CN113281517B - 一种免疫磁珠前处理联合hplc-uv检测2,4-二氨基嘧啶类药物残留的方法 - Google Patents

一种免疫磁珠前处理联合hplc-uv检测2,4-二氨基嘧啶类药物残留的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于食品安全检测技术领域，具体涉及一种基于免疫磁珠吸附净化前处理联合HPLC‑UV法检测多种2,4‑二氨基嘧啶类药物残留的方法。本发明所述免疫磁珠前处理联合HPLC‑UV检测2,4二氨基嘧啶类药物残留量的方法，以制备的免疫磁珠作为特异性吸附材料进行动物肌肉样品的净化，并进一步建立其检测的HPLC‑UV方法，该方法的灵敏度高，操作简便，有机溶剂使用量少，定量分析结果可靠，适用于对动物食品中多种目标2,4二氨基嘧啶类药物的多残留检测和监控。

Description

一种免疫磁珠前处理联合HPLC-UV检测2,4-二氨基嘧啶类药 物残留的方法
技术领域
本发明属于食品安全检测技术领域，具体涉及一种基于免疫磁珠吸附净化前处理联合HPLC-UV法检测多种2,4-二氨基嘧啶类药物残留的方法。
背景技术
2,4-二氨基嘧啶类药物，又称为抗菌增效剂，其与磺胺药等多种抗菌药物联用会呈现良好的协同效应，能够显著增强抗菌药的抑菌效果，甚至达到杀菌效应，被广泛应用于畜牧养殖业。目前，2,4-二氨基嘧啶类药物中，甲氧苄啶(TMP)、二甲氧苄啶(DVD)、奥美普林(OMP)和巴喹普林(BQP)已被批准应用于兽医临床，艾地普林(ADP)则处于开发阶段的动物专用抗菌增效剂。
然而，超剂量使用兽药或药物过量残留存在对人和动物造成健康危害的风险。据报道，TMP可引起造血抑制和功能障碍，包括血红蛋白浓度和红细胞、中性粒细胞、淋巴细胞和血小板数量的下降；DVD对哺乳动物细胞具有遗传毒性；BQP具有中枢神经系统毒性和肝毒性；OMP可能导致肌肉震颤，出汗和甲状腺增生；ADP可引起肝门区淋巴细胞浸润、肝细胞坏死和中枢神经系统毒性。为了人类健康及食品安全，许多国家和组织均对2,4-二氨基嘧啶类药物的最大残留限量(MRL)做出明确规定，要求不同动物或组织中的MRL为50μg/kg或100μg/kg。鉴于此，建立该类药物的有效残留监控方法则是保证动物食品安全的技术手段和技术保障。
目前，有关2,4-二氨基嘧啶类药物残留检测的方法主要包括色谱方法和酶联免疫分析法。酶联免疫分析法灵敏度高、特异性强，适合于大批量样品的现场快速检测，但它作为半定量方法，检测结果的准确度不高，容易受多种因素影响，产生假阳性和假阴性结果。而色谱方法中，常用的包括高效液相色谱质谱法(HPLC)法和高效液相色谱质谱法(LC-MS)，其中，LC-MS的灵敏度和准确度高、检测特异性强、结果准确可靠，但需要昂贵的仪器设备；HPLC法虽具有检测结果可靠、仪器普及率高、检测成本低的优点，但检测的特异性不强，往往需要有效的样品净化步骤，如液液萃取、固相萃取等，需要消耗大量有机溶剂，检测的灵敏度低，且样品前处理过程繁琐，需要进行改进。
免疫磁珠(immunomagnetic beads，IMBs)是由表面具有功能化基团的磁性微球与抗体偶合而成，由于其所偶联抗体的特异性，使得IMBs对靶分析物的吸附具有高度的特异性，有助于避免复杂基质的干扰，提高分析方法的特异性和灵敏度。同时，由于IMBs磁性微球的分散性好，在磁场作用下能快速聚集并与基质干扰分离，具有分离快速的优势，可有效简化样品净化过程，减少有机溶剂的大量使用。因此，基于免疫磁珠法进行样品的吸附净化因具有特异性强、操作简便、环境友好等优势而得到广泛的应用。目前，国内外尚未有基于免疫磁珠吸附净化处理联合HPLC-UV检测不同种类的2,4-二氨基嘧啶类药物残留的报道。
发明内容
为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种可用于2,4-二氨基嘧啶类药物样品的吸附净化的免疫磁珠，可实现2,4-二氨基嘧啶类药物样品的前处理；
