CN103717747A - 检测治疗剂抗性微生物的试剂盒和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于检测生物样品中治疗剂抗性微生物的方法，其包括以下步骤：a.在含有至少一种治疗剂的第一个试管和不含至少一种治疗剂的第二个试管上接种所述样品，优选进一步包括至少一种溶解剂和/或缓冲剂，和/或合适的培养基，或将样品置于分离血清管上，并且进行培养；b．将荧光标记物加入两个试管中；c．为了获得两个试管各自的一个或多个荧光或生长参数，进行荧光分析；其中通过比较这两个试管之间的一个或多个荧光参数获得生物样品对所述治疗剂的微生物抗性表型。因此，本发明在用于检测不同微生物对治疗剂的易感性的实验室程序或常规程序中是有用的，以确定微生物抗性机制乃至评价生物样品中的抗微生物药物的量。

Description

检测治疗剂抗性微生物的试剂盒和方法
发明的技术领域
本发明涉及检测治疗剂抗性微生物的试剂盒和方法，以及基础抗性机制的确定。
发明背景
现今，对简化和改进用于微生物的检测并且尤其是易感性评价的通用实验室程序存在主要的需求。理想的诊断技术将及时地给出易感性特征剖析，使得可以基于此制定合适的治疗。
就最严重的感染（即，与脓毒性休克相关）而言，速度是根本。已经表明如果耽误了合适的抗微生物治疗，则死亡率的风险将会按钟点大大地增加。
通用的金标准诊断方法是基于培养，其是缓慢、劳动密集型的，提供表型鉴定和抗微生物易感性测试，在样品收集后需要48-72小时。常常不得不启动使用广谱抗生素的经验主义治疗，导致抗微生物剂抗性的提高。
使用经典测试，必须在固体培养基上培养生物制品，如尿液，然后才能进行鉴定和易感性评价。血液通常被接种于肉汤培养基上（血液培养），并且自动分析；当呈阳性时，将它们涂布在固体培养基上，并且只有在至少24小时后，才能形成菌落，用于易感性评价。另一方面，对于易感性特征剖析测定，还需要另外的24小时，因为它们是基于在一组药物存在下的生长能力。
临床抗性可能与菌株缺乏抗微生物剂易感性相关，但也与感染局部的低水平活性抗微生物药物相关。生物化学方案只对几种药物是有用的，例如，万古霉素、庆大霉素或氨丁卡霉素，并且它们可能是无活性的。
发明概述
本发明涉及通过流式细胞术对纯微生物培养物进行的抗微生物剂易感性检测，所述培养物是含有单个生物体物种的实验室培养物，或直接来自未培养的生物样品。一些优选的实施方案不需要使用获自生物制品的纯培养物来进行，纯培养物至少需要24小时使微生物生长，因此，与流式细胞术一样，通过荧光分析，从未培养的生物样品（如，尿液、血液培养物或水）直接进行抗微生物剂易感性检测。
所公开的主题涉及用于检测生物样品中治疗剂抗性微生物的方法，包括以下步骤：
a.在含有至少一种治疗剂的第一个试管和不含至少一种治疗剂的第二个试管上接种所述样品，并且进行培养；
b．将荧光标记物加入两个试管中；
c．为了获得两个试管各自的一个或多个荧光或生长参数，进行荧光分析；
其中通过比较这两个试管之间的一个或多个荧光参数获得生物样品对所述治疗剂的微生物抗性表型。
所公开的主题还涉及用于检测生物样品中治疗剂抗性微生物（细菌、真菌或原生生物）的方法。即，直接来自未培养的生物样品，如尿液、血液培养物、水的样品或获自纯培养物的微生物悬浮液，所述方法包括以下步骤：
a．在含有至少一种治疗剂的第一个试管和不含至少一种治疗剂的第二个试管上接种所述样品；优选进一步包括至少一种溶解剂和/或缓冲液，和/或合适的培养基，或将样品置于分离血清试管上；并且进行培养；
b．将荧光标记物加入两个试管中；
c．为了获得两个试管各自的一个或多个流式细胞术参数，进行流式细胞术分析；
其中通过比较这两个试管之间的一个或多个流式细胞术参数获得生物样品对所述治疗剂的微生物抗性表型。
在其他实施方案中，所述一个或多个流式细胞术参数包含前向散射和/或侧向散射和/或荧光参数。所述荧光散射信号的参数可以是强度、光谱特征剖析和/或细胞计数。
在本发明的其他实施方案中，所公开的方法进一步包括如下准备步骤中的一个或多个：
