关，除了根据MIC-CLSI标准没有确定中介耐药性的另外的值。针对增大的那些相关折点浓度对于敏感菌株是0.5μg/ml而对于耐药性菌株是大于1.25μg/ml。换言之，当菌株响应于0.5μg/ml和1.25μg/ml的浓度展现细胞增大时，它们被认为是敏感的，并且当它们仅响应于1.25μg/ml剂量而展现细胞增大时被认为是中介的。当在任一浓度下没有细胞增大存在时，菌株被认为是耐药性的。根据如由MIC-CLSI指示的生长影响的标准规范来研究肺炎克雷白氏杆菌的61个菌株，这些菌株包括31个对头孢他啶敏感的菌株，16个中介菌株以及14个耐药性菌株。

用0.5μg/ml和1.25μg/ml头孢他啶来孵育每个菌株并且以实例2中所述的方式来评估增大。使用新折点浓度并且评价增大/未增大，正确识别出这61个菌株中的每一个。

实例4

还评估了铜绿假单胞菌，该铜绿假单胞菌是一种危险医院感染的常见来源。根据CLSI标准，当MIC≤8μg/ml时，铜绿假单胞菌的菌株被分类为对头孢他啶敏感并且当MIC≥32μg/ml时有耐药性。如实例3中所述，基于细胞增大，使针对头孢他啶的新折点浓度相关。针对增大的那些相关折点浓度对于敏感菌株是0.5μg/ml而对于耐药性菌株是大于1.0μg/ml。

根据CLSI标准来研究铜绿假单胞菌的130个菌株，这些菌株包括对头孢他啶敏感的117个菌株，8个中介菌株以及5个被分类对头孢他啶有耐药性的菌株。在用0.5μg/ml头孢他啶和1μg/ml头孢他啶孵育一小时后，基于增大/未增大的评价对每个菌株进行正确分类。敏感菌株在用0.5μg/ml和1μg/ml孵育后出现增大，中介菌株仅在1μg/ml孵育后出现增大，而耐药性菌株在这两种剂量孵育后都没有出现增大。

实例5

对于碳青霉烯类(美洛培南和亚胺培南)的影响评估铜绿假单胞菌，我们确证了美洛培南和亚胺培南在此细菌的敏感菌株中诱导细胞增大。敏感性和耐药性的CLSI折点浓度分别对应于MIC≤2-≥8μg/ml。对于细胞增大，分别对于敏感性和耐药性的新折点浓度低得多：≤0.2->0.5μg/ml。按照如由MIC-CLSI指示的生长影响的标准规范来研究铜绿假单胞菌的130个菌株，从而获得97个对美洛培南敏感的菌株，14个中介菌株以及19个耐药性菌株。当使用增大/未增大的新折点时，所有这些菌株被正确分类。敏感菌株在用0.2μg/ml和0.5μg/ml孵育后出现增大，中介菌株仅在0.5μg/ml孵育后出现增大，而耐药性菌株在这两种剂量孵育后都没有出现增大。

实例2和3表明，在用2μg/ml或0.5μg/ml头孢他啶孵育呈指数生长的培养物1小时后，通过检查细胞增大分别区分鲍氏不动杆菌或肺炎克雷白氏杆菌的菌株对头孢菌素是否敏感是可能的。这是临床医生需要来确定抗生素治疗(如是否要继续使用头孢菌素或改变抗生素)的相关和紧急的信息。类似地，实例4和5说明一旦值与公认的敏感性和耐药性测量相关，无数种微生物可以对于它们对抗生素的敏感性而被快速筛选出。一旦通过先前所述的方法获得与标准折点浓度相关的针对细胞增大的折点浓度，细菌细胞的大小或长度可被应用于快速鉴别对其他抗生素和细菌种类的敏感性或耐药性，该标准折点浓度由特定管理组织针对细胞生长而建立。

