CN109082455A - 一种饮用水中总大肠菌群的快速检测方法 - Google Patents

一种饮用水中总大肠菌群的快速检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种饮用水中总大肠菌群的快速检测方法，使用大肠埃希氏标准菌株制备阳性对照样品，染色后通过流式细胞术分析，设置阈值、圈定总大肠菌群区域门；待测样品前处理后进行流式细胞术分析，根据阳性对照来确定参数计算样品中总大肠菌的细胞活性和数量。本发明通过流式细胞术，不仅能够有效快速的检测水体中总大肠菌群的总数，还能够通过特异性荧光染料，同时检测出不同细胞活性细菌：活体菌数、死亡菌数、受损菌数，科学地解析水体中总大肠菌群的实际活性状态，真实地反映饮用水中总大肠菌群的动态分布和潜在威胁。本发明的检测方法测定结果重复性好，精确度高，快速高效，可用于饮用水水质突发污染事件中总大肠菌群的检测。

Description

一种饮用水中总大肠菌群的快速检测方法
技术领域
本发明涉及一种饮用水总大肠菌群的快速检测方法，属于水质检测分析领域。
背景技术
总大肠菌群系指一群需氧及兼性厌氧的，在37℃生长时能使乳糖发酵，在24h内产酸产气的革兰氏阴性无芽孢杆菌。由于该类菌群是人和温血动物体内常见肠道菌，若水体检出该类菌，说明水体受到了人或动物的粪便直接或间接地污染。对人体健康具有潜在危害性，具有引起包括各种消化道传染病的可能性。大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性的大小，是饮用水和水源水的一个重要的卫生学指标。
《生活饮用水卫生标准生活饮用水标准检验方法》(GB/T 5750-2006)中总大肠菌群的检测方法包括多管发酵法、滤膜法、酶底物法。其中多管发酵法需72h检测阳性结果，滤膜法需48h检测阳性结果，酶底物法也需24h。三种方法均存在以下问题：(1)检测时间长，而且操作步骤繁琐；(2)都只能检测活体总大肠菌群，对受损状态的菌体无法分辨检测，而受损状态的细菌在条件适宜时，会自我修复后恢复致病性，重新造成饮用水的微生物污染。因此，传统总大肠菌群检测方法，具有局限性和不完全性。
发明内容
本发明旨在克服常规检测方法利用选择性培养基培养检测总大肠菌群时，检测时间长、检测步骤繁琐等缺陷，提供一种流式细胞术与荧光染色技术相结合，快速准确完成饮用水总大肠菌群计数以及活性鉴定方法，该方法测定结果重复性好，精确度高，快速高效，可用于饮用水水质突发污染事件中总大肠菌群的检测。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种饮用水中总大肠菌群的快速检测方法，包括使用大肠埃希氏标准菌株制备阳性对照样品，染色后通过流式细胞术分析，设置阈值、圈定总大肠菌群区域门；待测样品前处理后进行流式细胞术分析，根据阳性对照来确定参数计算样品中总大肠菌群的细胞活性和数量；具体方法步骤如下：
(一)阳性对照样品菌悬液区域门参数设置
(1)制备阳性对照样品菌悬液：以大肠埃希氏菌为标准菌株，接入已灭菌的LB肉汤培养液中，37℃培养16-20h，8000rpm/min离心5min，收集菌体加入1mLPBS缓冲液混匀，制成大肠埃希氏菌悬液并进行计数；根据计数结果以PBS缓冲液为稀释液，通过1:10、1:100梯度稀释法，制成终浓度为105-107cells/mL的阳性对照样品菌悬液；
(2)活体细胞区域门的圈定：取步骤(1)制备的阳性对照样品菌悬液0.5mL，加入荧光染料和绝对计数微球进行染色，然后进行流式细胞术分析，按照以下步骤圈门：
第一步，建立FSC-SSC散射光点图和等高线图，利用等高线图中的等高线分布，在FSC-SSC散射光点图中，设置FSC域值为350-500、SSC域值为300-330，圈出总大肠菌群区域门和Beads区域门；