●鉴定所述生物样品中存在的微生物的类型，并且据此选择一种或多种治疗剂，即，所述类型是革兰氏阳性还是革兰氏阴性；
●将所述生物样品浓缩，并且如果存在，除去任何碎片，例如，来自血样、尿液或其他生物制品的碎片；优选通过离心、过滤或使用分离血清试管和离心。
在本发明的另一个实施方案中，样品的培养时间可以为30分钟-2小时，优选30-60分钟。
在本发明的另一个实施方案中，样品的培养温度为30-40℃，优选25-35℃。
在本发明的另一个实施方案中，使用荧光标记物的步骤b）的反应时间为5-60分钟。
在本发明的另一个实施方案中，为了确定微生物抗性机制，步骤c）中的生物样品可以进一步包含酶抑制剂，例如，在检测超广谱β-内酰胺酶（ESBL）存在的情况下。优选的酶抑制剂特别是棒酸或三唑巴坦，或其混合物。
在本发明的另一个优选方面中，为了检测微生物抗性机制，例如，由于碳青霉烯酶（降解碳青霉烯的酶）的存在，重要的抗性机制（推荐Hodge检测，需要另外24小时，是麻烦的且难以解释），所述方法进一步包括以下步骤：
i.给所述样品接种碳青霉烯，并且进行培养；
ii．除去生物样品的微生物，优选通过过滤；
iii．添加具有己知行为的菌株-即，具有己知剂量-效应曲线的对照菌株，例如通过流式细胞术，用例如大肠杆菌，ATCC菌株25922这样的微生物培养一系列浓度的碳青霉烯；
iv．将荧光标记物加入两个样品中；
v．为了获得两个试管各自的一个或多个流式细胞术参数，进行流式细胞术分析；
vi．将产生的特征剖析与对照菌株进行比较，
在碳青霉烯酶存在的情况下，测试的菌株将降解碳青霉烯，因此活性药物减少；碳青霉烯对该类型菌株的作用降低。如果特定浓度的碳青霉烯的作用次于预期的，那么微生物是碳青霉烯酶生产者。
在本发明更优选的实施方案中，为了检测微生物抗性机制，例如，由于碳青霉烯酶的存在，所述方法进一步包括以下步骤：
●通过流式细胞术，用微生物（如，大肠杆菌，ATCC菌株25922）培养一系列浓度的碳青霉烯，获得流式细胞术剂量-效应曲线；
●用特定浓度的碳青霉烯培养后，将抗性株朝向碳青霉烯，通过过滤从含有菌株的试管中除去微生物；
●现在用类型菌株（ATCC）培养该滤液，并且通过流式细胞术分析其效应；将其效应与关于剂量-应答曲线的预期结果相比较。
在另一个优选的实施方案中，可以基于相同的方法，进一步评价生物流体中治疗量的任何药物。
在用于检测生物样品中治疗剂抗性微生物的方法的最优选实施方案中，所述微生物是葡萄球菌属（Staphylococcus spp）、链球菌属（Streptococcus spp）、肠球菌属（Enterococcus spp）；肠杆菌科（Enterobacteriacea），如大肠杆菌（Escherichia coli）、肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumonia）、变形杆菌属（Proteus spp）；不可发酵的细菌，如绿脓假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、鲍氏不动杆菌（Acinetobacter baummanii）或Burkloderia cepaciae；奈瑟氏菌属（Neisseria spp）、嗜血杆菌属（Haemophilus spp）；分枝杆菌属（Mycobacterium spp）和诺卡氏菌属（Nocardia spp）；军团菌属（Legionella spp）和厌氧细菌；真菌，如假丝酵母属（Candida spp）、新型隐球菌（Cryptococcus neoformans）、Pneumocystis jirovecii和霉菌，如曲霉属（Aspergillus spp）；寄生虫，如贾第鞭毛虫属（Giardiaspp），或其他相似微生物。
