CN101144816A - 一种3-甲基-喹啉-2-羧酸的免疫磁珠检测方法 - Google Patents
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一种3－甲基－喹啉－2－羧酸的免疫磁珠检测方法，属于免疫分析化学技术领域。本发明是利用磁珠作为固相载体，通过检测化学发光信号检测3－甲基－喹啉－2－羧酸，包括包被原、免疫源和抗体的制备，包被原的固定以及化学发光的检测；大大提高了检测的灵敏度，且操作更加简便，达到了高通量的目的，而且以铁磁微粒作为固相载体，具有清洗和分离方便，操作简单的优点，大大满足国内对其检测的需要。
Description
技术领域
一种3-甲基-喹啉-2-羧酸的免疫磁珠检测方法，属于免疫分析化学技术领域。
背景技术
3-甲基-喹啉-2-羧酸，英文名称：3-methyl-quinoxaline-2-carboxylic acid(MQCA)，是喹噁啉类饲料添加剂在动物体内的代谢产物，以喹诺酮和喹乙醇为主要代表。当鸡、猪、鱼等食用此类饲料添加剂后，会在体内，主要是肌肉，肠道，肾脏中代谢生成3-甲基-喹啉-2-羧酸，这种代谢物对人体毒性极大。由于国内对喹啉类添加剂的大量滥用，造成了添加剂在动物体内的含量严重超标，国内的检测技术尚停留在对原药的检测。随着国际标准的提高，我国贸易的国际化，这种检测要求已经不能满足要求。近年来，国外开始逐渐加大了对代谢物3-甲基-喹啉-2-羧酸的研究和检测。为了与国际接轨，减少我国的肉类制品在出口时不必要的损失，我国有必要加大对代谢物的研究力度，由于对其研究较少，检测限仍然较高，为了弥补这一空白，有必要研究一种灵敏度高，检测限低，操作简单的，针对3-甲基-喹啉-2-羧酸的检测方法。
HPLC和LC-MS/MS的方法虽然灵敏，但是所需仪器价格昂贵，对操作人员的要求较高，较难推广。
发明内容
本发明的目的是提供一种3-甲基-喹啉-2-羧酸的免疫磁珠检测方法，针对3-甲基-喹啉-2-羧酸的检测，灵敏度高，操作方便，线性范围宽。
本发明的技术方案：一种3-甲基-喹啉-2-羧酸的免疫磁珠检测方法，利用磁珠作为固相载体，通过检测化学发光信号检测3-甲基-喹啉-2-羧酸，包括包被原、免疫源和抗体的制备，包被原的固定以及化学发光的检测；工艺步骤为：
(1)包被原的制备：
将3-甲基-喹啉-2-羧酸与间氨基苯甲酸相连，再与卵清蛋白偶联得到包被原；
(2)免疫源的制备：
将3-甲基-喹啉-2-羧酸与牛血清蛋白偶联得到免疫源；
(3)抗体的制备：
用步骤(2)得到的免疫源免疫兔子得到特异性兔多克隆抗体；
(4)磁性纳米粒子修饰：
用3-氨丙基三乙氧基硅烷修饰Fe3O4磁性纳米颗粒；
(5)包被原的固定：
将步骤(1)得到的包被原与磁性微粒偶联，并固定在玻璃微通道内；
(6)流动注射化学发光的检测：
利用间接竞争免疫检测原理，将3-甲基-喹啉-2-羧酸和步骤(3)得到的抗体通过玻璃微通道内，竞争结合后的抗体与辣根过氧化氢酶标记的羊抗兔IgG反应后，利用辣根过氧化氢酶催化对碘苯酚增强的鲁米诺-过氧化氢体系化学发光，检测3-甲基-喹啉-2-羧酸。
包被原的制备：
取3-甲基-喹啉-2-羧酸0.1mmol，溶解在6mLN，N-二甲基甲酰胺中，加入120μL三正丁胺，反应0.5小时，再加入75μL氯甲酸异丁酯，反应1小时，再与含有0.1mmol间氨基苯甲酸的pH9.6碳酸钠缓冲溶液混合，在4℃下搅拌反应2小时，过程中有沉淀产生，离心，取沉淀物，干燥，得到半抗原；取半抗原0.1mmol，N-羟基琥珀酰亚胺0.1mmol，N，N-二环已基二亚胺0.1mmol，加入到3mL N，N-二甲基甲酰胺，室温搅拌反应过夜，离心去沉淀，上清液再与3mL卵清蛋白溶液在4℃下搅拌反应过夜，离心，上清液用超纯水透析3天，冻干，-20℃保存备用。
免疫源的制备：取3-甲基-喹啉-2-羧酸0.1mmol，N-羟基琥珀酰亚胺0.1mmol，N，N-二环已基二亚胺0.1mmol，加入到3mL N，N-二甲基甲酰胺中，室温搅拌反应过夜，离心去沉淀，上清液再与3mL卵清蛋白溶液在4℃下搅拌反应过夜，离心，上清液用超纯水透析3天，冻干，-20℃保存备用。