第二步，建立FITC-PE-Texas Red荧光散点图，在Threshold参数设置中，设置FITC阈值大于200，排除大颗粒、非生物碎屑的干扰；
第三步，设置FITC阈值为450-500、PE-Texas Red阈值为580-620；
第四步，将FITC-PE-Texas Red荧光散点图中，FITC单阳区域细菌，圈定为活体细胞区域门；
(3)死亡细胞区域门的圈定：取步骤(1)制备的阳性对照样品菌悬液0.5mL灭活，加入荧光染料和绝对计数微球进行染色，然后进行流式细胞术分析，在步骤(2)第四步基础上，将FITC-PE-Texas Red荧光散点图中，PE-Texas Red单阳区域细菌，圈定为死亡细胞区域门；
(4)受损细胞区域门的圈定：在完成步骤(2)、(3)的FITC-PE-Texas Red荧光散点图中，将FITC和PE-Texas Red双阳区域的剩余细菌，圈定为受损细胞区域门；
(二)待测样品的处理
采集待测样品，经灭菌的滤膜过滤后，取PBS缓冲液，冲洗滤膜至无菌管，经300目筛网过滤得到待测样品浓缩液；取样品浓缩液0.5mL加入荧光染料和绝对计数微球进行染色，避光孵育；
所述待测样品与PBS缓冲液的体积比为10:1；
所述PBS缓冲液的pH值为7.2，经过0.20μm孔径滤膜过滤除菌后使用；
所述滤膜的规格为直径50mm，孔径0.45μm的醋酸纤维素滤膜；
(三)待测样品分析：按照步骤(一)阳性对照菌悬液区域门参数设置，将步骤(二)中完成染色的待测样品进行流式细胞术分析，采集信号并进行相关计算，计算公式如下：
总大肠菌群浓度＝活体菌浓度+死亡菌浓度+受损菌浓度；
经计算，分别得到待测样品的总大肠菌以及活体细胞、死亡细胞、受损细胞的浓度。
步骤中所述的荧光染料为噻唑橙和碘化丙啶，其加入量为：相当于在500μL样品中加入5.0μL浓度为42μmol/L的噻唑橙和5.0μL浓度为4.3mmol/L的碘化丙啶；
步骤中所述绝对计数微球的加入量为：相当于在500μL样品加入50μL浓度为103个/μL的绝对计数微球。
步骤中所述的染色为使用反向加样法向样品中加入荧光染料和绝对计数微球进行染色，黑暗静置孵育5-10min保证着色充分。
步骤中所述流式细胞术分析的设置为：最终收集10000个Events，当待测样品细胞总量不足10000个Events时，收集全部Events进行分析。
步骤中所述流式细胞术分析的采集和分析软件采用Becton Dickinson公司FACSDiva软件，应用液体计数微球测定总大肠菌群的绝对数量。
本发明通过流式细胞术，不仅能够有效快速的检测水体中总大肠菌群的总数，还能够通过特异性荧光染料，同时检测出不同细胞活性细菌(活体菌数、死亡菌数、受损菌数)，更加科学的解析水体中总大肠菌群的实际活性状态，更加真实的反映饮用水中总大肠菌群的动态分布和潜在威胁。本发明的检测方法测定结果重复性好，精确度高，快速高效，可用于饮用水水质突发污染事件中总大肠菌群的检测。
附图说明
图1为实施例1梯度2菌悬液检测——FSC-SSC散射光点图，其中：P1为总大肠菌群区域门，P2为Beads区域门；
图2为实施例1梯度2菌悬液检测——FITC-PE-Texas Red荧光散点图，其中：live为活体细胞区域门，dead为死亡细胞区域门，injured为受损细胞区域门；
图3为实施例3污染样品中总大肠菌群的检测——FSC-SSC散射光点图，其中：P1为总大肠菌群区域门，P2为Beads区域门；
图4为实施例3污染样品中总大肠菌群的检测——FITC-PE-Texas Red荧光散点图，其中：live为活体细胞区域门，dead为死亡细胞区域门，injured为受损细胞区域门；
图5为实施例4消毒剂处理后水样中总大肠菌群的检测——FSC-SSC散射光点图，其中，P1为总大肠菌群区域门，P2为Beads区域门；