在用于检测生物样品中治疗剂抗性微生物的方法的另一个优选实施方案中，治疗剂可以是抗细菌药物，如青霉素、头孢菌素、其他β-内酰胺（碳青霉烯、氨曲南）大环内酯、喹诺酮、氨基糖苷、糖肽、脂肽、四环素等等（例如，黏菌素、氯霉素、氯林肯霉素、磷霉素、利奈唑胺、硝基呋喃妥因、磺酰胺、利福平、甲氧苄啶、甲氧苄啶-磺胺甲基异噁唑或替吉环素）；抗真菌剂，如，多烯类、5-氟胞嘧啶、唑类或棘球白素或其他相似治疗剂。
在用于检测生物样品中治疗剂抗性微生物的方法的其他优选实施方案中，荧光标记物可以是核酸染色剂，代谢染色剂，膜电位染色剂，用于细胞器的探针，细胞形态学和流体流动的荧光示踪剂，用于细胞生活力、增殖和功能的探针，或用于活性氧类的探针。最优选，荧光标记物是吖啶染料、花青染料、荧光酮染料、噁嗪染料、菲啶染料，或若丹明染料。
在不同的实施方案中，另外进行对霉菌的抗真菌药易感性，将孢子接种在含有和不含抗真菌剂的Bactec Mycosis IC/F小瓶或MGIT试管上，所述抗真菌剂如：两性霉素B、伏立康唑和氟康唑；通过Bactec设备记录变成阳性的时间-荧光发射。与不含抗真菌剂的对照小瓶相比，含有抗真菌剂的易感菌株小瓶将花至少两倍的时间来变成阳性的。
本发明的再一个主题是用于检测治疗剂抗性微生物的试剂盒，其包括以上所述的方法。
在本发明的再一个实施方案中，试剂盒可以另外存在以下溶液：治疗剂和/或荧光标记物。
在本发明的再另一个实施方案中，试剂盒可以另外包含以下溶液：缓冲剂、溶解剂和/或培养基，和/或酶抑制剂和/或对照菌株。
本发明的再一个主题是用于进行之前任一项权利要求的方法的荧光设备。荧光设备可以是流式细胞计数器或BACTEC MGIT-分枝杆菌生长指示管。
所公开的主题允许评价来自菌落或来自生物样品的微生物-即，感染剂-对主要的抗微生物剂的易感性；霉菌具有不同的实验方案。所公开的主题进一步允许检测不同生物样品中药物的抗性机制，甚至微生物定量检测。
发明概述
常规临床实验室中所用的用于易感性特征剖析的实验室方法需要最短48小时的时间。这种延迟是由于己知方法是基于微生物生长的事实。相反，通过荧光分析的抗微生物剂易感性评价，即，基于暴露于药物短时间段后的细胞生理状况评价的流式细胞术。形态损伤或生理活性的确定通过传统方法是不可能的。
在微生物学领域中已经出现了许多研发，特别是关于使用分子生物学技术鉴定微生物。然而，这种技术存在限制，因为其只可以应用于基因组己知的生物体。另一个缺陷涉及其的高成本。此外，分子生物学只是非常偶然地提供了关于微生物易感性的信息，因为只是偶然地，知道特定基因的存在给予特定药物的抗性。在关于结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）的利福平抗性和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的甲氧苯青霉素抗性的特定情况下建立了这种直接关联。
允许直接从产物进行测试的特征是：
●这些产物具有用于流式细胞术筛选的足够细胞密度（优选超过105）的事实
-使血液培养物接受预先培养，然后阳性时提供所需细胞密度的微生物，以进行易感性检测；
-尿样，用于感染的标准对应于超过105细胞/毫升的细胞密度。
●在两种产物中，在指数生长期发现了微生物-这是需要的，因为由于作用方式，一些类型的抗微生物药物的易感性评价需要具有处于指数生长期的微生物。
流式细胞术的创新申请是随着时间动态地进行微生物细胞群的多参数评价的可能性，并且将这与其复制能力的研究关联起来。为了证明通过常规方法的药物的快速致命活性，我们必须证明细胞不能复制。通过流式细胞术，我们能够证明使用特定药物的几分钟培养时间后，细胞膜的严重损伤，意味着死亡。此外，通过流式细胞术可以研究作用机制，甚至更重要的抗性机制。此外，这种新方法可以研究对危急病人常常使用的之前没有体外协同作用证据的药物组合。
附图描述
以下附图提供了用于说明描述的优选实施方案，并且不应当看成是限制本发明的范围。
图1：在流式细胞术获得之前直接从阳性血液培养物或尿样快速评价抗微生物剂易感性的方法图解。
图2：本发明的两个不同实施方案的图解-使用阳性血液培养物或尿样进行检测微生物对治疗剂的易感性的方法，并且用典型的易感和抗性菌株获得结果。
