CN104777091A - 基于流式细胞术测定浅水湖泊中异养细菌大小的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明的目的是建立一种快速测定浅水湖泊总异养细菌大小的方法，是一种基于流式细胞术的测定细菌大小的方法。首先将样品固定、超声、过滤、SYBRGreenⅠ染色，然后通过流式细胞仪来检测异养细菌，根据流式细胞仪的前向散射光（FSC，反映细胞大小）来测定样品中异养细菌的FSC值，再通过建立标准微球粒径与FSC值的关系，绘制细菌大小的标准曲线，建立回归分析方程，最后通过样品中异养细菌的前向散射光（FSC）值，换算成样品中异养细菌的大小。
Description
技术领域
本发明属于环境微生物学领域，涉及一种在浅水湖泊中针对异养细菌大小的检测方法，通过与流式细胞技术相结合，建立一种应用于大型浅水湖泊异养细菌大小的快速检测方法。
背景技术
细菌是湖泊生态系统中食物网和食物链的重要组成部分，在湖泊生态系统的生物地球化学循环和能量流动过程中发挥着重要作用。它们不仅分解有机化合物释放能量，而且能利用藻类所无法吸收的DOM，将之转化为POM，进行二次生产，提高湖泊生态系统总的生态效率。所以，估算细菌的生物量对于研究湖泊生态系统是十分重要的。细菌的菌体大小是指细菌的体积，计算细菌生物量大部分通过转换系数把细菌体积转换成生物量。因此，细菌大小是细菌生物量估算的过渡性参数，是湖泊微生物研究的一个关键参数。
细菌菌体大小的测定方法目前最常用的是荧光显微镜和电子显微镜法。荧光显微镜技术是利用荧光探针将细菌细胞与其他颗粒区分开来，从而达到检测目的。但是光学显微镜的分辨率有限，难以准确测定很小的细菌。电子显微镜有较高的分辨率和放大倍数，小的细菌也能被确定的测定。但是它的处理步骤繁琐，而且细菌细胞在处理过程中易发生皱缩和扭曲，细菌大小很可能在测定过程中产生误差。
流式细胞术测定细菌大小是一种新兴的方法，它是与荧光探针相结合区分细菌与其他颗粒细胞。这种方法对细菌细胞个体大小的分析是以收集到小角度的前向散射光(FSC)与细菌的大小和形状等之间的相关性为基础的。通过流式细胞仪测定法对单个细胞的散射光信号进行检测可应用于不规则细菌种群，特别是小细菌大小的测定。目前通过流式细胞术测定异养细菌大小大部分应用于海洋生态系统，尚未有将流式细胞技术应用于湖泊，特别是浅水富营养化湖泊上的相关报道。而由于湖泊水体中存在大量的颗粒和固相物质，包括很多非生物颗粒，细胞碎屑等，它们会对流式细胞仪造成很大的干扰，背景噪音也随之提高，流式细胞仪分析的难度也加大，已有技术无法有效用于富营养化湖泊异养细菌的快速检索，有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明旨在克服针对目前荧光显微镜和电子显微镜检测细菌大小存在的众多缺陷，提供一种通过与流式细胞技术相结合快速准确检测浅水湖泊异养细菌大小的方法，该方法测定速度快，灵敏度高，仪器精确度高，测定过程干扰小，重复性好，数据的准确性高(统计学上)，可开展大规模的生态学调查。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种基于流式细胞术测定浅水湖泊中异养细菌大小的方法，包括以下步骤：
(1)样品固定：在待测样品中加入终体积浓度为0.5-1.5％，优选1％的固定剂，避光2-4小时；
(2)样品前处理：吸取至少500ul样品，用无菌水1:8-1:12，优选1:10稀释后进行超声波处理；
(3)样品染色：吸取1ml样品，在样品中加入特异性核酸染料SYBR Green Ⅰ，避光静置，以使DNA着色；
(4)样品的流式细胞分析：将样品管放置于流式细胞仪的样品台上，通过流式细胞仪对样品进行测试，采集前向散射光FSC、侧向散射光SSC、FL1通道的核酸染料SYBR Green Ⅰ绿色荧光信号、FL3通道的自养浮游生物的叶绿素a红色荧光信号数据；其中以核酸染料SYBR Green Ⅰ绿色荧光信号设置域值，利用绿色荧光信号将浅水湖泊中的浮游生物与非生物颗粒、细胞碎屑区分开来，同时根据FL3通道采集的自养浮游生物的叶绿素a的红色荧光信号，将细菌与浮游藻类区分开来，最后通过流式细胞仪测试异养细菌的FSC值代表细菌大小；
(5)细菌大小标准曲线的绘制：选取多种粒径规格标准绿色微球，利用流式细胞仪分别进行测试，采集前向散射光(FSC,反映细胞大小)、侧向散射光(SSC，反映细胞内部结构)、FL1通道的绿色荧光信号。通过多次测定它们的FSC值，建立细胞粒径与FSC的关系，制作细菌大小的标准曲线，建立回归分析方程，计算相关系数。再通过样品中异养细菌的前向散射光(FSC)值，换算成异养细菌的大小。