本发明所要解决的第二个技术问题在于提供一种基于免疫磁珠进行HPLC-UV法检测2,4-二氨基嘧啶类药物样品前处理的方法；
本发明所要解决的第三个技术问题在于提供一种基于免疫磁珠吸附净化前处理联合HPLC-UV法检测动物性食品中多种2,4-二氨基嘧啶类药物残留的方法，该方法具有较好的特异性、简便性、时效性、灵敏性和可靠性。
为解决上述技术问题，本发明所述的一种可用于2,4-二氨基嘧啶类药物样品吸附净化的免疫磁珠，所述免疫磁珠的制备方法包括将羧基化纳米磁珠(MBs)进行活化后，与抗2,4-二氨基嘧啶药物广谱单克隆抗体进行偶联反应的步骤，以及，将所述磁珠未结合位点进行封闭的步骤，即得。
具体的，所述抗2,4-二氨基嘧啶药物广谱单克隆抗体优选为抗体14C6。
具体的，所述可用于2,4-二氨基嘧啶类药物样品吸附净化的免疫磁珠中：
所述活化步骤为以EDS和NHS作为交联剂进行活化；优选的，所述磁珠：EDS：NHS的质量比为1：1.5-2：2-2.5，更优选为1mg：1.9mg：2.3mg。
所述封闭步骤为以牛血清白蛋白进行封闭。
优选的，所述羧基化纳米磁珠包括四氧化三铁纳米磁珠。
优选的，所述偶联反应是在PBS缓冲液存在下进行的，所述PBS的最佳pH为7.0。
优选的，所述偶联反应中，所述磁珠和抗体的质量比为100:6-10，最佳质量比为100:6，优选所述偶联反应温度为20-45℃，偶联反应时间≥2h。
本发明还公开了一种基于所述免疫磁珠进行HPLC-UV法检测2,4-二氨基嘧啶类药物样品前处理的方法，包括如下步骤：
(1)取待测样品加入碱化的提取试剂进行提取；
(2)收集提取液并经氮气吹干，取残渣加入复溶试剂，离心并收集水相，得到待处理液；
(3)向上述待处理液中加入权利要求1或2所述免疫磁珠，对靶分析物进行特异性吸附，反应结束后，经磁性分离磁珠，并加入洗脱试剂对所述磁珠吸附的靶分析物进行洗脱，收集洗脱液，即得所需待测溶液。
具体的，所述待测样品为可食性动物产品，包括但不限于猪肉、牛肉、鸡肉、鱼肉。
具体的，所述的基于所述免疫磁珠进行HPLC-UV法检测2,4-二氨基嘧啶类药物样品前处理的方法：
所述步骤(1)中，所述提取试剂包括甲醇、二氯甲烷和/或乙腈；优选的，对于猪肉、牛肉、鸡肉、鱼肉样品而言，适宜的最佳提取溶剂分别为甲醇–二氯甲烷1:6(v/v)，甲醇–二氯甲烷6:1(v/v)，甲醇–二氯甲烷1:6(v/v)和乙腈；优选的，所述提取试剂的加入量为待测述动物样品量的1-10体积倍量；
所述步骤(2)中，所述复溶试剂包括PBS缓冲液和正己烷的混合溶液，优选的，加入的PBS磷酸盐缓冲溶液的pH为4-8；
所述步骤(3)中，所述洗脱试剂包括PBS缓冲液和甲醇的混合溶液，优选的，加入的PBS磷酸盐缓冲溶液的pH为4-8，甲醇水溶液浓度为80-100％，体积为250μL。
具体的，所述步骤(3)中，所述免疫磁珠的吸附温度为20-45℃，吸附时间为30min-4h，优化为30min。
本发明还公开了一种免疫磁珠前处理联合HPLC-UV检测2,4-二氨基嘧啶类药物残留的方法，包括按照所述方法制备所需待测溶液的步骤，以及，将所述待测溶液注入高效液相色谱仪进行色谱分离检测的步骤。
具体的，所述色谱分离检测步骤的条件包括：
色谱柱：C18色谱柱；
柱温：25-40℃；
流动相：流动相A为0.01％氨水(v/v)，流动相B为体积比1：1的甲醇-乙腈溶液；
流动相流速：0.5-1mL/min；
检测波长：280-290nm；
进样量：50μL；
洗脱梯度为：0-5min，31％B；5-20min，31-60％B；20.01-25min，31％B。
具体的，所述免疫磁珠前处理联合HPLC-UV检测2,4-二氨基嘧啶类药物残留的方法，还包括制备拟合标准曲线的步骤，即取目标分析物标准品加入甲醇定容制得不同浓度供试标品溶液的步骤，以及将其在相同的色谱条件下进行检测的步骤，并以浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，拟合得到不同目标分析物的线性回归方程。
