CN103645329A - 一种基于磁性微粒的自动化牛细胞因子化学发光免疫检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种基于磁性微粒的自动化牛细胞因子化学发光免疫检测方法。本发明利用夹心免疫分析法，以磁珠为抗体的固定载体，联合流动注射，应用于化学发光分析，构建了一个高灵敏的自动化化学发光免疫检测牛细胞因子的方法。首先将带羧基的磁珠进行活化，再将抗体共价连接于磁珠表面，封闭剩余活性位点后即制得免疫传感器。当应用于牛细胞因子的检测时，免疫传感器与抗原、辣根过氧化酶标记的抗体混合通入免疫微反应器，在线温育形成夹心复合物后通入化学发光底物，随后立即进行发光信号的采集，从而实现快速检测。本发明具有分析时间短，操作简单，特异性高，灵敏度高等特点，可用于牛细胞因子的定量检测及其免疫机理的研究。

Description

一种基于磁性微粒的自动化牛细胞因子化学发光免疫检测方法
技术领域
本发明涉及一种基于磁性微粒的自动化牛细胞因子化学发光免疫检测方法，其特征在于以磁性微珠为抗体固定载体，制得牛细胞因子的免疫传感器，联合流动注射，构建了一个高灵敏的自动化的化学发光免疫快速检测牛细胞因子的方法，属于化学发光免疫分析领域。
背景技术
细胞因子是由机体各种细胞合成分泌的具有多种生理活性和参与病理反应的小分子可溶性蛋白质。它在免疫应答中起到基础监督和传输信号的作用。分为干扰素、白细胞介素、肿瘤坏死因子、趋化因子、集落刺激因子、生长因子等。牛细胞因子主要有牛伽马干扰素（IFN-γ）、白介素-4（IL-4）等，IFN-γ是在特定诱生剂刺激作用下，由病毒和其他种类的干扰素诱导剂，刺激网状内皮系统、巨噬细胞、淋巴细胞以及体细胞所产生的一种糖蛋白，是发现最早、关注最多的细胞因子。IL-4于20世纪80年代被发现，是由Th2型细胞分泌的一种多效性T细胞活化因子，在免疫细胞的成熟、活化、增殖和免疫调节等一系列过程中均发挥重要的作用。因此，定量检测牛细胞因子的含量是评价被感染牛细胞介导免疫的重要指示器。传统的检测牛IFN-γ、IL-4的方法多为生物学方法，但其有着耗时、重复性差、且在检测过程中易受到其他细胞因子的干扰。也有相关报道用酶联免疫分析检测牛细胞因子，但其灵敏度不够高，且操作繁琐。
磁性微粒因其易于快速捕捉、清洗、表面积较大，且与生物分子易于分离和结合的优点，现被广泛应用于各种检测方法中。近年来，高灵敏、快速、操作简单、成本低廉的检测方法是各领域研究者寻求的热点。将磁性微粒与流动注射相结合，实现免疫分析的自动化，磁性微粒和免疫诊断试剂可以自由地悬浮分散在溶液中，通过外加磁场捕获与释放磁性微粒，同时利用流动注射仪自动进样，从而实现快速、简便的检测。同时，表面积大的磁性微粒，可捕获大量牛细胞因子抗体，使得检测灵敏度得以提高。
目前，化学发光免疫分析技术在医学临床应用已成为研究热点，有取代放射免疫分析技术和酶联免疫分析技术成为诊断市场上的主流趋势。该方法检测灵敏度高、线性范围宽、操作简单。它同时具有化学发光法的高灵敏度和免疫分析法的高特异性，达到了方法上的互补，同时将流动注射技术与化学发光免疫分析相结合，可实现操作简单化，检测快速化。
发明内容
本发明的目的在于克服上述牛细胞因子检测方法的缺陷，建立一种基于磁性微粒的自动化牛细胞因子化学发光免疫检测方法。
本发明的技术方案是：
本发明涉及一种基于磁性微粒的自动化牛细胞因子化学发光免疫检测方法，其特征在于以磁性微珠为抗体固定载体，制得牛细胞因子的免疫传感器，联合流动注射，构建了一个高灵敏的自动化的化学发光免疫快速检测牛细胞因子的方法。
本发明首先将带有羧基的磁珠进行活化，再将抗体以共价键的方式固定于磁珠表面，将剩余活性位点封闭后即制得免疫传感器。当应用于牛细胞因子的检测时，免疫传感器与抗原、辣根过氧化酶标记的抗体混合通入免疫微反应器，在线温育形成夹心复合物后通入化学发光底物，随后立即进行发光信号的采集，从而实现快速检测。
本发明更进一步的技术方案是：
(1)免疫传感器的制备
取磁珠原液，用活化缓冲溶液清洗，然后分散于活化缓冲溶液中，向其中依次加入NHS(N-羟基丁二酰亚胺)、EDC(1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺）)固体，在室温下持续搅拌活化。活化完成后用PBS(磷酸盐缓冲溶液,PH7.4)缓冲溶液清洗后分散于牛细胞因子的抗体溶液当中，室温下搅拌一定时间后置于4℃环境下固定过夜。固定完成后用PBS缓冲溶液清洗磁珠，随后加入封闭液封闭。免疫传感器即制备完成。
(2)分析步骤
将固定了牛细胞因子抗体的磁珠分散液(即制备的免疫传感器)、抗原溶、辣根过氧化酶标记的抗体混合，注入免疫微反应器，三者在温育期间形成夹心复合物。用PBST（含吐温0.5%的PBS缓冲溶液）冲洗夹心复合物，除去未反应的免疫试剂。然后将化学发光底物通入免疫传感器，产生的化学发光信号由光电倍增管记录。
本发明方法所述的磁性微粒（即磁珠）为四氧化三铁磁性微珠，粒径为1.5μm，表面带有羧基，结合磁铁提供的外加磁场，易于实现自动化。将磁铁置于免疫微反应器上方，利用磁铁提供的磁场，可扑捉住磁珠，当撤去磁铁，磁珠可自动重新分散。
本发明方法所述的免疫微反应器由无色透明的玻璃管(内径：1.0mm;体积约：30μL)制成。
本发明方法所述的自动化化学发光免疫分析由流动注射仪与化学发光分析仪联合使用而实现。
本发明方法所述的一种基于磁性微粒的自动化牛细胞因子化学发光免疫检测方法，当制得的免疫传感器应用于牛细胞因子的检测时，整个检测过程在30min左右即可完成。
本发明方法所述的对每一测定对象化学发光信号的检测由光电倍增管处于同一高压条件下测得。
所述牛细胞因子是牛伽马干扰素或白介素-4等，不同的牛细胞因子，其对辣根过氧化酶标记的抗体浓度和温育时间会有所不同，应进行条件优化，获得最佳的牛细胞因子检测条件。例如：针对牛伽马干扰素，优选的温育时间为20min，对辣根过氧化酶标记的抗体浓度为将原液稀释1000倍。对于白介素-4，最佳的检测条件是：温育时间为20min，对辣根过氧化酶标记的抗体浓度为1.0μg/mL。
本发明方法所述的细胞因子检测的定量方法为标准曲线法，随着抗原浓度逐渐增加，化学发光强度也随之增加，由此制得标准样品的线性曲线，进行实际样品的检测。
有益效果
一种基于磁性微粒的自动化牛细胞因子化学发光免疫检测方法，具有以下优点：
（1）该分析方法具有分析时间短，操作简单，特异性高，灵敏度高等特点。
（2）将流动注射与化学发光免疫分析结合起来，实现分析检测的自动化，有利于加快分析检测时间。将制得的免疫传感器应用于牛细胞因子的检测时，整个检测过程在30min左右即可完成。
（3）选择四氧化三铁磁性微珠为牛细胞因子抗体的固定载体，联合外加磁场，易于捕捉并清洗，进而实现快速检测。表面积大，可固定大量的牛细胞因子抗体，实现高灵敏检测。
附图说明
图1.牛细胞因子自动化化学发光免疫分析示意图。
图2.牛IFN-γ标准样品检测的线性曲线。
图3.牛IL-4标准样品检测的线性曲线。
具体实施方式
下面对本发明的实验过程进行详细的说明，旨在使本发明的设计流程、设计目的及其创新点和优点更加明了。
实施例1：
(1)免疫传感器的制备
取磁珠原液，用活化缓冲溶液清洗磁珠，然后分散于活化缓冲溶液中，向其中依次加入NHS、EDC固体，在室温下持续搅拌活化。活化完成后用PBS缓冲溶液清洗后分散于牛IFN-γ的抗体溶液当中，室温下搅拌一定时间后置于4℃环境下固定过夜。固定完成后用PBS缓冲溶液清洗磁珠，随后加入封闭液封闭，免疫传感器即制备完成。
(2)分析步骤