本领域技术人员将认识到，所述本发明包括许多发明特征，这些发明特征可以以任何数量的组合提供并且包括至少以下内容：

A1.一种快速评估细菌的分离菌株对细胞壁合成抑制抗生素的敏感性的方法，该方法包括：

a)从细菌的分离菌株建立细菌培养物；

b)将一个或多个剂量的细胞壁合成抑制抗生素结合到该细菌培养物，该一个或多个剂量中的每一个的浓度与细菌的该分离菌株对该细胞壁合成抑制抗生素的抗生素耐药性的阈值相关；

c)将该细菌培养物与该一个或多个抗生素剂量进行孵育；

d)针对该一个或多个剂量的细胞壁合成抑制抗生素剂量中的每一个来评价孵育的细菌的细胞长度或细胞大小；并且

e)基于与该一个或多个剂量的细胞壁合成抑制抗生素中的每个剂量相关联的细菌的细胞长度或细胞大小，将细菌的该分离菌株对该细胞壁合成抑制抗生素的敏感性进行分类。

A2.如权利要求A1所述的方法，其中从细菌的分离菌株建立细菌培养物的步骤进一步包括建立一种呈指数生长的细菌培养物。

A3.如权利要求A1-A2中任一项所述的方法，进一步包括以下步骤：根据经验确定该细胞壁合成抑制抗生素的最低浓度，该最低浓度在对该细胞壁合成抑制抗生素敏感的该细菌的菌株中引起细胞增大或细胞大小增加。

A4.如权利要求A3所述的方法，其中引起细胞增大或细胞大小增加的该细胞壁合成抑制抗生素的该最低浓度低于用于指示敏感性的该细菌菌株对该细胞壁合成抑制抗生素的最低抑菌浓度(MIC)。

A5.如权利要求A1-A4中任一项所述的方法，其中该一个或多个剂量的该细胞壁合成抑制抗生素中的每一个的该浓度与细菌的该菌株对该细胞壁合成抑制抗生素的敏感-中介-耐药性分类的折点相关。

A6.如权利要求A1-A5中任一项所述的方法，其中通过剂量-反应确定是否存在细菌的多个菌株的细胞增大或细胞大小增加来使该一个或多个剂量中的每一个的这些浓度相关，其中该多个菌株展现出一系列预先确定的抗生素耐药性。

A7.如权利要求A1-A4中任一项所述的方法，其中该一个或多个剂量的壁合成抑制抗生素包括在对该壁合成抑制抗生素敏感的该细菌的菌株中诱导细胞增大或细胞大小增加的浓度下提供的单一剂量。

A8.如权利要求A7所述的方法，其中如果评价细胞长度或细胞大小增加，该细菌菌株被分类为对该细胞壁合成抑制抗生素敏感的。

A9.如权利要求A1-A8中任一项所述的方法，进一步包括在步骤d)前将该细胞培养物的样品固定在载玻片上的步骤。

A10.如权利要求A1-A9中任一项所述的方法，其中评价细胞长度或细胞大小的步骤通过明视野显微术、暗视野显微术、荧光显微术、相衬显微术、或偏振光显微术来进行。

A11.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中评价细胞长度或细胞大小的步骤进一步包括扩散穿过过滤器。