(6)数据分析：通过流式细胞仪分析软件分析采集到的数据，利用前向散射光与侧向散射光的不同，排除微型浮游生物对细菌检测的影响；依据核酸染料SYBR Green Ⅰ绿色荧光信号的强弱，将浮游生物与非生物颗粒、细胞碎屑区分开来；根据自养浮游生物的叶绿素a红色荧光信号的强弱，将细菌与浮游藻类区分开来，从而获得目标对象样品中的异养细菌，通过流式细胞仪得到异养细菌前向散射光FSC值，再根据细菌大小的标准曲线计算出样品中异养细菌的大小。
其中，所述的固定剂为甲醛，多聚甲醛或戊二醛中的一种，优选甲醛。
其中所述的超声波处理条件Es＝P*t/V＝1400-1600KJ/L，优选1500KJ/L，其中P为超声功率，t为超声时间，V为样品体积。其中超声功率P为25W，超声时间t为5min，样品体积V为5ml。
本发明在试验阶段设置了超声功率P为25W，样品体积V为5ml，超声时间t为0、2、4、6、8、10、20、30min，从附图1得知，采样点N2，S2这两个样品在超声时间为4-6min时，细菌的绿色荧光强度和总细菌数都是保持相对稳定，故本发明最优选采用的超声时间为5min。
步骤(3)中向样品中加入特异性核酸染料SYBR Green Ⅰ对其进行染色；黑暗静置15-30min以使DNA着色。
所述的特异性核酸染料SYBR Green Ⅰ先用TE进行1:100稀释作为母液，漩涡振荡30s，再取母液进行1:100稀释，至特异性核酸染料SYBR Green Ⅰ终浓度为10-4，向1ml样品中加入10uL母液使特异性核酸染料SYBR Green Ⅰ终浓度为10-4，黑暗静置20min以使DNA着色。
所述步骤(4)利用流式细胞仪对样品进行分析时，根据纯培养细菌在流式细胞图中的分布位置，调节各个检测器的电压值，调整仪器的设置，将样品置于流式细胞仪样品管中，流速控制在每秒1000个细胞以内，共收集20000个细胞。
其中，所述步骤5包括：吸取0.5um,0.8um,1um,3um,6um多种粒径规格标准微球(Polysciences,美国)各1ul,用无菌水1:100稀释后涡旋振荡，充分混匀后分别通过流式细胞仪进行测试，调节各个检测器的电压，直至在散点图(FSC,SSC)和散点图(FL1,SSC)和柱状图(FSC)上清晰可见(如图1)，流速控制在每秒1000个细胞以内，共收集20000个细胞。
其中，所述步骤6中流式细胞仪分析软件采用Becton Dickinson公司开发的CellQuest软件，记录下多种标准粒径微球前向散射光(FSC)信号数据,建立标准微球粒径与FSC值的关系，制作细菌大小的标准曲线，建立回归分析方程，计算相关系数(如图2)。再通过样品中异养细菌的前向散射光(FSC)值，换算成异养细菌的大小。
与现有荧光显微镜测定细菌大小相比，本发明具有以下突出优点：
(1)本发明方法测试速度快，所用时间短，一般1min左右完成一个样品测试，比荧光显微镜方法省时省力，能快速检测出浅水湖泊中异养细菌的大小，非常适合开展大规模生态学调查。
(2)本发明方法精确度高，重复性好，通过统一的荧光小球来校正仪器的散射光和荧光值的变化率(CV值)，可使CV值调节小于3％，比荧光显微镜方法更具客观性。
(3)本发明根据流式细胞技术能够同一时间获取多参数信息的特点，利用蓝藻和绿藻等浮游自养生物含有叶绿素，而异养细菌不含有叶绿素的特点，将一些超微型的蓝绿藻与异养细菌区分开来，从而排除超微型蓝绿藻的影响，准确测定异养细菌的大小，为评价异养细菌在水生生态系统中的重要作用提供可靠依据。
附图说明
图1.图1超声条件对样品异养细菌数量和核酸染料SYBRGreen Ⅰ绿色荧光强度的影响。其中：
A:太湖N2点超声条件对异养细菌绿色荧光强度的影响；
B:太湖S2点超声条件对异养细菌绿色荧光强度的影响；
C:太湖N2点超声条件对异养细菌数量的影响；
D:太湖S2点超声条件对异养细菌数量的影响。
图2.不同标准粒径微球的流式图
图3.细菌大小的标准曲线.其中X，Y分别为FSC和细菌粒径的对数值，即X为Log FSC，Y为Log size，曲线为数据最佳回归关系。
图4.太湖采样位置图
图5.太湖细菌大小流式细胞结果曲线图
具体实施方式
以下实施例对本发明做进一步的说明，但不用来限制本发明的范围。若为特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1荧光微球大小的验证
用标准荧光小球对流式细胞仪进行调节校正，调节液流系统和光学系统，使标准荧光小球在各个检测器通道检测到的荧光信号变异系数低于3％。
