CN107356686A - 喹诺酮类药物残留的检测方法 - Google Patents

喹诺酮类药物残留的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种喹诺酮类药物残留的检测方法，包括如下步骤：S1：将偶联有喹诺酮类单克隆抗体的玻璃微珠填充在注射器中，得到免疫亲和注射器；S2：采用免疫亲和注射器对待测样品进行萃取，再进行洗脱，得到洗脱液；S3：将洗脱液采用氮气吹干，然后用流动相复溶，再进行高效液相色谱分析。本发明首次将免疫亲和吸附剂和MEPS相结合，建立了一种免疫亲和注射器微萃取‑液相色谱‑荧光法检测牛奶中残留的喹诺酮类药物的方法，具有选择性好、灵敏度高、操作简单、重复性好、成本低廉、有机溶剂使用量少且环境友好等优点。

Description

喹诺酮类药物残留的检测方法
技术领域
本发明涉及食品检测技术领域，具体涉及一种喹诺酮类药物残留的检测方法。
背景技术
喹诺酮类药物是含有吡酮酸基本结构的一类广谱抗生素，对革兰氏阳性菌、支原体和革兰氏阴性菌均有抑制作用，主要作用机理是抑制细菌的DNA螺旋酶催化作用。为了提高生产，喹诺酮类药物(Quinolones，QNs)被广泛的应用于养殖业，但由于其存在细胞毒性、细菌耐药性和多重耐药性，因此QNs的残留问题越来越引起人们的重视。欧盟和中国均规定牛、鸡、猪、羊等动物的肌肉、脂肪、肝脏中达氟沙星、二氟沙星、恩诺沙星(环丙沙星与恩诺沙星量之和)、沙拉沙星等QNs最高残留限量为0.01～1.9mg/kg。。欧盟、美国、日本、FAO/WHO食品添加剂联合专家委员会(JECFA)等国家或组织规定了不同动物组织中QNs的MRL标准。中国规定了3种QNs在牛奶中MRL：ENR为100μg/L，DAN为30μg/L，FLU为50μg/L，建立一个灵敏度高特异性好的检测牛奶中QNs含量的方法迫在眉睫。
分析方法最重要的一步是从样品基质中萃取化合物。牛奶中含有大量的脂肪、蛋白质和糖类等干扰物质，常带来较大的基质效应，对微量分析检测造成影响，因此，在检测前必须进行样品的萃取和净化。常用的样品前处理方法有液液萃取、超临界流体萃取、QuEChERS和固相萃取等，传统的前处理方法，耗时长，操作复杂，消耗有机溶剂多，价格昂贵不能重复使用，而固相微萃取因其操作简便、样品和溶剂用量小等优势被广泛应用于食品检测、环境监测和法医诊断等领域。注射器微萃取技术是新兴的SPME技术，它是将固体吸附剂填充在暗盒内，并连接在密封的注射器上，当样品经注射器通过暗盒时，目标分析物被暗盒内的吸附剂吸附，再经过洗涤洗脱等步骤完成萃取净化过程。MEPS技术已经成功的应用于血浆，尿液等生物样品的检测以及土壤河水等环境样品的检测，常用的MEPS吸附剂有分子印记聚合物、硅胶基质以及限介材料等，但均存在不足。
发明内容
本发明提供了一种喹诺酮类药物残留的检测方法，包括如下步骤：S1：将偶联有喹诺酮类单克隆抗体的玻璃微珠填充在注射器中，得到免疫亲和注射器；S2：采用免疫亲和注射器对待测样品进行萃取，再进行洗脱，得到洗脱液；S3：将洗脱液采用氮气吹干，然后用流动相复溶，再进行高效液相色谱分析。