图3：2小时培养时间并用FDA染色后，对苯甲异噁唑青霉素（MRSA）易感（MSSA）和抗性的金黄色葡萄球菌典型实例的流式细胞术柱状图。
图4：1小时培养时间并用FDA染色后，对万古霉素易感和抗性的粪肠球菌（Enterococcus faecalis）典型实例的流式细胞术柱状图。
图5：一小时培养时间并用SYBR绿染色后，对喹诺酮（即，卷须霉素）易感和抗性的大肠杆菌典型实例的流式细胞术柱状图。
图6：使用药物培养一小时并用DiBAC4(3)染色后，对头孢噻肟（CTX）易感和抗性的大肠杆菌典型实例的流式细胞术柱状图；对CTX抗性的情况下，使用和未用棒酸（CLA），用CTX培养，并用DiBAC4(3)染色。用CLA培养时，ESBL阳性菌株行为是易感的。
图7：用阿尼芬净、氟康唑或两种组合培养一小时并用DiBAC4(3)染色后，白色假丝酵母菌（Candida albicans）的典型实例的流式细胞术柱状图。a.对照细胞（未用抗真菌剂）和C用药物培养后（C1-阿尼芬净，C2-氟康唑以及C3-阿尼芬净和氟康唑）。
发明详述
传统的易感性方法是基于固体培养基中的纯培养物。制备微生物的悬浮液并且依照关于自动化方法（VITEK 1或VITEK 2系统-BioMerieux；BD Phoenix系统-Becton-Dickinson Biosciences；MicroScan WalkAway系统-Dade Behring）的适当易感性卡/板（实例：革兰氏阴性杆菌；革兰氏阳性球菌；真菌等）。
可以使用其他人工检测，如肉汤大量稀释和微量稀释检测、E-检测（AB BIODISK）、纸片扩散检测和干型板（TREK Diagnostics）。
所有都是基于研究微生物在不同抗微生物剂存在下的复制能力。
首先，最大的缺陷在于从固体培养基中的菌落进行，其需要至少24小时来生长。尽管存在可用的半自动化方法，但它们是基于生长检测，这需要时间来获得结果（最少18-24小时），它们需要经验丰富的人员，并且是昂贵的。
生物分子方法（不是在所有常规实验室中进行的）。
分子方法代表了用于微生物学诊断实验室测试的革命，与微生物鉴定最相关，但很少可以帮助易感性评价（Multiplex PCR、Microarrays等）。
实际上，存在几个涉及抗性机制的基因，导致多次测序步骤。通常，基因型和表型之间缺乏关联。尽管是高度灵敏和特异性的-但没有给出任何关于生活力的信息并且是昂贵的。
1．微生物悬浮液的制备
1.1 血液培养物或尿样
从阳性血液培养物或尿样：
●进行革兰氏染色（最长：10分钟）或质谱分析（Maldi-TOF），以指导随后的分析。这个之前的步骤将给我们提供关于微生物的基本信息，即关于：
-细菌：球菌或杆菌；革兰氏阳性或革兰氏阴性-导致待测试抗生素的选择；
-真菌
●过滤（以除去血液学细胞和大的碎片）并且将血液培养物或尿液转移至含有血液溶解溶液（NH4Cl、KHCO3和EDTA的水溶液）的小瓶中或
●转移至分离器血清管（例如，vacoutainer凝胶管）并离心。血细胞将停留在凝胶底部，微生物在凝胶顶部
●在无菌、滤过的培养基上制备微生物悬浮液。
1.2 从纯培养物
从无菌和滤过的肉汤培养基（例如：Müeller-Hinton）中的菌落制备微生物悬浮液，并且培养直至指数生长期。
1．在37℃和150下/分钟下培养细菌悬浮液，直至在无菌且滤过（0.22μm）的Müeller-Hinton肉汤（DifcoTM）中，细菌达到早期指数生长期（优选当在600nm波长下光密度0.2时）。
2．将肉汤培养物稀释至O.D.=0.06（约106细胞/ml，其为在流式细胞计数器中读取的最佳细胞密度）或者调节至0.5MacFarland，此后在肉汤培养物中稀释优选1:100。
2.体外抗微生物剂处理
-获得用于通过流式细胞术检测易感性的细胞密度，可以为例如106细胞/ml。
-将微生物悬浮液转移至一组含有不同抗微生物药物（断点浓度）的小瓶中，包括对照小瓶（不含抗微生物药物）；
-根据抗微生物药物培养小瓶（0.5-2小时）；