选取0.5um，0.8um，1um，3um，6um多种粒径规格标准绿色微球(Polysciences,美国)，利用流式细胞仪分别进行测试，采集前向散射光(FSC，反映细胞大小)、侧向散射光(SSC，反映细胞内部结构)、FL1通道的绿色荧光信号。流速控制在每秒1000个细胞以内，共收集20000个细胞。通过多次测定它们的FSC值，建立细胞粒径与FSC的关系，制作细菌大小的标准曲线，建立回归分析方程，计算相关系数(如图2)。
选取几种已知粒径大小的荧光微球：Nile red beads(2.49μm，BD公司)，Rainbow fluorescent beads(3.0um，BD公司)，利用流式细胞仪分别进行测试，采集前向散射光(FSC)、侧向散射光(SSC)信号，做三个平行，结果如下：Nile小球的FSC值分别为199296，200098，200023，代入标准曲线方程式计算出大小分别为2.4785um，2.4852um，2.4846um，与理论值进行t检验分析结果显示不存在显著性差异(P>0.05)；Rainbow小球的FSC值分别为265087，264468，263654，代入标准曲线方程式计算出大小分别为3.0135um，3.0086um，3.0021um，与理论值进行t检验分析结果显示不存在显著性差异(P>0.05)。
实施例2大型浅水富营养化湖泊太湖中的细菌大小
本实施例测定大型浅水富营养化湖泊太湖中的细菌大小，具体包括如下步骤：
(1)2014年2月，用采水器从太湖中采集每个点位的表层水样，一共32个样品(如图3)，采装入预先灭好菌的EP管中，加入终体积浓度为1％的固定剂甲醛，保温箱冷藏运输回实验室。
(2)吸取至少500μl样品，用灭菌水1:10稀释后混匀。吸取5ml样品通过超声波清洗仪(功率为25W)超声5min，打散成团和附着在其他生物上的异养细菌。过300目筛绢去除大颗粒杂质。
(3)吸取步骤(2)处理得到的样品1ml,加入10μl 100×的SYBRGreen Ⅰ染料，避光染色20min。
(4)用标准荧光小球对流式细胞仪进行调节校正，调节液流系统和光学系统，使标准荧光小球在各个检测器通道检测到的荧光信号变异系数低于3％。
根据纯培养细菌在流式细胞图中的分布位置，调节各个检测器的电压值，将仪器的设置调整到合适的状态。取1ml样品置于流式细胞仪样品管中，采集流式细胞仪的前向散射光(FSC)、侧向散射光(SSC)、核酸染料SYBRGreen Ⅰ荧光信号(FL1)、浮游藻类的自发叶绿素荧光信号(FL3)等信号，流速控制在每秒1000个细胞以内，共收集20000个细胞。
(5)选取0.5um,0.8um,1um,3um,6um多种粒径规格标准绿色微球(Polysciences，美国)，利用流式细胞仪分别进行测试，采集前向散射光(FSC，反映细胞大小)、侧向散射光(SSC，反映细胞内部结构)、FL1通道的绿色荧光信号。流速控制在每秒1000个细胞以内，共收集20000个细胞。通过多次测定它们的FSC值，建立细胞粒径与FSC的关系，制作细菌大小的标准曲线，建立回归分析方程，计算相关系数(如图2)。
(6)通过流式细胞仪分析软件(BD CellQuest)分析采集到的数据，利用前向散射光与侧向散射光的不同，排除微型浮游生物对细菌检测的影响；而依据核酸染料SYBR Green Ⅰ绿色荧光信号的强弱，将浮游生物与非生物颗粒、细胞碎屑区分开来；根据自养浮游生物的叶绿素a红色荧光信号的强弱，将细菌与浮游藻类区分开来，从而得到样品中的异养细菌，再根据其FSC值，计算出样品中细菌的大小。比如2月份0号采样点，流式FSC得到的数据为8531，Log FSC为3.931，代入回归曲线方程式，计算得到Y为-0.23279，再换算为细菌大小，得到细菌大小为0.585um。细菌大小结果显示(如图4)太湖水体中异养细菌数量基本都在0.5-2um之间，但不同位点间的大小还是存在显著差异(由客观情况本身决定)。
Claims (10)
1.一种基于流式细胞术测定浅水湖泊中异养细菌大小的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）样品固定：在待测样品中加入终体积浓度为0.5-1.5%，优选1%的固定剂，避光2-4小时；
（2）样品前处理：吸取至少500μl样品，用无菌水1:8-1:12，优选1:10稀释后进行超声波处理；
（3）样品染色：吸取1ml样品，在样品中加入特异性核酸染料SYBR Green Ⅰ，避光静置；