在本发明的进一步实施方式中，S1中，偶联有喹诺酮类单克隆抗体的玻璃微珠的制备方法包括如下步骤：S101：将质量分数为98％的浓硫酸和质量分数为30％的双氧水溶液以7:3的体积比混合均匀，然后加入玻璃微珠，80℃水浴加热1h；S102：取出经过S101处理后的玻璃微珠，然后依次采用超纯水和纯乙醇冲洗，再将玻璃微珠置于APTES乙醇溶液中反应24h；S103：取出经过S102处理后的玻璃微珠，然后依次采用超纯水和纯乙醇冲洗，再将玻璃微珠在80℃的高纯氮气流下放置15h；S104：将经过S103处理后的玻璃微珠采用戊二醛PBS溶液活化5h，然后采用超纯水清洗，再将玻璃微珠置于喹诺酮类单克隆抗体PBS溶液中，4℃条件下震荡24h；S105：将经过S104处理后的玻璃微珠采用超纯水清洗，然后置于pH值为7.5的0.3M的乙醇胺溶液中，1h后取出玻璃微珠并放入0.2mg/mL的NaCNBH3溶液中，静置24～48h，得到偶联有喹诺酮类单克隆抗体的玻璃微珠。需要说明的是，S105中，将玻璃微珠置于pH值为7.5的0.3M的乙醇胺溶液，是为了灭活未反应的戊二醛，将玻璃微珠放入0.2mg/mL的NaCNBH3溶液的作用是把酰亚胺转变为胺，并使共价键更加牢固
在本发明的进一步实施方式中，S102中，APTES乙醇溶液中，组分按体积比计，包括5％APTES(3-氨丙基三乙氧基硅烷)、5％去离子水和90％纯乙醇。
在本发明的进一步实施方式中，S104中，戊二醛PBS溶液中，戊二醛的质量分数为2.5％；喹诺酮类单克隆抗体PBS溶液中，喹诺酮类单克隆抗体的浓度为0.5mg/mL。
在本发明的进一步实施方式中，S1具体包括：将0.2g偶联有喹诺酮类单克隆抗体的玻璃微珠填充在2mL注射器中，两端用筛板固定，得到免疫亲和注射器。
在本发明的进一步实施方式中，S2具体包括：S201：采用免疫亲和注射器对1mL待测样品进行萃取，抽吸速率为3.5mL/min，萃取时间为15min；S202：萃取完毕后，采用超纯水洗去免疫亲和注射器内部残留的药物，然后用600μL甲醇PBS溶液洗脱5min，重复洗脱1次，合并两次洗脱液，得到洗脱液。
在本发明的进一步实施方式中，S202中，甲醇PBS溶液中，甲醇和PBS溶液的体积比为9:1。
在本发明的进一步实施方式中，S3中，流动相包括A相和B相，A相为体积分数为0.1％的甲酸水溶液，B相为乙腈；流动相的用量为200μL。
在本发明的进一步实施方式中，S3中，高效液相色谱分析包括：5μm，4.6×150mm的InertSustan C18色谱柱，柱温：30；荧光检测器FLD检测波长：激发波长280nm，发射波长450nm；进样体积：20μL；流动相：A相为体积分数为0.1％的甲酸水溶液，B相为乙腈；等度洗脱程序：80％A；流速：0.6mL/min。
本发明还保护喹诺酮类药物残留的检测方法在检测牛奶中喹诺酮类药物残留中的应用。在检测牛奶时，称取1±0.01g牛奶于2mL离心管内，添加一定量标准溶液，涡旋混匀，然后以10000r/min在20℃下离心10min。弃去下层蛋白沉淀和上层脂肪，取清液。待免疫亲和注射器中的吸附剂由4℃恢复至室温，将注射器安装在注射泵上，设置萃取速率和时间分别为3.5mL/min和15min。之后用1mL的水反复清洗3次洗去附着的蛋白质等杂质，然后用600μL的甲醇-PBS溶液(9:1,V/V)以3.5mL/min速率进行洗脱5min，重复洗脱1次，合并两次洗脱液并用氮气吹干，残留物用200μL流动相复溶，使用0.22μm有机膜过滤，取20μL HPLC(高效液相色谱)分析。使用后，用1mL的洗脱液清洗注射器5min，最后用2mL的PBS缓冲液冲洗注射器，除去注射器内残留的甲醇，保护抗体涂层以延长使用寿命。用毕，注射器内吸满PBS溶液，保证吸附剂浸润在缓冲液中，并置于4℃保存。
本发明提供的技术方案，具有如下的有益效果：
(1)本发明首次将免疫亲和吸附剂和MEPS相结合并应用于检测，建立了一种选择性好、灵敏度高的免疫亲和注射器微萃取-液相色谱-荧光法检测牛奶中的喹诺酮类药物(Quinolones，QNs)的方法，避免了QNs的残留常规检测方法如LLE和SPE等存在的耗时长、有机试剂使用量大等缺点；