分析示意图如图1，将固定了牛IFN-γ抗体的磁珠分散液、牛IFN-γ抗原溶液、辣根过氧化酶标记的抗体混合，注入玻璃管，三者在温育期间形成夹心复合物。用PBST冲洗夹心复合物，除去未反应的免疫试剂。然后将化学发光底物通入免疫传感器，产生的化学发光信号由光电倍增管在800V高压下记录。如此测定不同浓度的牛IFN-γ标准样品，制得牛IFN-γ标准样品的线性曲线（图2）。实验优化过程中，对温育时间进行优化的最佳温育时间选择为20min，对辣根过氧化酶标记的抗体浓度进行优化的最佳优化浓度选择为将原液稀释1000倍。实施例2：
(1)免疫传感器的制备
取磁珠原液，用活化缓冲溶液清洗磁珠，然后分散于活化缓冲溶液中，向其中依次加入NHS、EDC固体，在室温下持续搅拌活化。活化完成后用PBS缓冲溶液清洗后分散于牛IL-4的抗体溶液当中，室温下搅拌一定时间后置于4℃环境下固定过夜。固定完成后用PBS缓冲溶液清洗磁珠，随后加入封闭液封闭，免疫传感器即制备完成。
(2)分析步骤
将固定了牛IL-4抗体的磁珠分散液、牛IL-4抗原溶液、辣根过氧化酶标记的抗体混合，注入玻璃管，三者在温育期间形成夹心复合物。用PBST冲洗夹心复合物，除去未反应的免疫试剂。然后将化学发光底物通入免疫传感器，产生的化学发光信号由光电倍增管在600V高压下记录。如此测定不同浓度的牛IL-4标准样品，制得牛IL-4标准样品的线性曲线（图3）。实验优化过程中，对温育时间进行优化的最佳温育时间选择为20min，对辣根过氧化酶标记的抗体浓度进行优化的最佳优化浓度选择为1.0μg/mL。

Claims (7)

1.一种基于磁性微粒的自动化牛细胞因子化学发光免疫检测方法，其特征在于以磁性微珠为抗体固定载体，制得牛细胞因子的免疫传感器，联合流动注射，构建了一个高灵敏的自动化的化学发光免疫检测牛细胞因子的方法。
2.根据权利要求1所述的一种基于磁性微粒的自动化牛细胞因子化学发光免疫检测方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)免疫传感器的制备
取磁珠原液，用活化缓冲溶液清洗，然后分散于活化缓冲溶液中，向其中依次加入N-羟基丁二酰亚胺、1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺）固体，在室温下持续搅拌活化；活化完成后用PH7.4磷酸盐缓冲溶液清洗后分散于牛细胞因子的抗体溶液当中，室温下搅拌后置于4℃环境下固定过夜；固定完成后用磷酸盐缓冲溶液清洗磁珠，随后加入封闭液封闭，免疫传感器即制备完成；
(2)分析步骤
将制备的免疫传感器、抗原溶液、辣根过氧化酶标记的抗体溶液混合，注入免疫微反应器，三者在温育期间形成夹心复合物；用含吐温0.5%的PBS缓冲溶液冲洗夹心复合物，除去未反应的免疫试剂；然后将化学发光底物通入免疫微反应器，产生的化学发光信号由光电倍增管记录。
3.根据权利要求1或2所述的一种基于磁性微粒的自动化牛细胞因子化学发光免疫检测方法，其特征在于所述牛细胞因子是牛伽马干扰素，温育时间为20min，对辣根过氧化酶标记的抗体浓度为将原液稀释1000倍。
4.根据权利要求1或2所述的一种基于磁性微粒的自动化牛细胞因子化学发光免疫检测方法，其特征在于所述牛细胞因子是白介素-4，温育时间为20min，对辣根过氧化酶标记的抗体浓度为1.0μg/mL。
5.根据权利要求1或2所述的一种基于磁性微粒的自动化牛细胞因子化学发光免疫检测方法，其特征在于所述的免疫微反应器为无色透明的玻璃管，内径为1.0mm;体积30μL。
6.根据权利要求1或2所述的一种基于磁性微粒的自动化牛细胞因子化学发光免疫检测方法，其特征在于所用磁珠粒径为1.5μm，用于固定抗体。
7.根据权利要求1或2所述的一种基于磁性微粒的自动化牛细胞因子化学发光免疫检测方法，其特征在于所述的自动化由流动注射仪自动进样与磁铁提供的磁场捕捉或释放磁珠相结合来实现。
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