图6为实施例4消毒剂处理后水样中总大肠菌群的检测——FITC-PE-Texas Red荧光散点，其中：live为活体细胞区域门，dead为死亡细胞区域门，injured为受损细胞区域门。
具体实施方式
下面通过具体实施例及附图对本发明进行进一步的阐述，但下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。
实施例1方法检出限的确认
本具体实施例采用如下步骤：
(一)阳性对照样品菌悬液区域门参数设置
(1)制备阳性对照样品菌悬液：以大肠埃希氏菌为标准菌株，接入已灭菌的LB肉汤培养液中，37℃培养16-20h，8000rpm/min离心5min，收集菌体加入1mLPBS缓冲液混匀，制成大肠埃希氏菌悬液并进行计数；根据计数结果以PBS缓冲液为稀释液，通过1:10、1:100梯度稀释法，制成终浓度为105-107cells/mL的阳性对照样品菌悬液；
(2)活体细胞区域门的圈定：取步骤(1)制备的阳性对照样品菌悬液中，采用反向加样法加入荧光染料和绝对计数微球进行染色，在500μL样品加入5.0μL浓度为42μmol/L的噻唑橙、5.0μL浓度4.3mmol/L的碘化丙啶和50μL浓度为103个/μL的绝对计数微球，然后进行流式细胞术分析，收集10000个Events，按照以下步骤圈门：
第一步，建立FSC-SSC散射光点图和等高线图，利用等高线图中的等高线分布，在FSC-SSC散射光点图中，设置FSC域值(350-500)和SSC域值(300-330)，圈出总大肠菌群区域门和Beads区域门；
第二步，建立FITC-PE-Texas Red荧光散点图，在Threshold参数设置中，设置FITC阈值大于200，排除大颗粒、非生物碎屑的干扰；
第三步，设置FITC阈值(450-500)和PE-Texas Red阈值(580-620)；
第四步，将FITC-PE-Texas Red荧光散点图中，FITC单阳区域细菌，圈定为活体细胞区域门；
(3)死亡细胞区域门的圈定：取步骤(1)制备的阳性对照样品菌悬液灭活，采用反向加样法加入荧光染料和绝对计数微球进行染色，在500μL样品加入5.0μL浓度为42μmol/L的噻唑橙、5.0μL浓度4.3mmol/L的碘化丙啶和50μL浓度为103个/μL的绝对计数微球，然后进行流式细胞术分析，收集10000个Events，在步骤(2)第四步基础上，将FITC-PE-TexasRed荧光散点图中，PE-Texas Red单阳区域细菌，圈定为死亡细胞区域门；
(4)受损细胞区域门的圈定：在完成步骤(2)、(3)的FITC-PE-Texas Red荧光散点图中，将FITC和PE-Texas Red双阳区域的剩余细菌，圈定为受损细胞区域门；
(二)待测样品的处理
将终浓度为105-107cells/mL的阳性对照样品菌悬液，通过1:10、1:100、1:1000、1:10000依次梯度稀释，得到四组梯度稀释待测样品，经300目筛网过滤后，采用反向加样法分别加入荧光染料和绝对计数微球进行染色，在500μL样品加入5.0μL浓度为42μmol/L的噻唑橙、5.0μL浓度4.3mmol/L的碘化丙啶和50μL浓度为103个/μL的绝对计数微球，避光孵育；
(三)待测样品分析：
按照步骤(一)阳性对照菌悬液区域门参数设置，将步骤(二)中完成染色的四组梯度稀释待测样品进行流式细胞术分析，收集10000个Events，采集信号并进行相关计算，分别得到待测样品的活体细胞、死亡细胞及受损细胞的浓度；
(四)酶底物法检测：
同时将步骤(二)中的四组梯度稀释待测样品，按照《生活饮用水卫生标准生活饮用水标准检验方法》(GB/T 5750-2006)中的酶底物法进行总大肠菌群检测；
(五)结果比对：通过与酶底物法检测结果比对发现，本方法在检测梯度1至梯度2菌悬液时，与酶底物法检测结果相对偏差为1.5％-29％，在检测梯度3、梯度4菌悬液时，与酶底物法的检测值差异较大，检测结果见表1；
表1方法检出限的确认
其中，酶底物法检测时间24h，流式细胞术检测时间20min。
(六)方法检出限：
结合方法比对结果，流式细胞仪检测总大肠菌群的检出限为104cells/mL，根据样品浓缩倍数，即水样中含有总大肠菌群105cells/100mL时，使用本方法可以检出。如图1、图2。
实施例2管网水样品中总大肠菌群的检测
本具体实施例采用如下步骤：
(一)阳性对照样品菌悬液区域门参数设置
(1)制备阳性对照样品菌悬液：以大肠埃希氏菌为标准菌株，接入已灭菌的LB肉汤培养液中，37℃培养16-20h，8000rpm/min离心5min，收集菌体加入1mLPBS缓冲液混匀，制成大肠埃希氏菌悬液并进行计数；根据计数结果以PBS缓冲液为稀释液，通过1:10、1:100梯度稀释法，制成终浓度为105-107cells/mL的阳性对照样品菌悬液；
(2)活体细胞区域门的圈定：取步骤(1)制备的阳性对照样品菌悬液中，采用反向加样法加入荧光染料和绝对计数微球进行染色，在500μL样品加入5.0μL浓度为42μmol/L的噻唑橙、5.0μL浓度4.3mmol/L的碘化丙啶和50μL浓度为103个/μL的绝对计数微球，然后进行流式细胞术分析，收集10000个Events，按照以下步骤圈门：
第一步，建立FSC-SSC散射光点图和等高线图，利用等高线图中的等高线分布，在FSC-SSC散射光点图中，设置FSC域值(350-500)和SSC域值(300-330)，圈出总大肠菌群区域门和Beads区域门；
第二步，建立FITC-PE-Texas Red荧光散点图，在Threshold参数设置中，设置FITC阈值大于200，排除大颗粒、非生物碎屑的干扰；
第三步，设置FITC阈值(450-500)和PE-Texas Red阈值(580-620)；
第四步，将FITC-PE-Texas Red荧光散点图中，FITC单阳区域细菌，圈定为活体细胞区域门；
(3)死亡细胞区域门的圈定：取步骤(1)制备的阳性对照样品菌悬液灭活，采用反向加样法加入荧光染料和绝对计数微球进行染色，在500μL样品加入5.0μL浓度为42μmol/L的噻唑橙、5.0μL浓度4.3mmol/L的碘化丙啶和50μL浓度为103个/μL的绝对计数微球，然后进行流式细胞术分析，收集10000个Events，在步骤(2)第四步基础上，将FITC-PE-TexasRed荧光散点图中，PE-Texas Red单阳区域细菌，圈定为死亡细胞区域门；
(4)受损细胞区域门的圈定：在完成步骤(2)、(3)的FITC-PE-Texas Red荧光散点图中，将FITC和PE-Texas Red双阳区域的剩余细菌，圈定为受损细胞区域门；
(二)待测样品的处理
采集待测管网水样品，经灭菌的滤膜过滤后，取PBS缓冲液，冲洗滤膜至无菌管，经300目筛网过滤得到待测样品浓缩液；取样品浓缩液采用反向加样法加入荧光染料和绝对计数微球进行染色，在500μL样品加入5.0μL浓度为42μmol/L的噻唑橙、5.0μL浓度4.3mmol/L的碘化丙啶和50μL浓度为103个/μL的绝对计数微球，避光孵育；
(三)待测样品分析：按照步骤(一)阳性对照菌悬液区域门参数设置，将步骤(二)中完成染色的待测样品进行流式细胞术分析，收集全部的Events，采集信号并进行相关计算，分别得到待测样品的活体细胞、死亡细胞及受损细胞的浓度；
(四)酶底物法检测：
同时将步骤(二)中的待测样品浓缩液，按照《生活饮用水卫生标准生活饮用水标准检验方法》(GB/T 5750-2006)中的酶底物法进行总大肠菌群检测；
(五)结论：
酶底物法和流式细胞术检测(二)待测样品，结果都为未检出，具体见表2；
表2实际管网水检测
其中，酶底物法检测时间24h，流式细胞术检测时间20min。
实施例3模拟污染水样中总大肠菌群的检测
本具体实施例采用如下步骤：
(一)阳性对照样品菌悬液区域门参数设置
(1)制备阳性对照样品菌悬液：以大肠埃希氏菌为标准菌株，接入已灭菌的LB肉汤培养液中，37℃培养16-20h，8000rpm/min离心5min，收集菌体加入1mLPBS缓冲液混匀，制成大肠埃希氏菌悬液并进行计数；根据计数结果以PBS缓冲液为稀释液，通过1:10、1:100梯度稀释法，制成终浓度为105-107cells/mL的阳性对照样品菌悬液；
(2)活体细胞区域门的圈定：取步骤(1)制备的阳性对照样品菌悬液中，采用反向加样法加入荧光染料和绝对计数微球进行染色，在500μL样品加入5.0μL浓度为42μmol/L的噻唑橙、5.0μL浓度4.3mmol/L的碘化丙啶和50μL浓度为103个/μL的绝对计数微球，然后进行流式细胞术分析，收集10000个Events，按照以下步骤圈门：
第一步，建立FSC-SSC散射光点图和等高线图，利用等高线图中的等高线分布，在FSC-SSC散射光点图中，设置FSC域值(350-500)和SSC域值(300-330)，圈出总大肠菌群区域门和Beads区域门；
第二步，建立FITC-PE-Texas Red荧光散点图，在Threshold参数设置中，设置FITC阈值大于200，排除大颗粒、非生物碎屑的干扰；
第三步，设置FITC阈值(450-500)和PE-Texas Red阈值(580-620)；
第四步，将FITC-PE-Texas Red荧光散点图中，FITC单阳区域细菌，圈定为活体细胞区域门；
(3)死亡细胞区域门的圈定：取步骤(1)制备的阳性对照样品菌悬液灭活，采用反向加样法加入荧光染料和绝对计数微球进行染色，在500μL样品加入5.0μL浓度为42μmol/L的噻唑橙、5.0μL浓度4.3mmol/L的碘化丙啶和50μL浓度为103个/μL的绝对计数微球，然后进行流式细胞术分析，收集10000个Events，在步骤(2)第四步基础上，将FITC-PE-TexasRed荧光散点图中，PE-Texas Red单阳区域细菌，圈定为死亡细胞区域门；
(4)受损细胞区域门的圈定：在完成步骤(2)、(3)的FITC-PE-Texas Red荧光散点图中，将FITC和PE-Texas Red双阳区域的剩余细菌，圈定为受损细胞区域门；
(二)待测样品的处理
采集某管网水样品，经灭菌的滤膜过滤后，取PBS缓冲液，冲洗滤膜至无菌管，采用反向加样法加入1mL终浓度为105-107cells/mL的阳性对照样品菌悬液，旋涡震荡混匀，经300目筛网过滤得到待测样品浓缩液；取样品浓缩液加入荧光染料和绝对计数微球进行染色，在500μL样品加入5.0μL浓度为42μmol/L的噻唑橙、5.0μL浓度4.3mmol/L的碘化丙啶和50μL浓度为103个/μL的绝对计数微球，避光孵育；
(三)待测样品分析：按照步骤(一)阳性对照菌悬液区域门参数设置，将步骤(二)中完成染色的待测样品进行流式细胞术分析，收集10000个Events，采集信号并进行相关计算，分别得到待测样品的活体细胞、死亡细胞及受损细胞的浓度，检测结果见表3；
表3污染水样检测
(四)结论：
由此可见，流式细胞术应用于受污染饮用水的总大肠菌群检测，能快速准确识别污染，可靠反映受污染水中总大肠菌群的状态。如图3、图4。
实施例4氯消毒水样中总大肠菌群的检测
本具体实施例采用如下步骤：
(一)阳性对照样品菌悬液区域门参数设置
(1)制备阳性对照样品菌悬液：以大肠埃希氏菌为标准菌株，接入已灭菌的LB肉汤培养液中，37℃培养16-20h，8000rpm/min离心5min，收集菌体加入1mLPBS缓冲液混匀，制成大肠埃希氏菌悬液并进行计数；根据计数结果以PBS缓冲液为稀释液，通过1:10、1:100梯度稀释法，制成终浓度为105-107cells/mL的阳性对照样品菌悬液；