（4）样品的流式细胞分析：将样品管放置于流式细胞仪的样品台上，通过流式细胞仪对样品进行测试，采集前向散射光FSC、侧向散射光SSC、FL1通道的核酸染料SYBR GreenⅠ绿色荧光信号、FL3通道的自养浮游生物的叶绿素a红色荧光信号数据；其中以核酸染料SYBR GreenⅠ绿色荧光信号设置域值，利用绿色荧光信号将浅水湖泊中的浮游生物与非生物颗粒、细胞碎屑区分开来，同时根据FL3通道采集的自养浮游生物的叶绿素a的红色荧光信号，将细菌与浮游藻类区分开来，最后通过流式细胞仪测试异养细菌的FSC值代表细菌大小；
（5）细菌大小标准曲线的绘制：选取不同粒径规格标准绿色微球，利用流式细胞仪分别进行测试，采集前向散射光FSC、侧向散射光SSC、FL1通道的绿色荧光信号，通过多次测定它们的FSC值，建立细胞粒径与FSC 的关系；
（6）数据分析：通过流式细胞仪分析软件分析采集到的数据，利用前向散射光与侧向散射光的不同，排除微型浮游生物对细菌检测的影响；依据核酸染料SYBR GreenⅠ绿色荧光信号的强弱，将浮游生物与非生物颗粒、细胞碎屑区分开来；根据自养浮游生物的叶绿素a红色荧光信号的强弱，将细菌与浮游藻类区分开来，从而获得目标对象样品中的异养细菌，通过流式细胞仪得到异养细菌前向散射光FSC值，再根据细菌大小的标准曲线计算出样品中异养细菌的大小。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的固定剂为甲醛，多聚甲醛或戊二醛中的一种，优选甲醛。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的超声波处理条件Es=P*t/V=1400-1600 KJ/L，其中P为超声功率，t为超声时间，V为样品体积。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述超声功率P为10-100W，超声时间t为2-30min，样品体积V为1-100ml。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，超声波处理条件Es=P*t/V=1500KJ/L，其中超声功率P为25W，超声时间t为5min，样品体积V为5ml。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中向样品中加入特异性核酸染料SYBR GreenⅠ对其进行染色；黑暗静置15-30min。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述的特异性核酸染料SYBR GreenⅠ先用TE进行1:100稀释作为母液，漩涡振荡30s，再取母液进行1:100稀释，至特异性核酸染料SYBR GreenⅠ终浓度为10-4，向1ml样品中加入10uL母液使特异性核酸染料SYBR GreenⅠ终浓度为10-4，黑暗静置20min。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（4）利用流式细胞仪对样品进行分析时，根据纯培养细菌在流式细胞图中的分布位置，调节各个检测器的电压值，调整仪器的设置，将样品置于流式细胞仪样品管中，流速控制在每秒1000个细胞以内，共收集20000个细胞。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（5）包括：吸取0.5μm，0.8μm，1μm，3μm，6μm多种粒径规格标准微球各1μl，用无菌水1:100稀释后涡旋振荡，充分混匀后分别通过流式细胞仪进行测试，调节各个检测器的电压，直至在散点图（FSC,SSC）和散点图（FL1,SSC）上清晰可见，流速控制在每秒1000个细胞以内，共收集20000个细胞。
10.根据权利要求1-9任一项所述的方法，其特征在于，步骤(6)所述的流式细胞仪分析软件采用Becton Dickinson公司开发的CellQuest软件，记录下多种标准粒径微球前向散射光（FSC）信号数据, 建立标准微球粒径与FSC值的关系，绘制细菌大小的标准曲线，建立回归分析方程，计算相关系数，再通过样品中异养细菌的前向散射光FSC值，换算成异养细菌的大小。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| EXSB | Decision made by sipo to initiate substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20150715 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |