CN107121375A - 一种饮用水中四环素抗性细菌的流式细胞仪检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种饮用水中四环素抗性细菌的流式细胞仪检测方法，包括以下步骤：(1)取待测水样加入棕色试管中，加入四环素母液，使待测水样中四环素浓度等于其MIC值，再将其置于培养箱中，在27℃下培养24h；(2)取培养后的水样转移至流式细胞仪进样管中，加入SYBR Green I染色剂和碘化丙啶染色剂染色，充分震荡后37℃下避光培养10～15min；(3)再将培养后的流式细胞仪进样管转移至流式细胞仪中，开始进样，并测定四环素抗性细菌数，再除以进样体积，即得到饮用水中四环素抗性细菌的浓度。与现有技术相比，本发明利用流式细胞仪检测四环素抗性细菌数量，具有快速、准确和定量的优点，克服了传统的培养法不能检测出不可培养的抗性细菌的缺点，结果更加可靠。
Description
技术领域
本发明涉及一种四环素抗性细菌的检测方法，尤其是涉及一种饮用水中四环素抗性细菌的流式细胞仪检测方法。
背景技术
近年来由于抗生素的大量使用，环境中抗生素的存在水平相较于20世纪已有显著提高，由此导致的抗生素环境污染和生态毒害问题也日趋严重。目前，不同种类的抗生素已经在地下水、饮用水、地表水和农业土壤中被广泛检出。四环素是环境中最为常见的抗生素之一。进入环境中的抗生素不仅会干扰环境中其他生物的正常代谢及生长，还能诱发大量抗生素抗性细菌的产生。
抗生素抗性细菌(Antibiotics Resistance Bacteria，ARB)对抗生素产生抗性是因为具有抗生素抗性基因(Antibiotics Resistance Genes，ARG)，而ARG在水中可以通过水平基因转移等方式转移到其他细菌体内，从而使其他细菌也具有对抗生素的抗性。一些研究已经证实饮用水中存在多种条件致病菌，一旦这些细菌通过水平基因转移等方式获得了抗生素抗性，再通过饮用水处理系统进入人体，将会对人体健康造成极大威胁。因为抗生素抗性的获得意味着普通的抗生素将会很难将这些细菌杀死，从而对现有的医疗卫生手段提出了极大的挑战。因此，对饮用水中的抗生素抗性细菌数量进行检测非常必要。
传统的抗生素抗性细菌检测方法是利用特定培养基将抗生素抗性细菌分离出来再进行计数。一般来说是在R2A培养基中加入等于抗生素MIC值的抗生素，再经过稀释平板法统计菌落数量。传统培养法的缺陷在于有一些抗性细菌本身是不可培养的细菌，不能在培养基上生长出菌落，从而无法被计数。而且传统培养法需要花费大量人力，检测周期也较长，不能快速准确地检测水中抗生素抗性基因的数量。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种饮用水中四环素抗性细菌的流式细胞仪检测方法。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
一种饮用水中四环素抗性细菌的流式细胞仪检测方法，包括以下步骤：
(1)取待测水样加入棕色试管中，加入四环素母液，使待测水样中四环素浓度等于其MIC值，再将其置于培养箱中，在27℃下培养24h；
(2)取培养后的水样转移至流式细胞仪进样管中，加入SYBR Green I染色剂和碘化丙啶染色剂染色，充分震荡后37℃下避光培养10～15min；
(3)再将培养后的流式细胞仪进样管转移至流式细胞仪中，开始进样，并测定活细胞数，即四环素抗性细菌数，将测出的四环素抗性细菌数除以进样体积，即得到饮用水中四环素抗性细菌的浓度。
作为优选的实施方案，根据美国临床和实验室标准协会(Clinical andLaboratory Standards Institute,CLSI)所规定的四环素的最小抑制剂浓度(Minimuminhibitory concentration,MIC)为16mg/L，配制四环素母液，加入500mL超纯水和0.8g四环素，使四环素浓度为1.6g/L，避光保存。需使用时，可以通过四环素母液与原水样配置得到待测水样。
作为优选的实施方案，步骤(1)中当待测水样中细菌浓度过高时，可采用稀释剂稀释，所述稀释剂为磷酸盐缓冲溶液(Phosphate Buffered Saline，PBS)，其配方为：34g磷酸二氢钾，175ml 1mol/L的氢氧化钠溶液，825ml超纯水，pH＝7.2。
作为优选的实施方案，步骤(2)中SYBR Green I染色剂的加入量为5μL/500μL水样，碘化丙啶染色剂(此处为纯碘化丙啶)的加入量为1.5μL/500μL水样。
作为上述优选的实施方案的更优选，所述的SYBR Green I染色剂通过以下方法制成：
取SYBR Green I染料置于灭菌后的离心管中，再加入二甲基亚砜稀释，制成SYBRGreen I工作储备液，置于-20℃冰箱中保存备用，使用时将SYBR Green I工作储备液取出融化并震荡均匀。