具体的，所述2,4-二氨基嘧啶类药物包括甲氧苄啶、二甲氧苄啶、奥美普林、巴喹普林和/或艾地普林。
本发明还公开了所述免疫磁珠在HPLC-UV法检测多种2,4-二氨基嘧啶类药物残留领域中的应用。
本发明所述可用于2,4-二氨基嘧啶类药物样品吸附净化的免疫磁珠，以羧基化纳米磁珠耦合抗2,4-二氨基嘧啶药物单克隆抗体制得，可以实现动物可食组织样品中对五种目标2,4二氨基嘧啶类药物的特异性吸附，该方法简化了样品净化的繁琐过程，减少了有机溶剂的用量，且显著提高了检测方法对可食动物组织中其他物质的抗干扰能力，为后续构建2,4二氨基嘧啶类药物残留量检测的HPLC-UV方法提供了可靠的样品支持。
本发明所述免疫磁珠前处理联合HPLC-UV检测2,4二氨基嘧啶类药物残留量的方法，以制备的免疫磁珠作为特异性吸附材料进行动物肌肉样品的净化，并进一步建立其检测的HPLC-UV方法，该方法的灵敏度高，操作简便，有机溶剂使用量少，定量分析结果可靠，适用于对动物食品中多种目标2,4二氨基嘧啶类药物的多残留检测和监控。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中，
图1是本发明方法的检测流程图；
图2为实施例2中对空白猪肉(a)和五种2,4-二氨基嘧啶类药物添加(10ng/g)猪肉样品(b)检测的色谱图；
图3为实施例2中对空白牛肉(a)和五种2,4-二氨基嘧啶类药物添加(10ng/g)猪肉样品(b)检测的色谱图；
图4为实施例2中对空白鸡肉(a)和五种2,4-二氨基嘧啶类药物添加(10ng/g)猪肉样品(b)检测的色谱图；
图5为实施例2中对空白鱼肉(a)和五种2,4-二氨基嘧啶类药物添加(10ng/g)猪肉样品(b)检测的色谱图。
具体实施方式
在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。
制备例1
如图1所示的工艺流程，取1.9mg EDS和2.3mg NHS溶解于0.5mL pH7.0的PBS缓冲溶液中，加入1.0mg羧基功能化的四氧化三铁纳米磁珠(常规市售)和60μg抗2,4-二氨基嘧啶药物光谱单克隆抗体(14C6，下同)，充分混匀并于37℃孵育2h，经磁性分离，并洗去未结合的抗体，所述磁珠的非特异性位点采用2％BSA于室温下反应30min进行封闭，经反复洗脱，即得所需免疫磁珠。
制备例2
如图1所示的工艺流程，取1.9mg EDS和2.3mg NHS溶解于0.5mL pH7.0的PBS缓冲溶液中，加入1.0mg羧基功能化的四氧化三铁纳米磁珠和60μg抗2,4-二氨基嘧啶药物单克隆抗体，充分混匀并于37℃孵育2h，经磁性分离，并洗去未结合的抗体，所述磁珠的非特异性位点采用2％BSA于室温下反应30min进行封闭，经反复洗脱，即得所需免疫磁珠。
制备例3
如图1所示的工艺流程，取1.9mg EDS和2.3mg NHS溶解于0.5mL pH7.0的PBS缓冲溶液中，加入1.0mg羧基功能化的四氧化三铁纳米磁珠和60μg抗2,4-二氨基嘧啶药物单克隆抗体，充分混匀并于20℃孵育4h，经磁性分离，并洗去未结合的抗体，所述磁珠的非特异性位点采用2％BSA于室温下反应30min进行封闭，经反复洗脱，即得所需免疫磁珠。
制备例4
如图1所示的工艺流程，取1.9mg EDS和2.3mg NHS溶解于0.5mL pH7.0的PBS缓冲溶液中，加入1.0mg羧基功能化的四氧化三铁纳米磁珠和60μg抗2,4-二氨基嘧啶药物单克隆抗体，充分混匀并于25℃孵育3h，经磁性分离，并洗去未结合的抗体，所述磁珠的非特异性位点采用2％BSA于室温下反应30min进行封闭，经反复洗脱，即得所需免疫磁珠。
实施例1标准曲线拟合
本发明各实施例中，对动物肌肉中的甲氧苄啶、二甲氧苄啶、奥美普林、巴喹普林和艾地普林残留量的测定采用的是标准曲线法进行定量。
分别称取适量(即5-20mg)的上述五种目标分析物的标准品加到10mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，过0.22μm有机滤膜，备供试标品溶液用；分别取上述供试标品，以流动相(即流动相A+流动相B，体积比75:25)逐级稀释成系列浓度，得到不同浓度下的标品，备用。
分别将上述浓度标品注入高效液相色谱仪，按照如下程序进行检测，重复三次，以每个分析物标品浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，进行标准曲线的拟合：
色谱柱：Agilent Extend-C18色谱柱；
柱温：35℃；
流动相A：0.01％氨水；
流动相B：甲醇-乙腈(1:1，v/v)；
流动相流速：1mL/min；
检测波长：285nm；
进样量：50μL；
洗脱梯度：0-5min，31％B；5-20min，31-60％B；20.01-25min，31％B。
经拟合计算，分别得到如下线性回归方程(x为分析物浓度，y为峰面积)，用于各个目标分析物残留量检测的标准曲线：
甲氧苄啶：y＝0.0008x+0.0164；
二甲氧苄啶：y＝0.0007x-0.0005；
奥美普林：y＝0.0013x+0.0022；
巴喹普林：y＝0.0009x-0.0073；
艾地普林：y＝0.0009x-0.0039。
后续在进行待测样品的检测时，只需将所测样品经高效液相色谱检测到的峰面积带入所述线性回归方程，经计算即可得到各分析物含量，即为待测样品中目标分析物的残留量。
实施例2
分别取经检测不含上述五种2,4-二氨基嘧啶类药物的猪肉、牛肉、鸡肉和鱼肉作为空白样品。
另取同样的不含2,4-二氨基嘧啶类药物的猪肉、牛肉、鸡肉和鱼肉，分别各加入10ng/g的上述五种2,4-二氨基嘧啶类药物的标准品，作为已知样品。
如图1所示的流程步骤，分别取1.0g上述猪肉、牛肉、鸡肉和鱼肉的空白样品和已知样品经匀质后，加入氨水调节pH 9.0，并加入4mL甲醇-二氯甲烷的混合溶液混匀(1:6，v/v)，经常规超声提取2遍，收集并合并提取液，于40℃氮气吹干，收集残渣并加入0.5mL PBS磷酸盐缓冲溶液(pH7.0)和1mL正己烷溶液进行复溶，充分混匀后，于8000rpm离心10min，分离并收集水层，备用。
向上述收集的水层中加入前述制备例1中得到的免疫磁珠2mg，在37℃下进行孵育30min，使得所述免疫磁珠对靶分析物进行特异性吸附，吸附完成后，经磁性分离所述磁珠，收集并采用0.25mL 80％甲醇水溶液对吸附的靶分析物进行洗脱分离。
收集上述洗脱液，过微0.2μm微孔孔滤膜，并注入高效液相色谱仪，按照如实施例1中色谱分离程序进行色谱分离检测。
上述猪肉、牛肉、鸡肉和鱼肉的空白样品和已知样品检测色谱图分别见附图2-5所示，其中，a为各空白样品谱图，b为标准添加样品谱图，可见，各分离峰之间区分明显，且互不干扰。
实施例3猪肉样品中残留量的检测
取1.0g待测猪肉样品经匀质后，加入氨水调节pH 9.0，并加入4mL甲醇-二氯甲烷的混合溶液混匀(1:6，v/v)，经常规超声提取2遍，收集并合并提取液，于40℃氮气吹干，收集残渣并加入0.5mL PBS磷酸盐缓冲溶液(pH7.0)和1mL正己烷溶液进行复溶，充分混匀后，于8000rpm离心10min，分离并收集水层，备用。
向上述收集的水层中加入前述制备例1中得到的免疫磁珠2mg，在37℃下进行孵育30min，使得所述免疫磁珠对靶分析物进行特异性吸附，吸附完成后，经磁性分离所述磁珠，收集并采用0.25mL 80％甲醇水溶液对吸附的靶分析物进行洗脱分离。
收集上述洗脱液，过微0.2μm微孔孔滤膜，并注入高效液相色谱仪，按照如下程序进行色谱分离检测：
色谱柱：Agilent Extend-C18；
柱温：35℃；
检测波长：285nm；
进样量：50μL；
流动相A：0.01％氨水；
流动相B：甲醇-乙腈溶液(1：1，v/v)；
流动相流速：1mL/min；
洗脱梯度：0-5min，31％B；5-20min，31-60％B；20.01-25min，31％B。
实施例4
取1.0g待测牛肉样品经匀质后，加入氨水调节pH 9.0，并加入4mL甲醇-二氯甲烷的混合溶液混匀(6：1，v/v)，经常规超声提取2遍，收集并合并提取液，于40℃氮气吹干，收集残渣并加入0.5mL PBS磷酸盐缓冲溶液(pH 7.0)和1mL正己烷溶液进行复溶，充分混匀后，于8000rpm离心10min，分离并收集水层，备用。
向上述收集的水层中加入前述制备例1中得到的免疫磁珠2mg，在37℃下进行孵育30min，使得所述免疫磁珠对靶分析物进行特异性吸附，吸附完成后，经磁性分离所述磁珠，收集并采用0.25mL 80％甲醇水溶液对吸附的靶分析物进行洗脱分离。
收集上述洗脱液，过微0.2μm微孔孔滤膜，注入高效液相色谱仪，按照如下程序进行色谱分离检测：
色谱柱：Agilent Extend-C18；
柱温：35℃；
检测波长：285nm；
进样量：50μL；
流动相A：0.01％氨水；
流动相B：甲醇-乙腈溶液(1：1，v/v)；
流动相流速：1mL/min；
洗脱梯度：0-5min，31％B；5-20min，31-60％B；20.01-25min，31％B。
实施例5
取1.0g待测鸡肉样品经匀质后，加入氨水调节pH 9.0，并加入4mL甲醇-二氯甲烷的混合溶液混匀(1:6，v/v)，经常规超声提取2遍，收集并合并提取液，于40℃氮气吹干，收集残渣并加入0.5mL PBS磷酸盐缓冲溶液(pH7.0)和1mL正己烷溶液进行复溶，充分混匀后，于8000rpm离心10min，分离并收集水层，备用。
向上述收集的水层中加入前述制备例1中得到的免疫磁珠2mg，在37℃下进行孵育30min，使得所述免疫磁珠对靶分析物进行特异性吸附，吸附完成后，经磁性分离所述磁珠，收集并采用0.25mL 80％甲醇水溶液对吸附的靶分析物进行洗脱分离。
收集上述洗脱液，过微0.2μm微孔孔滤膜，并注入高效液相色谱仪，按照如下程序进行色谱分离检测：
色谱柱：Agilent Extend-C18；
柱温：35℃；
检测波长：285nm；
进样量：50μL；
流动相A：0.01％氨水；
流动相B：甲醇-乙腈溶液(1：1，v/v)；
流动相流速：1mL/min；
洗脱梯度：0-5min，31％B；5-20min，31-60％B；20.01-25min，31％B。
实施例6
取1.0g鱼肉样品经匀质后，加入氨水调节pH 9.0，并加入4mL乙腈溶液混匀，经常规超声提取2遍，收集并合并提取液，于40℃氮气吹干，收集残渣并加入0.5mL PBS磷酸盐缓冲溶液(pH 7.0)和1mL正己烷溶液进行复溶，充分混匀后，于8000rpm离心10min，分离并收集水层，备用。
向上述收集的水层中加入前述制备例1中得到的免疫磁珠2mg，在37℃下进行孵育30min，使得所述免疫磁珠对靶分析物进行特异性吸附，吸附完成后，经磁性分离所述磁珠，收集并采用0.25mL 80％甲醇水溶液对吸附的靶分析物进行洗脱分离。
收集上述洗脱液，过微0.2μm微孔孔滤膜，并注入高效液相色谱仪，按照如下程序进行色谱分离检测：
色谱柱：Agilent Extend-C18；
柱温：35℃；
检测波长：285nm；
进样量：50μL；
流动相A：0.01％氨水；
流动相B：甲醇-乙腈溶液(1：1，v/v)；
流动相流速：1mL/min；
洗脱梯度：0-5min，31％B；5-20min，31-60％B；20.01-25min，31％B。
实施例7检测限和定量限
在本实施例中，该方法的检测限和定量限通过空白样品经方法优化的处理程序处理后，添加一定含量的分析物进行HPLC检测，当分析物响应值达到仪器相应噪音的3倍和10倍时，分别为方法的检测限和定量限。
经测定，在本方法优化的方法条件下，在猪肉、牛肉、鸡肉和鱼肉中，五种目标分析物的检测限和定量限均分别为5ng/g和10ng/g。
实施例8准确度和精密度
在本实施例中，该方法的准确度和精密度通过回收率和变异系数来反映，即通过空白样品分别添加1、2和4倍定量限浓度法分析物(即10ng/g、20ng/g、40ng/g三个不同浓度水平)，每个浓度5个重复，重复试验5天，计算回收率和变异系数，猪肉、牛肉、鸡肉和鱼肉样品中的测试结果分别见下表1-4所示。
如下表1中结果表明，猪肉中的五种2,4二氨基嘧啶类药物添加回收率为64.1％-74.2％，变异系数在4.6％-10.1％，其准确度和精密度满足残留分析的要求。
表1猪肉样品中2,4二氨基嘧啶类药物添加回收率和变异系数结果
如下表2中结果表明，牛肉中的五种2,4二氨基嘧啶类药物添加回收率为62.5％-72.8％，变异系数在4.2％-12.2％，其准确度和精密度满足残留分析的要求。
表2牛肉样品中2,4二氨基嘧啶类药物添加回收率和变异系数结果
如下表3中结果表明，鸡肉中的五种2,4二氨基嘧啶类药物添加回收率为63.3％-75.4％，变异系数在4.4％-111.7％，其准确度和精密度满足残留分析的要求。
表3鸡肉样品中2,4二氨基嘧啶类药物添加回收率和变异系数结果
如下表4中结果表明，鱼肉中的五种2,4二氨基嘧啶类药物添加回收率为65.0％-76.9％，变异系数在5.1％-9.4％，其准确度和精密度满足残留分析的要求。
表4鱼肉样品中2，4二氨基嘧啶类药物添加回收率和变异系数结果
综上，本发明方法中，五种目标分析物三个浓度水平组织添加的回收率为62.5-76.9％，变异系数≤12.2％，可满足定量方法学要求。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (2)

1.一种免疫磁珠前处理联合HPLC-UV检测2,4-二氨基嘧啶类药物残留的方法，其特征在于，所述免疫磁珠的制备方法包括将羧基化纳米磁珠进行活化后，与抗2,4-二氨基嘧啶药物广谱单克隆抗体进行偶联反应的步骤，以及，将所述磁珠未结合位点进行封闭的步骤，即得；所述活化步骤为以EDS和NHS作为交联剂进行活化；所述封闭步骤为以牛血清白蛋白进行封闭；
所述免疫磁珠前处理联合HPLC-UV检测2,4-二氨基嘧啶类药物残留的方法包括如下步骤：
（1）取待测样品加入碱化的提取试剂进行提取；
（2）收集提取液并经氮气吹干，取残渣加入复溶试剂，离心并收集水相，得到待处理液；
（3）向上述待处理液中加入所述免疫磁珠，对靶分析物进行特异性吸附，反应结束后，经磁性分离磁珠，并加入洗脱试剂对所述磁珠吸附的靶分析物进行洗脱，收集洗脱液，即得所需待测溶液；
（4）将所述待测溶液注入高效液相色谱仪进行色谱分离检测的步骤；
所述2,4-二氨基嘧啶类药物包括甲氧苄啶、二甲氧苄啶、奥美普林、巴喹普林和/或艾地普林；
所述步骤（1）中，所述提取试剂包括甲醇、二氯甲烷和/或乙腈；
所述步骤（2）中，所述复溶试剂包括PBS缓冲液和正己烷的混合溶液；
所述步骤（3）中，所述洗脱试剂包括PBS缓冲液和甲醇的混合溶液；
所述步骤（3）中，所述免疫磁珠的吸附温度为20-45℃，吸附时间为30min-4h；
所述色谱分离检测步骤的条件为：
色谱柱：Agilent Extend-C18；
柱温：35℃；
检测波长：285nm；
进样量：50μL；
流动相A：0.01%氨水；
流动相B：体积比1:1的甲醇-乙腈溶液；
流动相流速：1mL/min；
洗脱梯度：0-5min，31%B；5-20min，31-60%B；20.01-25min，31%B。
2.根据权利要求1所述免疫磁珠前处理联合HPLC-UV检测2,4-二氨基嘧啶类药物残留的方法，其特征在于，还包括制备拟合标准曲线的步骤，即取目标分析物标准品加入甲醇定容制得不同浓度供试标品溶液的步骤，以及将其在相同的色谱条件下进行检测的步骤，并以浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，拟合得到不同目标分析物的线性回归方程。
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