A12.如权利要求A1-A10中任一项所述的方法，其中评价细胞长度或细胞大小的步骤进一步包括将被评价的该细菌染色。

A13.如权利要求A1至A8或权利要求A11中任一项所述的方法，其中评价细胞长度或细胞大小的步骤通过流式细胞术来进行。

A14.如权利要求A1-A13中任一项所述的方法，其中权利要求A1中的步骤b)至e)在两个小时内、在一个半小时内、或在一个小时内进行。

A15.如权利要求A1-A14中任一项所述的方法，其中从细菌的分离菌株建立细菌培养物的步骤进一步包括对造成在患者中产生感染性疾病的细菌进行分离。

A16.如权利要求A1-A15中任一项所述的方法，其中该细胞壁合成抑制抗生素包括抑制肽聚糖合成的一种抗生素。

A17.如权利要求A1-A16中任一项所述的方法，其中该细胞壁合成抑制抗生素包括来自β-内酰胺家族的一种抗生素或一种糖肽。

A18.如权利要求A1-A17中任一项所述的方法，其中该细胞壁合成抑制抗生素包括一种头孢菌素或碳青霉烯。

A19.如权利要求A1-A18中任一项所述的方法，其中该细菌包括一种革兰氏阴性杆菌。

A20.如权利要求A1-A19中任一项所述的方法，其中建立细菌培养物的步骤在一种液体肉汤中或在一种琼脂培养基上进行。

如从上文可以容易地了解到，本发明的基本概念能以多种方式体现。本发明涉及众多且不同的实施例，包括但不限于本发明的最佳方式。

这样，由说明书披露或本申请所随附的图或表中示出的本发明的具体实施例或要素并不旨在是限制性的，而是一般由本发明涵盖的众多且不同的实施例或关于其任何特殊要素涵盖的等效物的实例。此外，本发明的一个单一实施例或要素的具体描述可以不明确地描述所有可能的实施例或要素；许多替代物由说明书和图隐含地披露。

此外，出于本说明书和权利要求书的目的，术语“一个”或“一种”实体是指一个或多个(一种或多种)所述实体；例如，“一种细菌”是指一种或多种细菌。这样，术语“一个”或“一种”、“一个或多个(一种或多种)”以及“至少一个(至少一种)”应当被理解为在此可互换的。

在此的所有数值(不论是否明确地指示)都假定由术语“约”修饰。出于本发明的目的，范围可以被表述为从“约”一个特定值至“约”另一特定值。当表述这种范围时，另一个实施例包括从一个特定值至另一个特定值。通过端点叙述的数值范围包括所有包含在所述范围内的数值。一至五的数字范围包括例如数值1、1.5、2、2.75、3、3.80、4、5等。还将理解，每个范围的端点相对于另一个端点以及独立于另一个端点都是有意义的。当一个值被表述为使用前缀“约”的近似值时，将理解，此特定值形成另一个实施例。

另外，关于所使用的每个术语，应了解，除非其在本申请中的利用与这种解释不一致，否则常见词典定义应理解为包括在如兰登书屋韦氏未删节词典(RandomHouseWebster'sUnabridgedDictionary)，第二版中包含的每个术语的描述中，每个定义特此通过引用结合。

本专利申请的背景部分提供了本发明从属的奋斗领域的一个陈述。这个部分还可以结合或含有对可用于本发明所涉及的技术状态有关的相关信息、问题或顾虑中的某些美国专利、专利申请、公开案或要求保护的本发明的主题的解释。任何美国专利、专利申请、公开案、陈述或在此引用或结合的其他信息都不意图解释、理解或视作是承认作为相关于本发明的现有技术。

本说明书中陈述的权利要求特此通过引用结合作为本发明的本说明书的一部分，并且申请人明确地保留使用此类权利要求的这种结合的内容的全部或一部分作为支撑权利要求中任一项或全部或其任何元件或组件的另外的说明书的权利，并且申请人视需要进一步明确地保留将此类权利要求的结合的内容中任何部分或全部或其任何元件或组件从说明书移动到权利要求书中的权利或反之亦然，以界定由本申请或由其任何后续申请或接续申请、部分申请或部分接续申请寻求保护的主题，或获得减少依据或符合任何国家或条约的专利法、规则或法规的费用的任何好处，并且通过引用结合的这种内容在本申请(包括其任何后续接续申请、部分申请或部分接续申请)的整个待定或对其的任何再颁布或延伸期间应继续存在。

Claims (20)

1.一种快速评估细菌的分离菌株对细胞壁合成抑制抗生素的敏感性的方法，该方法包括：

a)从细菌的分离菌株建立细菌培养物；

b)将一个或多个剂量的细胞壁合成抑制抗生素结合到该细菌培养物，该一个或多个剂量中的每一个的浓度与细菌的该分离菌株对该细胞壁合成抑制抗生素的抗生素耐药性的阈值相关；

c)将该细菌培养物与该一个或多个抗生素剂量进行孵育；

d)针对该一个或多个剂量的细胞壁合成抑制抗生素剂量中的每一个来评价孵育的细菌的细胞长度或细胞大小；并且

e)基于与该一个或多个剂量的细胞壁合成抑制抗生素中的每个剂量相关联的细菌的细胞长度或细胞大小，将细菌的该分离菌株对该细胞壁合成抑制抗生素的敏感性进行分类。

2.如权利要求1所述的方法，其中从细菌的分离菌株建立细菌培养物的步骤进一步包括建立一种呈指数生长的细菌培养物。

3.如权利要求1所述的方法，进一步包括以下步骤：根据经验确定该细胞壁合成抑制抗生素的最低浓度，该最低浓度在对该细胞壁合成抑制抗生素敏感的该细菌的菌株中引起细胞增大或细胞大小增加。

4.如权利要求3所述的方法，其中引起细胞增大或细胞大小增加的该细胞壁合成抑制抗生素的该最低浓度低于用于指示敏感性的细菌的该菌株对该细胞壁合成抑制抗生素的最低抑菌浓度(MIC)。

5.如权利要求1所述的方法，其中该一个或多个剂量的该细胞壁合成抑制抗生素中的每一个的该浓度与细菌的该菌株对该细胞壁合成抑制抗生素的敏感-中介-耐药性分类的折点相关。

6.如权利要求1所述的方法，其中通过剂量-反应确定是否存在细菌的多个菌株的细胞增大或细胞大小增加来使该一个或多个剂量中的每一个的这些浓度相关，其中该多个菌株展现出一系列预先确定的抗生素耐药性。

7.如权利要求1所述的方法，其中该一个或多个剂量的壁合成抑制抗生素包括在对该壁合成抑制抗生素敏感的该细菌的菌株中诱导细胞增大或细胞大小增加的浓度下提供的单一剂量。

8.如权利要求7所述的方法，其中如果评价细胞长度或细胞大小增加，该细菌菌株被分类为对该细胞壁合成抑制抗生素敏感的。

9.如权利要求1所述的方法，进一步包括在步骤d)前将该细胞培养物的样品固定在载玻片上的步骤。

10.如权利要求1所述的方法，其中评价细胞长度或细胞大小的步骤通过明视野显微术、暗视野显微术、荧光显微术、相衬显微术、或偏振光显微术来进行。

11.如权利要求1所述的方法，其中评价细胞长度或细胞大小的步骤进一步包括扩散穿过过滤器。

12.如权利要求1所述的方法，其中评价细胞长度或细胞大小的步骤进一步包括将被评价的该细菌染色。

13.如权利要求1所述的方法，其中评价细胞长度或细胞大小的步骤通过流式细胞术来进行。

14.如权利要求1所述的方法，其中权利要求1中的步骤b)至e)在两个小时内、在一个半小时内、或在一个小时内进行。

15.如权利要求1所述的方法，其中从细菌的分离菌株建立细菌培养物的步骤进一步包括对造成在患者中产生感染性疾病的细菌进行分离。

16.如权利要求1所述的方法，其中该细胞壁合成抑制抗生素包括抑制肽聚糖合成的一种抗生素。

17.如权利要求1所述的方法，其中该细胞壁合成抑制抗生素包括来自β-内酰胺家族的一种抗生素或一种糖肽。

18.如权利要求1所述的方法，其中该细胞壁合成抑制抗生素包括一种头孢菌素或碳青霉烯。

19.如权利要求1所述的方法，其中该细菌包括一种革兰氏阴性杆菌。

20.如权利要求1所述的方法，其中建立细菌培养物的步骤在一种液体肉汤中或在一种琼脂培养基上进行。