作为上述更优选的实施方案的进一步优选，SYBR Green I染料与二甲基亚砜的体积比为1:99，其中，二甲基亚砜预先采用0.22μm滤头过滤处理。
作为优选的实施方案，步骤(3)中流式细胞仪的激发光源选取488nm(20MW)，进样速度为中速，通道电压等参数根据实际需求调整；
检测时，SYBR Green I染色细胞在533nm绿色荧光FITC-A通道下检测，PI染色细胞在670nm红色荧光7AAD-A通道下检测，当检测的总的events数为300000时，停止进样，并记录进样体积。
作为上述优选的实施方案的更优选，所述的四环素抗性细菌数通过以下方法测出：
(a)取流式细胞仪进样管中加入超纯水、SYBR Green I染色剂和碘化丙啶染色剂，作为空白对照样，再置于流式细胞仪中测定，输出二维点图作为参照图样，参照图样中45°方向形成杂质聚团；
(b)水样检测时，流式细胞仪同样输出结果并得到二维点图，依参照图样选定45°方向的散点聚团为杂质聚团，在杂质聚团的左右两侧，即FITC-A通道荧光强度稍强处(>102)以及7AAD-A通道荧光强度稍强处(>102)分别另有散点聚团，由于SYBR Green I在FITC-A通道处荧光较强，可以与所有的细菌细胞染色，而PI染料是在7AAD-A通道处荧光较强，它只能与死细胞结合，遮盖SYBR Green I的染色，故左上方区域为死细胞区，右下方区域为活细胞区，圈定位于右下方的活细胞区域，与流式细胞仪配套FlowJo软件会计算出活细胞区域内所占百分数，再乘以总的event数300000，即可得到四环素抗性细菌数。进一步的，除以进样体积即可得到水样中四环素抗性细菌浓度。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)测定结果更加准确可靠。本发明通过流式细胞仪染色法所测定的四环素抗性细菌包括了水中一些不能通过传统培养法培养出来的细菌，能更加全面地反映水中四环素抗性细菌的数量。
(2)测定过程更加便捷快速。本发明与传统培养法相比，不需要配制培养基以及稀释平板等操作，只需要进行染色和测定等操作，可以节省大量的人力。此外，整个测定过程省去了稀释平板法培养所需的时间，能够快速地对水中四环素抗性细菌进行测定。
附图说明
图1为空白对照样在流式细胞仪检测后的二维点图；
图2为水样在流式细胞仪检测后的二维点图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
以下各实施例中使用的SYBR Green I染色剂和PI染色剂均来自Life科技公司，英国；二甲基亚砜来源于Sigma，美国。其余试剂若无特别说明，则为常规市售产品或常规方法配置而成。
实施例1
(1)取待测水样10ml加入棕色试管中，加入四环素母液(1.6g/L)，使水样中四环素浓度等于其MIC值；
(2)将试管置于培养箱中，在27℃下培养24h；
(3)将500μL培养后的水样转移到流式细胞仪进样管中，为保证数据的准确性，作3个平行样并设置一个空白对照样，空白样中只加入10mL超纯水，再于平行样和空白对照样中分别加入SYBR Green I染色剂和PI染色剂进行染色，SYBR Green I染色剂加入之前先使用二甲基亚砜(Sigma，美国)稀释，稀释比例为1:100；先加入稀释后的SYBR Green I染色剂5μL，再加入PI染色剂1.5μL，在涡旋振荡器上充分震荡约5s，随后在37℃下避光培养10～15min；
(4)在流式细胞仪中对样品进行测定，激发光源选取488nm(20MW)，SYBR Green I染色细胞在533nm绿色荧光FL1通道下检测，PI染色细胞在670nm红色荧光FL2通道下检测；流式细胞仪的进样速度为中速，调整通道电压等参数，进行进样分析；当检测的总的events数为300000时，停止进样，并记录进样体积为10μL；测定结果运用FlowJo软件进行分析，结果具体见附图1。
从图1可以看出，加了染料后，纯水的二维直方图在45°方向上出现了类似火箭尾巴的图形，这部分可能是由于染料中自带的杂质颗粒，在激光激发作用下得以显示。从图2可以明显的看出，在45°方向的左右两侧，即FITC-A通道荧光强度稍强处(>102)以及7AAD-A通道荧光强度稍强处(>102)分别有散点聚团的现象，SYBR Green I在FITC-A通道处荧光较强，可以与所有的细菌细胞染色，而PI染料是在7AAD-A通道处显示，它只能与死细胞结合，遮盖SYBR Green I的染色，故左上方区域为死细胞区，右下方区域为活细胞区。通过方框选定活细胞区域之后，软件会自动计算区域内所占的百分数为2.42％，乘以总的event数300000即可得到具有四环素抗性的细菌数量为300000×2.42％＝4840。进一步的，除以进样体积即可得到水样中四环素抗性细菌浓度为4840/10×10-3＝4.84×10-3cells/mL。。