-根据之前优化的实验方案，加入合适的荧光色素（根据抗微生物药物）。
3．流式细胞术分析
通过将电压调节至所有荧光通道的第三个对数（log）十进位，使用微球体样品，来限定收集设定。使用FSC极限。
根据荧光探针，在FL1、FL2和FL3荧光通道中分析样品，使用两点曲线：SSC与FSC和SSC与荧光。使用荧光强度和/或染色细胞的百分比来表示数值结果。
设备是流式细胞计数器（例如，FACSCalibur BD Biosciences，悉尼，澳大利亚），具有三个装备了标准滤光器（FL1：BP 530/30nm；FL2：BP 585/42nm；FL3：LP 670nm）的PMT，15mW 488nm氩激光仪，并用细胞Quest Pro软件（版本4.0.2，BDBiosciences，悉尼）运行。所用的流式细胞术数据文件格式为FCS 2.0a。
实施例
以下实施例提供了优选的实施方案，并且不应当看成是限制本发明的范围。
实施例1
大肠杆菌对喹诺酮的易感性评价
●微生物制剂：大肠杆菌
●测试的药物：喹诺酮-卷须霉素
[2个断点浓度：1和4μg/ml]
●使用的荧光色素：SYBR绿，结合双链DNA结构的膜渗透性染料。
1．将具有106细胞/ml浓度的细菌悬浮液分配至一系列的小瓶中，所述小瓶含有：
■1μg/ml的卷须霉素
■4μg/ml的卷须霉素
■存活对照（不含卷须霉素）
2．在35℃和150下/分钟下培养三十分钟后，将一组小瓶在10000rpm下离心五分钟。
3．加入1:100000最终稀释的SYBR绿（在TE中制备，pH=7.5），在黑暗中持续30分钟。
4．在530/30nm-FL1下进行流式细胞术获取；比较处理细胞和未处理细胞的荧光强度。
结果解释标准
卷须霉素通过抑制DNA促旋酶来起作用，并且阻断DNA复制，导致较少的双链DNA，这是荧光色素SYBR绿的目标物。因此，预期对卷须霉素易感的菌株（MIC值<1μg/ml）显示出双链DNA的减少-对应于较低的荧光强度。
基于处理细胞和未处理细胞（存活对照）的绿色荧光（530/30nm；FL-1）强度之间的比例，计算染色指数（SI）。
●如果使用1μg/ml卷须霉素，SI<1，则是易感细菌；
●如果使用4μg/ml卷须霉素，SI≥1，则是抗性细菌。
实施例2
革兰氏阴性细菌对碳青霉烯的易感性评价
●微生物制剂：绿脓假单胞菌
●测试的药物：碳青霉烯-美罗培南
[3个断点浓度：优选1、2或4μg/ml]
●使用的荧光色素：双-(1,3-二丁基巴比妥酸)三次甲基氧鎓醇（DiBAC4(3)）-用于测量膜电位的电压敏感性亲脂性阴离子；去极化细胞显示出较高的荧光强度，而极化细胞显示出较低值。
1．将具有106细胞/ml浓度的细菌悬浮液分配至一系列的小瓶中，所述小瓶含有：
■1μg/ml的美罗培南
■4μg/ml的美罗培南
■存活对照（不含美罗培南）
2．在35℃和150下/分钟下培养三十分钟后，加入终浓度为1μg/ml的DiBAC4(3)，在黑暗中持续30分钟。
3．在530/30nm-FL1下进行流式细胞术获取；比较处理细胞和未处理细胞的荧光强度。
结果解释标准
美罗培南，是通过抑制细菌细胞壁的肽聚糖层合成起作用的杀细菌剂。对易感菌株，可以通过DiBAC4(3)快速地检测膜去极化。去极化细胞显示出较高的荧光强度，而极化细胞显示出较低值。
基于用抗微生物剂处理后的去极化细胞和对照细胞（未处理）的绿色荧光（530/30nm；FL-1）强度之间的比例，计算染色指数（SI）。
●如果使用1μg/ml美罗培南，SI<1，则是易感细菌；
●如果使用4μg/ml美罗培南，SI≥1，则是抗性细菌。
实施例3
金黄色葡萄球菌对苯甲异噁唑青霉素的易感性评价
●微生物制剂：金黄色葡萄球菌
●测试的药物：苯甲异噁唑青霉素
[2个浓度：2、4μg/ml]
●使用的荧光色素：FDA（荧光素二乙酸酯），细胞生活力的荧光指示剂；活细胞通过酯酶水解时，FDA形成荧光素。
1．将具有106细胞/ml浓度的细菌悬浮液分配至一系列的小瓶中，所述小瓶含有：
■2μg/ml的苯甲异噁唑青霉素
■4μg/ml的苯甲异噁唑青霉素
■存活对照（不含苯甲异噁唑青霉素）
2．在35℃下培养120分钟后，加入1μg/ml的FDA，并且在相同条件下培养60分钟。
3．在530/30nm-FL1下进行流式细胞术获取；比较处理细胞和未处理细胞的荧光强度。
结果解释标准
苯甲异噁唑青霉素是通过抑制细菌细胞壁的肽聚糖层合成起作用的杀细菌剂。因此，预期对苯甲异噁唑青霉素易感的菌株（MIC值≤2μg/ml）显示出代谢活性的降低-对应于较低的荧光素荧光强度。
基于处理细胞和未处理细胞（存活对照）的绿色荧光（530/30nm；FL-1）强度之间的比例，计算染色指数（SI）。
●如果使用2μg/ml苯甲异噁唑青霉素，SI<1，则是易感细菌；
●如果使用4μg/ml苯甲异噁唑青霉素，SI≥1，则是抗性细菌。
实施例4
革兰氏阳性细菌对万古霉素的易感性评价
●微生物制剂：粪肠球菌
●测试的药物：糖肽-万古霉素
[2个断点浓度：4-16μg/ml]
●使用的荧光色素：FDA（荧光素二乙酸酯），细胞生活力的荧光指示剂；活细胞通过酯酶水解时，FDA形成荧光素，增加荧光发射。
1．将具有106细胞/ml浓度的细菌悬浮液分配至一系列的小瓶中，所述小瓶含有：
■4μg/ml的万古霉素
■16μg/ml的万古霉素
■存活对照（不含万古霉素）
2．在35℃和150下/分钟下培养60分钟后，加入1μg/ml的FDA，并且在相同条件下培养30分钟。
3．在530/30nm-FL1下进行流式细胞术获取；比较处理细胞和未处理细胞的荧光强度。
结果解释标准
万古霉素是通过抑制细菌细胞壁的肽聚糖层合成起作用的杀细菌剂。因此，预期对万古霉素易感的菌株（MIC值≤2μg/ml）显示出代谢活性的降低-对应于较低的荧光素荧光强度。
基于处理细胞和未处理细胞（存活对照）的绿色荧光（530/30nm；FL-1）强度之间的比例，计算染色指数（SI）。
●如果使用4μg/ml万古霉素，SI<1，则是易感细菌；
●如果使用16μg/ml万古霉素，SI≥1，则是抗性细菌。
实施例5-抗性机制的研究
通过超光谱β-内酰胺酶（ESBL）的抗性
●微生物制剂：肺炎克雷伯氏菌
●测试的药物：头孢噻肟（CTX）和头孢噻甲羧肟（CAZ），2个断点浓度：
-对于CTX，1和4μg/ml
-对于CAZ，4和16μg/ml
●测试的药物抑制剂：棒酸（CLA）-4μg/ml
●使用的荧光色素：双-(1,3-二丁基巴比妥酸)三次甲基氧鎓醇（DiBAC4(3)）-用于测量膜电位的电压敏感性亲脂性阴离子。
1．将具有106细胞/ml浓度的细菌悬浮液分配至一系列的小瓶中，所述小瓶含有：
■1μg/ml的CTX；
■4μg/ml的CTX；
■1μg/ml的CTX+4μg/ml的CLA；
■4μg/ml的CTX+4μg/ml的CLA；
■4μg/ml的CAZ；
■16μg/ml的CAZ；
■4μg/ml的CAZ+4μg/ml的CLA；
■16μg/ml的CAZ+4μg/ml的CLA；
■存活对照（未用头孢菌素）
2．在35℃和150下/分钟下培养三十分钟后，加入终浓度为1μg/ml的DiBAC4(3)，在黑暗中持续30分钟。
3．使用合适的实验方案进行流式细胞术分析，并且在530/30nm-FL1下阅读。
结果解释标准：
基于它们水解头孢菌素（CTX和CAZ）的能力来检测ESBL，但受到棒酸（CLA）的抑制，即，预期通过暴露于与CLA结合的头孢菌素变得易感时，通过ESBL的产生，来检测对头孢菌素抗性的细菌。
基于在CLA存在和不存在下，用最高浓度的两种头孢菌素（4μg/ml的头孢噻肟（CTX）和16μg/ml的头孢噻甲羧肟（CAZ））处理后，去极化细胞（死细胞；具有最高荧光强度的细胞）的绿色荧光（530/30nm；FL-1）之间的比例，计算染色指数-在这个特定情况下，称为CLA指数。
CLA指数>1.5（对于至少一种头孢菌素），则是ESBL产生细菌
CLA指数≤1.5，则是ESBL阴性产生细菌
实施例6
来自阳性血液培养物的酵母对药物组合的易感性评价
过滤和使用溶解剂，或使用分离管和离心
●进行革兰氏分析-酵母或MaldiTof分析-白色假丝酵母菌
●测试的药物：分开的和结合的阿尼芬净和氟康唑
●使用的荧光色素：FUN-1，用于研究酵母生活力的荧光标记物
注意：不能存活的细胞显示出比存活（未处理细胞）更高的荧光强度
●用分开和结合的抗真菌剂在37℃下培养六十分钟后，加入终浓度为0.5μg/ml的FUN-1，在黑暗中持续30分钟。
在575nm-FL2下进行流式细胞术获取；按照用结合的抗真菌剂处理的细胞的荧光和用各自单独的抗真菌剂处理的细胞的荧光的总和来计算荧光指数。结合归类为协同、无关或对抗。
结果解释标准：
根据染色指数（SI）确定体外药物相互作用的评价。按照用药物组合（每种药物0.5xMIC）处理的细胞呈现的平均荧光强度除以单独药物的荧光的总和来计算SI。因此，SI=（MIF AND+FLU/MIF AND）+（MIF AND+FLU/MIF FLU）/（MIF-处理细胞和活细胞的平均荧光强度之间的配给）。对于SI<1，将结合限定为“拮抗”，对于1-4之间的SI，为“无关”，对于SI>4，为“协同”。
实施例7
烟曲霉（Aspergillus fumigatus）的抗真菌剂易感性
●制备烟曲霉的稠密悬浮液；
●在来自自动化Bactec设备的一系列Bactec Mycosis IC/F小瓶或MGIT试管（Becton Dickinson）中接种107孢子/ml；
●每个系列包括一个不含抗真菌剂的小瓶或试管（对照），一个含有两性霉素B，一个含有泊沙康唑，一个含有伏立康唑；
●将小瓶或试管在各自的Bactec设备中培养，并记录变成阳性的时间。
结果解释标准：
与对照相比，用抗真菌剂培养易感菌株将花费超过两倍的时间来变成阳性的。MGIT试管比Bactec小瓶更快地给出结果（例如，Bactec小瓶中的对照样品花费7±1小时，相对于MGIT试管中的11±1小时）。
实施例8
来自生物流体的微生物抗微生物剂定量
●使用我们想要定量的抗微生物剂培养时，使用具有己知流式细胞术剂量-效应曲线的对照菌株；
●用对照菌株培养生物样品
●用适当的荧光标记物标记两种之前的样品，以评价抗微生物剂的效用；
●获得流式细胞计数器荧光和散射信号，以产生所述微生物的特征剖析。
结果解释标准：
比较用对照样品曲线产生的流式细胞术特征剖析，并且推断样品中存在的浓度。
本发明当然不是以任何方式局限于所述的实施方案，并且本领域的普通技术人员将预见到其许多改进的可能性，而不会违背如所附权利要求中限定的本发明的基础概念。
以下权利要求阐明了本发明的特定实施方案。

Claims (27)

1.用于检测生物样品中治疗剂抗性微生物的方法，包括以下步骤：
a.在含有至少一种治疗剂的第一个试管和不含至少一种治疗剂的第二个试管上接种所述样品，并且进行培养；
b.将荧光标记物加入两个试管中；
c．为了获得两个试管各自的一个或多个荧光参数，进行荧光分析；
其中通过比较这两个试管之间的一个或多个荧光参数获得生物样品对所述治疗剂的微生物抗性表型。
2.用于检测生物样品中治疗剂抗性微生物的方法，包括以下步骤：
a．在含有至少一种治疗剂的第一个试管和不含至少一种治疗剂的第二个试管上接种所述样品，并且进行培养；
b.将荧光标记物加入两个试管中；
c．为了获得两个试管各自的一个或多个流式细胞术参数，进行流式细胞术分析；
其中通过比较这两个试管之间的一个或多个流式细胞术参数获得生物样品对所述治疗剂的微生物抗性表型。
3.根据之前权利要求的方法，其中所述一个或多个流式细胞术参数包括前向散射和/或侧向散射和/或荧光参数。
4.根据之前权利要求的方法，其中所述荧光散射信号的参数包括强度、光谱特征剖析和/或细胞计数。
5.根据之前权利要求的方法，进一步包括如下准备步骤中的一个或多个：
i．鉴定所述生物样品中存在的微生物的类型，并且据此选择所述一种或多种治疗剂，即，所述类型是革兰氏阳性、革兰氏阴性细菌还是真菌；
ii．将所述生物样品浓缩，并且如果存在，除去任何碎片。
6.根据之前权利要求的方法，其中所述生物样品是未培养的尿液样品、血液培养物、水或获自纯培养物的微生物悬浮液。
7.根据权利要求3的方法，其中所述步骤ii）包括离心或过滤。
8.根据之前权利要求的方法，其中所述步骤a）进一步包括至少一种溶解剂。
9.根据之前权利要求的方法，其中所述步骤a）进一步包括缓冲剂。
10.根据之前权利要求的方法，其中所述步骤a）将样品接种于合适的培养基中。
11.根据之前权利要求的方法，其中所述步骤a）中的样品培养时间介于30分钟-2小时之间。
12.根据之前权利要求的方法，其中所述样品的培养温度介于25-35℃之间。
13.根据之前权利要求的方法，其中所述步骤b）与荧光标记物的反应时间为5-60分钟。
14.根据之前权利要求的方法，其中在检测超广谱β-内酰胺酶ESBL存在的情况下，步骤c）中的所述生物样品进一步包含酶抑制剂。
15.根据之前权利要求的方法，其中所述酶抑制剂是棒酸或三唑巴坦。
16.根据之前权利要求的方法，进一步包括以下步骤：
i.给所述样品接种碳青霉烯，并且进行培养；
ii．除去所述生物样品的微生物，优选通过过滤；
iii．添加具有己知行为的菌株；
iv．将荧光标记物加入两个样品中；
v．为了获得两个试管各自的一个或多个流式细胞术参数，进行流式细胞术分析；
vi．将产生的特征剖析与对照菌株进行比较。
17.根据之前权利要求的方法，其中所述微生物是细菌、真菌或原生生物。
18.根据权利要求16的方法，其中所述细菌是革兰氏阳性或阴性的；革兰氏不定的或不能革兰氏染色的细菌，如柔膜菌门（Mollicutes）；或是醇-酸抗性细菌。
19.根据权利要求18的方法，其中所述微生物是葡萄球菌属（Staphylococcus）、链球菌属（Streptococcus）、肠球菌属（Enterococcus）；肠杆菌科（Enterobacteriacea），大肠杆菌（Escherichia coli）、肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumonia）、变形杆菌属（Proteus）；绿脓假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、鲍氏不动杆菌（Acinetobacter baummanii）或洋葱伯克氏菌（Burkloderia cepaciae）；奈瑟氏菌属（Neisseria）、嗜血杆菌属（Haemophilus）；分枝杆菌属（Mycobacterium）、诺卡氏菌属（Nocardia）；军团菌属（Legionella）、厌氧细菌；假丝酵母属（Candida）、新型隐球菌（Crytococcus neoformans）、Pneumocystisjirovecii，或霉菌，如曲霉属（Aspergillus）；贾第鞭毛虫属（Giardia）。
20.根据之前权利要求的方法，其中所述治疗剂是抗细菌药物，如青霉素、头孢菌素、碳青霉烯、氨曲南、大环内酯、喹诺酮、氨基糖苷、糖肽、脂肽、四环素、粘菌素、氯霉素、氯林肯霉素、磷霉素、利奈唑胺、硝基呋喃妥因、磺酰胺、利福平、甲氧苄啶、甲氧苄啶-磺胺甲基异噁唑或替吉环素、多烯类、5-氟胞嘧啶、唑类或棘球白素。
21.根据之前权利要求的方法，其中所述荧光标记物是核酸染色剂，代谢染色剂，膜电位染色剂，用于细胞器的探针，细胞形态学和流体流动的荧光示踪剂，用于细胞生活力、增殖和功能的探针，或用于活性氧类的探针。
22.根据权利要求21的方法，其中所述荧光标记物是吖啶染料、花青染料、荧光酮染料、噁嗪染料、菲啶染料，或若丹明染料。
23.用于检测治疗剂抗性微生物的试剂盒，其包括之前任一项权利要求的方法。
24.根据权利要求23的试剂盒，进一步包括以下溶液：治疗剂和/或荧光标记物。
25.根据权利要求23-24的试剂盒，进一步包括以下溶液：缓冲剂、溶解剂和/或培养基。
26.用于进行之前任一项权利要求的方法的荧光设备。
27.根据权利要求25的荧光设备，其中所述设备是流式细胞计数器。
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