(2)活体细胞区域门的圈定：取步骤(1)制备的阳性对照样品菌悬液中，采用反向加样法加入荧光染料和绝对计数微球进行染色，在500μL样品加入5.0μL浓度为42μmol/L的噻唑橙、5.0μL浓度4.3mmol/L的碘化丙啶和50μL浓度为103个/μL的绝对计数微球，然后进行流式细胞术分析，收集10000个Events，按照以下步骤圈门：
第一步，建立FSC-SSC散射光点图和等高线图，利用等高线图中的等高线分布，在FSC-SSC散射光点图中，设置FSC域值(350-500)和SSC域值(300-330)，圈出总大肠菌群区域门和Beads区域门；
第二步，建立FITC-PE-Texas Red荧光散点图，在Threshold参数设置中，设置FITC阈值大于200，排除大颗粒、非生物碎屑的干扰；
第三步，设置FITC阈值(450-500)和PE-Texas Red阈值(580-620)；
第四步，将FITC-PE-Texas Red荧光散点图中，FITC单阳区域细菌，圈定为活体细胞区域门；
(3)死亡细胞区域门的圈定：取步骤(1)制备的阳性对照样品菌悬液灭活，采用反向加样法加入荧光染料和绝对计数微球进行染色，在500μL样品加入5.0μL浓度为42μmol/L的噻唑橙、5.0μL浓度4.3mmol/L的碘化丙啶和50μL浓度为103个/μL的绝对计数微球，然后进行流式细胞术分析，收集10000个Events，在步骤(2)第四步基础上，将FITC-PE-TexasRed荧光散点图中，PE-Texas Red单阳区域细菌，圈定为死亡细胞区域门；
(4)受损细胞区域门的圈定：在完成步骤(2)、(3)的FITC-PE-Texas Red荧光散点图中，将FITC和PE-Texas Red双阳区域的剩余细菌，圈定为受损细胞区域门；
(二)待测样品的处理
采集某管网水样品，经灭菌的滤膜过滤后，取PBS缓冲液，冲洗滤膜至无菌管，加入1mL终浓度为105-107cells/mL的阳性对照样品菌悬液，旋涡震荡混匀，加入终浓度2.5mg/L次氯酸钠溶液消毒1min，加入过量硫代硫酸钠溶液中和余氯，经300目筛网过滤得到待测样品浓缩液；取样品浓缩液采用反向加样法加入荧光染料和绝对计数微球进行染色，在500μL样品加入5.0μL浓度为42μmol/L的噻唑橙、5.0μL浓度4.3mmol/L的碘化丙啶和50μL浓度为103个/μL的绝对计数微球，避光孵育；
(三)待测样品分析：按照步骤(一)阳性对照菌悬液区域门参数设置，将步骤(二)中完成染色的待测样品进行流式细胞术分析，收集10000个Events，采集信号并进行相关计算，分别得到待测样品的活体细胞、死亡细胞及受损细胞的浓度，检测结果见表4；
表4消毒水样检测
(四)结论：
由此可见，总大肠菌群在次氯酸钠1min消毒后，有大量细菌处于受损状态，其在条件适宜时，可能会自我修复后恢复致病性，重新造成饮用水的微生物污染。流式细胞术测定总大肠菌群应用于耐氯菌消毒实验，具有快速、准确、直观反映消毒实验中菌的状态等优点。如图5、图6。

Claims (9)

1.一种饮用水中总大肠菌群的快速检测方法，其特征在于，使用大肠埃希氏标准菌株制备阳性对照样品，染色后通过流式细胞术分析，设置阈值、圈定总大肠菌群区域门；待测样品前处理后进行流式细胞术分析，根据阳性对照来确定参数计算样品中总大肠菌的细胞活性和数量；具体方法步骤如下：
(一)阳性对照样品菌悬液区域门参数设置
(1)制备阳性对照样品菌悬液：以大肠埃希氏菌为标准菌株，接入已灭菌的LB肉汤培养液中，37℃培养16-20h，8000rpm/min离心5min，收集菌体加入1mLPBS缓冲液混匀，制成大肠埃希氏菌悬液并进行计数；根据计数结果以PBS缓冲液为稀释液，通过1:10、1:100梯度稀释法，制成终浓度为105-107cells/mL的阳性对照样品菌悬液；
(2)活体细胞区域门的圈定：取步骤(1)制备的阳性对照样品菌悬液中，加入荧光染料和绝对计数微球进行染色，然后进行流式细胞术分析，按照以下步骤圈门：
第一步，建立FSC-SSC散射光点图和等高线图，利用等高线图中的等高线分布，在FSC-SSC散射光点图中，设置FSC域值为350-500、SSC域值为300-330，圈出总大肠菌群区域门和Beads区域门；
第二步，建立FITC-PE-Texas Red荧光散点图，在Threshold参数设置中，设置FITC阈值大于200，排除大颗粒、非生物碎屑的干扰；
第三步，设置FITC阈值为450-500、PE-Texas Red阈值为580-620；
第四步，将FITC-PE-Texas Red荧光散点图中，FITC单阳区域细菌，圈定为活体细胞区域门；
(3)死亡细胞区域门的圈定：取步骤(1)制备的阳性对照样品菌悬液灭活，加入荧光染料和绝对计数微球进行染色，然后进行流式细胞术分析，在步骤(2)第四步基础上，将FITC-PE-Texas Red荧光散点图中，PE-Texas Red单阳区域细菌，圈定为死亡细胞区域门；
(4)受损细胞区域门的圈定：在完成步骤(2)、(3)的FITC-PE-Texas Red荧光散点图中，将FITC和PE-Texas Red双阳区域的剩余细菌，圈定为受损细胞区域门；
(二)待测样品的处理
采集待测样品，经灭菌的滤膜过滤后，取PBS缓冲液，冲洗滤膜至无菌管，经300目筛网过滤得到待测样品浓缩液；取样品浓缩液加入荧光染料和绝对计数微球进行染色，避光孵育；
(三)待测样品分析：按照步骤(一)阳性对照菌悬液区域门参数设置，将步骤(二)中完成染色的待测样品进行流式细胞术分析，采集信号并进行相关计算，计算公式如下：
总大肠菌群浓度＝活体菌浓度+死亡菌浓度+受损菌浓度；
经计算，分别得到待测样品的总大肠菌以及活体细胞、死亡细胞、受损细胞的浓度。
2.根据权利要求1所述的饮用水中总大肠菌群的快速检测方法，其特征在于，步骤(二)中待测样品与PBS缓冲液的体积比为10:1。
3.根据权利要求1所述的饮用水中总大肠菌群的快速检测方法，其特征在于，步骤(二)所述灭菌的滤膜的规格为直径50mm，孔径0.45μm的醋酸纤维素滤膜。
4.根据权利要求1所述的饮用水中总大肠菌群的快速检测方法，其特征在于，步骤中所述PBS缓冲液的pH值为7.2，经过0.20μm孔径滤膜过滤除菌后使用。
5.根据权利要求1所述的饮用水中总大肠菌群的快速检测方法，其特征在于，步骤中所述的荧光染料为噻唑橙和碘化丙啶，其加入量为：相当于在500μL样品中加入5.0μL浓度为42μmol/L的噻唑橙和5.0μL浓度为4.3mmol/L的碘化丙啶。
6.根据权利要求1所述的饮用水中总大肠菌群的快速检测方法，其特征在于，步骤中所述绝对计数微球的加入量为：相当于在500μL样品加入50μL浓度为103个/μL的绝对计数微球。
7.根据权利要求1所述的饮用水中总大肠菌群的快速检测方法，其特征在于，步骤(一)的(2)和(3)所述菌悬液及步骤(二)中所述浓缩液的取用量为0.5mL，所述的染色为使用反向加样法向样品中加入荧光染料和绝对计数微球进行染色，黑暗静置孵育5-10min保证着色充分。
8.根据权利要求1所述的饮用水中总大肠菌群的快速检测方法，其特征在于，步骤(一)的(2)和(3)中，所述流式细胞术分析的设置为：最终收集10000个Events，当待测样品细菌浓度不足10000个Events时，收集全部Events进行分析。
9.根据权利要求1-8任一项所述的饮用水中总大肠菌群的快速检测方法，其特征在于，步骤中所述流式细胞术分析的采集和分析软件采用Becton Dickinson公司FACSDiva软件，应用液体计数微球测定总大肠菌群的绝对数量。
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