实施例2
(1)取待测水样10ml于250ml烧杯中，再加入90ml磷酸盐缓冲溶液(34g磷酸二氢钾，175ml氢氧化钠溶液(1mol/L)，825ml超纯水，pH＝7.2)。
(2)取稀释后的水样10ml加入棕色试管中，加入四环素母液100μL(1.6g/L)，使水样中四环素浓度等于其MIC值；
(3)将试管置于培养箱中，在27℃下培养24h；
(4)将500μL培养后的水样转移到流式细胞仪进样管中，为保证数据的准确性，作3个平行样并设置一个空白对照样，空白样中只加入10mL超纯水，再分别加入SYBR Green I染色剂和PI染色剂进行染色，SYBR Green I染色剂加入之前先使用二甲基亚砜(Sigma，美国)稀释，稀释比例为1:100；先加入稀释后的SYBR Green I染色剂5μL，再加入PI染色剂1.5μL，在涡旋振荡器上充分震荡约5s，随后在37℃下避光培养10～15min；
(5)在流式细胞仪中对样品进行测定，激发光源选取488nm(20MW)，SYBR Green I染色细胞在533nm绿色荧光FL1通道下检测，PI染色细胞在670nm红色荧光FL2通道下检测；流式细胞仪的进样速度为中速，调整通道电压等参数，进行进样分析；当检测的总的events数为300000时，停止进样，并记录进样体积；测定结果运用FlowJo软件进行分析。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种饮用水中四环素抗性细菌的流式细胞仪检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取待测水样加入棕色试管中，加入四环素母液，使待测水样中四环素浓度等于其MIC值，再将其置于培养箱中，在27℃下培养24h；
(2)取培养后的水样转移至流式细胞仪进样管中，加入SYBR Green I染色剂和碘化丙啶染色剂染色，充分震荡后37℃下避光培养10～15min；
(3)再将培养后的流式细胞仪进样管转移至流式细胞仪中，开始进样，并测定活细胞数，即四环素抗性细菌数，将测出的四环素抗性细菌数除以进样体积，即得到饮用水中四环素抗性细菌的浓度。
2.根据权利要求1所述的一种饮用水中四环素抗性细菌的流式细胞仪检测方法，其特征在于，步骤(1)中当待测水样中细菌浓度过高时，可采用稀释剂稀释，所述稀释剂为磷酸盐缓冲溶液，其配方为：34g磷酸二氢钾，175ml 1mol/L的氢氧化钠溶液，825ml超纯水，pH＝7.2。
3.根据权利要求1所述的一种饮用水中四环素抗性细菌的流式细胞仪检测方法，其特征在于，步骤(2)中SYBR Green I染色剂的加入量为5μL/500μL水样，碘化丙啶染色剂的加入量为1.5μL/500μL水样。
4.根据权利要求3所述的一种饮用水中四环素抗性细菌的流式细胞仪检测方法，其特征在于，所述的SYBR Green I染色剂通过以下方法制成：
取SYBR Green I染料置于灭菌后的离心管中，再加入二甲基亚砜稀释，制成SYBRGreen I工作储备液，置于-20℃冰箱中保存备用，使用时将SYBR Green I工作储备液取出融化并震荡均匀。
5.根据权利要求4所述的一种饮用水中四环素抗性细菌的流式细胞仪检测方法，其特征在于，SYBR Green I染料与二甲基亚砜的体积比为1:99，其中，二甲基亚砜预先采用0.22μm滤头过滤处理。
6.根据权利要求1所述的一种饮用水中四环素抗性细菌的流式细胞仪检测方法，其特征在于，步骤(3)中流式细胞仪的激发光源选取488nm(20MW)，进样速度为中速；
检测时，SYBR Green I染色细胞在533nm绿色荧光FITC-A通道通道下检测，PI染色细胞在670nm红色荧光7AAD-A通道通道下检测，当检测的总的events数为300000时，停止进样，并记录进样体积。
7.根据权利要求6所述的一种饮用水中四环素抗性细菌的流式细胞仪检测方法，其特征在于，所述的四环素抗性细菌数通过以下方法测出：
(a)取流式细胞仪进样管中加入超纯水、SYBR Green I染色剂和碘化丙啶染色剂，作为空白对照样，再置于流式细胞仪中测定，输出二维点图作为参照图样，参照图样中45°方向形成杂质聚团；
(b)水样检测时，流式细胞仪同样输出结果并得到二维点图，依参照图样选定45°方向的散点聚团为杂质聚团，在杂质聚团的左右两侧，即FITC-A通道荧光强度稍强处(>102)以及7AAD-A通道荧光强度稍强处(>102)分别另有散点聚团，圈定位于右下方的活细胞区域，计算出活细胞区域内所占百分数，再乘以总的event数300000，即可得到四环素抗性细菌数。
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