磁性纳米粒子的修饰：用二次蒸馏水分别配制FeSO4·7H2O和FeCl3·6H2O的溶液及NaOH溶液，将所配两种铁盐溶液混合，在铁盐的混合溶液中Fe2+离子的浓度为0.12mol/L，Fe3+的浓度为0.2mol/L；NaOH溶液的浓度为2.5mol/L；在剧烈搅拌下将NaOH溶液缓慢滴加到混合铁盐溶液中，将所得的沉淀在60℃陈化2小时，用二次蒸馏水将沉淀物清洗数次，过滤后再在60℃干燥24小时，在玛瑙研钵中研磨后所得产物为Fe3O4种子；将所得产物Fe3O4种子0.125g分散在100mL乙醇和1mL水混合液中，超声30min，滴加0.4mL3-氨丙基三乙氧基硅烷，室温搅拌7小时，以8000r/min离心30min，将3-氨丙基三乙氧基硅烷修饰的Fe3O4纳米颗粒从反应介质中分离，并用乙醇溶液对其清洗5次，过滤后再在60℃干燥24小时，备用。
磁性纳米粒子与包被原的偶联：取3-氨丙基三乙氧基硅烷修饰的Fe3O4纳米颗粒10mg，N-羟基琥珀酰亚胺11.5mg，N，N-二环已基二亚胺20.63mg，加入到3mLN，N-二甲基甲酰胺中，室温搅拌反应过夜，离心去沉淀，上清液再与3mL包被原溶液在4℃下搅拌反应过夜，离心，上清液用超纯水透析3天，对透析袋中溶液进行磁性分离，弃上清，得到粗磁粒-包被原的复合物，加入1mL含2％明胶的封闭液封闭，再用含吐温-20的磷酸盐缓冲液洗涤液洗涤，洗涤后磁分离，去上清，最后加入1mL0.02mol/L pH7.6的Tris缓冲液，4℃保存备用。
流动注射化学发光的检测：将25μL磁粒-包被原的复合物注入玻璃微通道并以电磁铁固定，用蠕动泵注入50μL3-甲基-喹啉-2-羧酸的标准品0.02ng/mL、0.04ng/mL、0.06ng/mL、0.08ng/mL、0.1ng/mL和50μL10μg/mL的3-甲基-喹啉-2-羧酸的抗体混合液反应5分钟后，用0.01mol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液清洗30s，再加入50μL0.3μg/mL辣根过氧化氢酶标记的羊抗兔IgG反应5分钟，洗掉游离的辣根过氧化氢酶标记的抗体后，注入5×10-5mol/L路米诺和5×10-4mol/L过氧化氢，在流动注射化学分光光度仪上测定发光强度。
本发明的有益效果：免疫分析化学方法具有快速，灵敏度高，操作简单，专一性好等优点。与传统的ELISA方法相比，本发明利用磁珠作为固相载体，通过检测化学发光信号检测3-甲基-喹啉-2-羧酸，大大提高了检测的灵敏度，且操作更加简便，达到了高通量的目的，而且以铁磁微粒作为固相载体，具有清洗和分离方便，操作简单的优点。
附图说明
图1包被原的紫外扫描图。
图23-甲基-喹啉-2-羧酸的免疫磁珠检测原理图。
图33-甲基-喹啉-2-羧酸的免疫磁珠检测线性范围图。
具体实施方式
实施例1
(1)包被原的制备：
取3-甲基-喹啉-2-羧酸188mg，溶解在6mL N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，加入120μL三正丁胺，反应0.5小时，再加入75μL氯甲酸异丁酯，反应1小时，再与含有100mg间氨基苯甲酸的碳酸钠缓冲液(pH9.6)混合，在4℃下搅拌反应2小时，过程中有沉淀产生，离心，取沉淀物，干燥，得到半抗原。
取半抗原9.9mg，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)11.5mg，N，N-二环已基二亚胺(DCC)20.63mg，加入到3mL N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，室温搅拌反应过夜，离心去沉淀，上清液再与3mL卵清蛋白(OVA)(60mg)溶液在4℃下搅拌反应过夜，离心，上清液用超纯水透析3天，冻干，-20℃保存备用。
(2)免疫源的制备：
取3-甲基-喹啉-2-羧酸188mg，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)11.5mg，N，N-二环已基二亚胺(DCC)20.63mg，加入到3mL N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，室温搅拌反应过夜，离心去沉淀，上清液再与3mL卵清蛋白(OVA)(130mg)溶液在4℃下搅拌反应过夜，离心，上清液用超纯水透析3天，冻干，-20℃保存备用。
(3)免疫动物：采用新西兰大白兔作为被免疫的动物，首次免疫时将免疫源与等量的弗氏完全佐剂混合制成乳化剂，在大白兔背部皮下多点注射，免疫剂量为1mg/只，间隔2-4周后，用相同剂量免疫源加等量弗氏不完全佐剂混合制成乳化剂，加强免疫，免疫期间监测抗体效价及特异性，最后一次免疫不加佐剂。最后一次免疫7天后心脏放血，经硫酸铵分级沉淀得纯化的MQCA多克隆抗体。
(4)抗体效价的测定：
采用间接ELISA方法对免疫后不同时期的抗体进行效价的监测，以OD值达到1.0左右时判断为阳性，结果显示所制备的抗体的效价为3.2×105。
(5)磁性纳米粒子的修饰：
用二次蒸馏水分别配制FeSO4·7H2O和FeCl3·6H2O的溶液及NaOH溶液，将所配两种铁盐溶液混合。在铁盐的混合溶液中Fe2+离子的浓度为0.12mol/L，Fe3+的浓度为0.2mol/L，NaOH溶液的浓度为2.5mol/L。在剧烈搅拌下将一定体积的NaOH溶液缓慢滴加到混合铁盐溶液中，将所得的沉淀在60℃陈化2小时，用二次蒸馏水将沉淀物清洗数次，过滤后再在60℃干燥24小时，在玛瑙研钵中研磨后所得产物为Fe3O4种子。
将上步产物Fe3O4种子0.125g分散在100mL乙醇和1mL水中，超声30min，滴加0.4mL3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，室温搅拌7小时，以8000r/min离心30min，将APTES修饰的Fe3O4纳米颗粒从反应介质中分离，并用乙醇溶液对其清洗5次，过滤后再在60℃干燥24小时，备用。
(6)磁性纳米粒子与包被原的偶联：
取步骤(5)所得最终产物10mg，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)11.5mg，N，N-二环已基二亚胺(DCC)20.63mg，加入到3mL N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，室温搅拌反应过夜，离心去沉淀，上清液再与3mL包被原溶液在4℃下搅拌反应过夜，离心，上清液用超纯水透析3天，对透析袋中溶液进行磁性分离，弃上清，得到粗磁粒-包被原的复合物，加入1mL含2％明胶的封闭液封闭，再用含吐温-20的磷酸盐缓冲液(PBST)洗涤液洗涤，洗涤后磁分离，去上清，最后加入1mL0.02mol/LpH7.6的Tris缓冲液，4℃保存备用。
(7)流动注射化学发光的检测：
将25μL磁粒-包被原的复合物注入玻璃微通道并以电磁铁固定。用蠕动泵注入50μL3-甲基-喹啉-2-羧酸的标准品(0.02ng/ml、0.04ng/ml、0.06ng/ml、0.08ng/ml、0.1ng/ml)和50μL10μg/mL的3-甲基-喹啉-2-羧酸的抗体混合液反应5分钟后，用0.01mol/L pH7.4的PBS清洗30s。再加入50μL0.3μg/mL HRP标记的羊抗兔反应5分钟，洗掉游离的HRP标记的抗体后，注入5×10-5mol/L路米诺和5×10-4mol/L过氧化氢，在流动注射化学分光光度仪上测定发光强度。绘制得3-甲基-喹啉-2-羧酸的免疫磁珠检测线性范围图，见图3。
Claims (6)
1.一种3-甲基-喹啉-2-羧酸的免疫磁珠检测方法，其特征是利用磁珠作为固相载体，通过检测化学发光信号检测3-甲基-喹啉-2-羧酸，包括包被原、免疫源和抗体的制备，包被原的固定以及化学发光的检测；工艺步骤为：
(1)包被原的制备：
将3-甲基-喹啉-2-羧酸与间氨基苯甲酸相连，再与卵清蛋白偶联得到包被原；
(2)免疫源的制备：
将3-甲基-喹啉-2-羧酸与牛血清蛋白偶联得到免疫源；
(3)抗体的制备：
用步骤(2)得到的免疫源免疫兔子得到特异性兔多克隆抗体；
(4)磁性纳米粒子修饰：
用3-氨丙基三乙氧基硅烷修饰Fe3O4磁性纳米颗粒；
(5)包被原的固定：
将步骤(1)得到的包被原与磁性微粒偶联，并固定在玻璃微通道内；
(6)流动注射化学发光的检测：
利用间接竞争免疫检测原理，将3-甲基-喹啉-2-羧酸和步骤(3)得到的抗体通过玻璃微通道内，竞争结合后的抗体与辣根过氧化氢酶标记的羊抗兔IgG反应后，利用辣根过氧化氢酶催化对碘苯酚增强的鲁米诺-过氧化氢体系化学发光，检测3-甲基-喹啉-2-羧酸。
2.根据权利要求1所述的3-甲基-喹啉-2-羧酸的免疫磁珠检测方法，其特征是包被原的制备：
取3-甲基-喹啉-2-羧酸0.1mmol，溶解在6mL N，N-二甲基甲酰胺中，加入120μL三正丁胺，反应0.5小时，再加入75μL氯甲酸异丁酯，反应1小时，再与含有0.1mmol间氨基苯甲酸的pH9.6碳酸钠缓冲溶液混合，在4℃下搅拌反应2小时，过程中有沉淀产生，离心，取沉淀物，干燥，得到半抗原；取半抗原0.1mmol，N-羟基琥珀酰亚胺0.1mmol，N，N-二环己基二亚胺0.1mmol，加入到3mL N，N-二甲基甲酰胺，室温搅拌反应过夜，离心去沉淀，上清液再与3mL卵清蛋白溶液在4℃下搅拌反应过夜，离心，上清液用超纯水透析3天，冻干，-20℃保存备用。
3.根据权利要求1所述的3-甲基-喹啉-2-羧酸的免疫磁珠检测方法，其特征是免疫源的制备：取3-甲基-喹啉-2-羧酸0.1mmol，N-羟基琥珀酰亚胺0.1mmol，N，N-二环己基二亚胺0.1mmol，加入到3mL N，N-二甲基甲酰胺中，室温搅拌反应过夜，离心去沉淀，上清液再与3mL卵清蛋白溶液在4℃下搅拌反应过夜，离心，上清液用超纯水透析3天，冻干，-20℃保存备用。
4.根据权利要求1所述的3-甲基-喹啉-2-羧酸的免疫磁珠检测方法，其特征是磁性纳米粒子的修饰：用二次蒸馏水分别配制FeSO4·7H2O和FeCl3·6H2O的溶液及NaOH溶液，将所配两种铁盐溶液混合，在铁盐的混合溶液中Fe2+离子的浓度为0.12mol/L，Fe3+的浓度为0.2mol/L；NaOH溶液的浓度为2.5mol/L；在剧烈搅拌下将NaOH溶液缓慢滴加到混合铁盐溶液中，将所得的沉淀在60℃陈化2小时，用二次蒸馏水将沉淀物清洗数次，过滤后再在60℃干燥24小时，在玛瑙研钵中研磨后所得产物为Fe3O4种子；将所得产物Fe3O4种子0.125g分散在100mL乙醇和1mL水混合液中，超声30min，滴加0.4mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷，室温搅拌7小时，以8000r/min离心30min，将3-氨丙基三乙氧基硅烷修饰的Fe3O4纳米颗粒从反应介质中分离，并用乙醇溶液对其清洗5次，过滤后再在60℃干燥24小时，备用。
5.根据权利要求1所述的3-甲基-喹啉-2-羧酸的免疫磁珠检测方法，其特征是磁性纳米粒子与包被原的偶联：取3-氨丙基三乙氧基硅烷修饰的Fe3O4纳米颗粒10mg，N-羟基琥珀酰亚胺11.5mg，N，N-二环己基二亚胺20.63mg，加入到3mLN，N-二甲基甲酰胺中，室温搅拌反应过夜，离心去沉淀，上清液再与3mL包被原溶液在4℃下搅拌反应过夜，离心，上清液用超纯水透析3天，对透析袋中溶液进行磁性分离，弃上清，得到粗磁粒-包被原的复合物，加入1mL含2％明胶的封闭液封闭，再用含吐温-20的磷酸盐缓冲液洗涤液洗涤，洗涤后磁分离，去上清，最后加入1mL 0.02mol/L pH7.6的Tris缓冲液，4℃保存备用。
6.根据权利要求1所述的3-甲基-喹啉-2-羧酸的免疫磁珠检测方法，其特征是流动注射化学发光的检测：将25μL磁粒-包被原的复合物注入玻璃微通道并以电磁铁固定，用蠕动泵注入50μL 3-甲基-喹啉-2-羧酸的标准品0.02ng/mL、0.04ng/mL、0.06ng/mL、0.08ng/mL、0.1ng/mL和50μL 10μg/mL的3-甲基-喹啉-2-羧酸的抗体混合液反应5分钟后，用0.01mol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液清洗30s，再加入50μL 0.3μg/mL辣根过氧化氢酶标记的羊抗兔IgG反应5分钟，洗掉游离的辣根过氧化氢酶标记的抗体后，注入5×10-5mol/L路米诺和5×10-4mol/L过氧化氢，在流动注射化学分光光度仪上测定发光强度。
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| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
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Granted publication date: 20110511 Termination date: 20111031 |