(2)本发明使用戊二醛法将QNs单克隆抗体偶联到玻璃微珠上，取0.2g微珠填充到注射器内，并对IA-MEPS相关参数进行优化，牛奶样品以3.5mL/min流速萃取，600μL的甲醇-PBS溶液(9:1,V/V)洗脱，氮气吹干后200μL流动相复溶，LC-FLD检测；方法的检测限为0.05～0.1ng/g，定量限为0.15～0.3ng/g，日内日间精密度分别为3.2％-14.6％和9.1％-15.8％；IA-MEPS方法具有操作简单、灵敏度高、重复性好、成本低廉、有机溶剂使用量少等优点，是一种环境友好的样品前处理方法；
(3)本发明将偶联QNs单克隆抗体的玻璃微珠填充在注射器内，建立了免疫亲和注射器微萃取-液相色谱-荧光法检测牛奶中8种QNs；由于IA-MEPS装置可以重复使用，为了减少或消除携带效应，避免下次使用时出现假阳性的结果，使用后需要用洗脱液对注射器进行清洗，这不仅减少了记忆的影响，还可以作为下一次萃取的调节功能。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
图1为本发明实施例一中间隔24h和48h下使用次数对IA-MEPS柱容量的影响结果图；
图2为本发明实施例三中的色谱图；其中，A为5ng/ml LOM标准液样品，B为添加1ng/g QNs的牛奶样品，C为空白牛奶样品。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只是作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，数据为三次重复实验的平均值或平均值±标准差。
实施例一
将玻璃微珠放入质量分数为98％的浓硫酸和质量分数为30％的双氧水的混合溶液(7:3,V/V)中，80水浴加热1h，依次用超纯水、纯乙醇冲洗后，置于ATPES乙醇溶液(组分按体积比计，包括5％APTES、5％去离子水和90％纯乙醇)中反应24h，依次用超纯水和纯乙醇冲洗后，放置在80的高纯氮气流下过夜，15h后，取出玻璃微珠用质量分数为2.5％的戊二醛PBS溶液活化5h，超纯水清洗后，倒入0.5mg/mL的喹诺酮类单克隆抗体PBS溶液，放在震荡器上4条件下震荡24h，用超纯水冲洗后，置于pH为7.5的0.3M的乙醇胺溶液中将未反应的戊二醛灭活，1h后取出玻璃微珠放入0.2mg/mL的NaCNBH3溶液中24h，把酰亚胺转变为胺并使共价键更加牢固。取制备好的偶连有QNs(喹诺酮类)单克隆抗体的玻璃微珠0.2g手动的填充在2mL注射器内，两端用筛板固定，得到IA-MEPS注射器(免疫亲和注射器)。
用PBS溶液将8种QNs工作液分别稀释成100ng/mL的溶液，分别各取1mL，用IA-MEPS注射器(免疫亲和注射器)萃取，抽吸速率为3.5mL/min，萃取时间为15min。再用超纯水洗去IA-MEPS注射器内部残留的药物，之后用600μL甲醇-PBS溶液(9:1,V/V)进行洗脱5min，重复洗脱步骤1次，合并两次洗脱液。氮气吹干后200μL流动相(流动相包括A相和B相，A相为体积分数为0.1％的甲酸水溶液，B相为乙腈)复溶，取20μL HPLC分析。HPLC分析包括：InertSustan C18色谱柱(5μm,4.6×150mm)，柱温：30；荧光检测器FLD检测波长：激发波长280nm，发射波长450nm；进样体积：20μL；流动相：A相为体积分数为0.1％的甲酸水溶液，B相为乙腈；等度洗脱程序：80％A；流速：0.6mL/min。
分别间隔24h和48h使用一次IA-MEPS，连续使用15次，考察在不同间隔时间下使用次数对IA-MEPS柱容量的影响。8种QNs的柱容量及保留时间如下表1所示；间隔24h和48h使用15次柱容量变化图如图1所示。
表1 8种QNs的柱容量及保留时间
药物 柱容量(ng/mg) 保留时间(min)
DAN 0.458 7.27
ENR 0.219 8.39
ORB 0.103 9.35
FLE 0.148 6.42
CIP 0.132 6.44
OFL 0.051 6.14
NOR 0.255 5.98
LOM 0.305 7.42
实施例二
将玻璃微珠放入质量分数为98％的浓硫酸和质量分数为30％的双氧水的混合溶液(7:3,V/V)中，80水浴加热1h，依次用超纯水、纯乙醇冲洗后，置于ATPES乙醇溶液(组分按体积比计，包括5％APTES、5％去离子水和90％纯乙醇)中反应24h，依次用超纯水和纯乙醇冲洗后，放置在80的高纯氮气流下过夜，15h后，取出玻璃微珠用质量分数为2.5％的戊二醛PBS溶液活化5h，超纯水清洗后，倒入0.5mg/mL的喹诺酮类单克隆抗体PBS溶液，放在震荡器上4条件下震荡24h，用超纯水冲洗后，置于pH为7.5的0.3M的乙醇胺溶液中将未反应的戊二醛灭活，1h后取出玻璃微珠放入0.2mg/mL的NaCNBH3溶液中24h，把酰亚胺转变为胺并使共价键更加牢固。取制备好的偶连有QNs(喹诺酮类)单克隆抗体的玻璃微珠0.2g手动的填充在2mL注射器内，两端用筛板固定，得到IA-MEPS注射器(免疫亲和注射器)。
牛奶样品购自当地超市，称取1g(±0.01)牛奶于2mL离心管内，添加一定量标准溶液，涡旋混匀，然后以10000r/min在20℃下离心10min。弃去下层蛋白沉淀和上层脂肪，取清液。待IA-MEPS注射器(免疫亲和注射器)内吸附剂由4℃恢复至室温，将注射器安装在注射泵上，设置萃取速率和时间分别为3.5mL/min和15min。之后用1mL的超纯水反复清洗3次洗去附着的蛋白质等杂质，然后用600μL的甲醇-PBS溶液(9:1,V/V)以3.5mL/min速率进行洗脱5min，重复洗脱步骤1次，合并两次洗脱液用氮气吹干，残留物用200μL流动相(流动相包括A相和B相，A相为体积分数为0.1％的甲酸水溶液，B相为乙腈)复溶，使用0.22μm有机膜过滤，取20μL HPLC分析，HPLC分析包括：InertSustan C18色谱柱(5μm,4.6×150mm)，柱温：30；荧光检测器FLD检测波长：激发波长280nm，发射波长450nm；进样体积：20μL；流动相：A相为体积分数为0.1％的甲酸水溶液，B相为乙腈；等度洗脱程序：80％A；流速：0.6mL/min。(IA-MEPS注射器使用后，用1mL的洗脱液清洗注射器5min，最后用2mL的PBS缓冲液冲洗注射器，除去注射器内残留的甲醇，保护抗体涂层以延长使用寿命。用毕，注射器内吸满PBS溶液，保证吸附剂浸润在缓冲液中，并置于4℃保存。)
取空白牛奶样品，做10个平行样品，按上述样品前处理的方法处理。测得基线噪音值，按信噪比S/N＝3为检测限LODs，S/N＝10为定量限LOQs。具体结果如下表2所示。
表2 8种QNs药物的标准曲线、定量限和检测限
实施例三
将玻璃微珠放入质量分数为98％的浓硫酸和质量分数为30％的双氧水的混合溶液(7:3,V/V)中，80水浴加热1h，依次用超纯水、纯乙醇冲洗后，置于ATPES乙醇溶液(组分按体积比计，包括5％APTES、5％去离子水和90％纯乙醇)中反应24h，依次用超纯水和纯乙醇冲洗后，放置在80的高纯氮气流下过夜，15h后，取出玻璃微珠用质量分数为2.5％的戊二醛PBS溶液活化5h，超纯水清洗后，倒入0.5mg/mL的喹诺酮类单克隆抗体PBS溶液，放在震荡器上4条件下震荡24h，用超纯水冲洗后，置于pH为7.5的0.3M的乙醇胺溶液中将未反应的戊二醛灭活，1h后取出玻璃微珠放入0.2mg/mL的NaCNBH3溶液中24h，把酰亚胺转变为胺并使共价键更加牢固。取制备好的偶连有QNs(喹诺酮类)单克隆抗体的玻璃微珠0.2g手动的填充在2mL注射器内，两端用筛板固定，得到IA-MEPS注射器(免疫亲和注射器)。
取空白牛奶(购自超市)样品1g，添加一定体积的QNs标准液，使牛奶中QNs的添加量为1ng/g，涡旋混匀，然后放置于2mL离心管内，以10000r/min在20℃下离心10min。弃去下层蛋白沉淀和上层脂肪，取清液。待IA-MEPS注射器(免疫亲和注射器)内吸附剂由4℃恢复至室温，将注射器安装在注射泵上，设置萃取速率和时间分别为3.5mL/min和15min。之后用1mL的超纯水反复清洗3次洗去附着的蛋白质等杂质，然后用600μL的甲醇-PBS溶液(9:1,V/V)以3.5mL/min速率进行洗脱5min，重复洗脱步骤1次，合并两次洗脱液用氮气吹干，残留物用200μL流动相(流动相包括A相和B相，A相为体积分数为0.1％的甲酸水溶液，B相为乙腈)复溶，使用0.22μm有机膜过滤，取20μL HPLC分析，HPLC分析包括：InertSustan C18色谱柱(5μm,4.6×150mm)，柱温：30；荧光检测器FLD检测波长：激发波长280nm，发射波长450nm；进样体积：20μL；流动相：A相为体积分数为0.1％的甲酸水溶液，B相为乙腈；等度洗脱程序：80％A；流速：0.6mL/min。
一日内每个药物取5个平行样品，分别测定，计算回收率和日内相对标准偏差。连续测定3天，计算日间相对标准偏差。8种QNs的样品添加回收率和精密度如下表3所示：平均回收率在53.9％-90.6％之间，日内RSD范围在3.2％-14.6％之间，日间RSD范围在9.1％-15.8％之间，说明该方法具有良好的回收率和重复性，IA-MEPS方法的特异性通过分析空白样品进行评价。
表3牛奶中8种QNs的回收率和精密度
如图2所示(A:5ng/ml LOM标准液；B:添加1ng/g QNs的牛奶样品；C:空白牛奶样品)，空白样品色谱图显示在QNs保留时间内并无干扰峰的出现，加标样品经IA-MEPS萃取后，LOM色谱峰峰形良好，表明IA-MEPS能够降低基质影响并能有效的富集纯化QNs。
由于IA-MEPS装置可以重复使用，为了减少或消除携带效应，避免下次使用时出现假阳性的结果，使用后需要用洗脱液对注射器进行清洗，这个步骤不仅减少了记忆的影响，还可以作为下一次萃取的调节功能。本发明用洗脱液对吸附剂清洗5min，通过对空白的牛奶样品进行萃取，检测显示携带效应降至检测限以下。
本发明首次将偶联单克隆抗体的玻璃微珠作为MEPS的选择性吸附剂，建立了检测牛奶中QNs的方法，该方法操作简便、灵敏度高、重复性好、有机溶剂使用少，符合绿色化学的要求。
需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的部件和步骤的相对步骤、数字表达式和数值并不限制本发明的范围。在这里示出和描述的所有示例中，除非另有规定，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制，因此，示例性实施例的其他示例可以具有不同的值。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的保护范围当中。

Claims (10)

1.一种喹诺酮类药物残留的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：将偶联有喹诺酮类单克隆抗体的玻璃微珠填充在注射器中，得到免疫亲和注射器；
S2：采用所述免疫亲和注射器对待测样品进行萃取，再进行洗脱，得到洗脱液；
S3：将所述洗脱液采用氮气吹干，然后用流动相复溶，再进行高效液相色谱分析。
2.根据权利要求1所述的喹诺酮类药物残留的检测方法，其特征在于，
所述S1中，所述偶联有喹诺酮类单克隆抗体的玻璃微珠的制备方法包括如下步骤：
S101：将质量分数为98％的浓硫酸和质量分数为30％的双氧水溶液以7:3的体积比混合均匀，然后加入玻璃微珠，80℃水浴加热1h；
S102：取出经过S101处理后的玻璃微珠，然后依次采用超纯水和纯乙醇冲洗，再将玻璃微珠置于APTES乙醇溶液中反应24h；
S103：取出经过S102处理后的玻璃微珠，然后依次采用超纯水和纯乙醇冲洗，再将玻璃微珠在80℃的高纯氮气流下放置15h；
S104：将经过S103处理后的玻璃微珠采用戊二醛PBS溶液活化5h，然后采用超纯水清洗，再将玻璃微珠置于喹诺酮类单克隆抗体PBS溶液中，4℃条件下震荡24h；
S105：将经过S104处理后的玻璃微珠采用超纯水清洗，然后置于pH值为7.5的0.3M的乙醇胺溶液中，1h后取出玻璃微珠并放入0.2mg/mL的NaCNBH3溶液中，静置24～48h，得到所述偶联有喹诺酮类单克隆抗体的玻璃微珠。
3.根据权利要求2所述的喹诺酮类药物残留的检测方法，其特征在于：
所述S102中，所述APTES乙醇溶液中，组分按体积比计，包括5％APTES、5％去离子水和90％纯乙醇。
4.根据权利要求2所述的喹诺酮类药物残留的检测方法，其特征在于：
所述S104中，所述戊二醛PBS溶液中，戊二醛的质量分数为2.5％；所述喹诺酮类单克隆抗体PBS溶液中，喹诺酮类单克隆抗体的浓度为0.5mg/mL。
5.根据权利要求1所述的喹诺酮类药物残留的检测方法，其特征在于，
所述S1具体包括：将0.2g偶联有喹诺酮类单克隆抗体的玻璃微珠填充在2mL注射器中，两端用筛板固定，得到免疫亲和注射器。
6.根据权利要求1所述的喹诺酮类药物残留的检测方法，其特征在于，
所述S2具体包括：
S201：采用所述免疫亲和注射器对1mL待测样品进行萃取，抽吸速率为3.5mL/min，萃取时间为15min；
S202：萃取完毕后，采用超纯水洗去免疫亲和注射器内部残留的药物，然后用600μL甲醇PBS溶液洗脱5min，重复洗脱1次，合并两次洗脱液，得到所述洗脱液。
7.根据权利要求6所述的喹诺酮类药物残留的检测方法，其特征在于，
所述S202中，所述甲醇PBS溶液中，甲醇和PBS溶液的体积比为9:1。
8.根据权利要求1所述的喹诺酮类药物残留的检测方法，其特征在于：
所述S3中，所述流动相包括A相和B相，所述A相为体积分数为0.1％的甲酸水溶液，所述B相为乙腈；所述流动相的用量为200μL。
9.根据权利要求1所述的喹诺酮类药物残留的检测方法，其特征在于，
所述S3中，所述高效液相色谱分析包括：5μm，4.6×150mm的InertSustan C18色谱柱，柱温：30；荧光检测器FLD检测波长：激发波长280nm，发射波长450nm；进样体积：20μL；流动相：A相为体积分数为0.1％的甲酸水溶液，B相为乙腈；等度洗脱程序：80％A；流速：0.6mL/min。
10.权利要求1-9任一项权利要求所述的喹诺酮类药物残留的检测方法在检测牛奶中喹诺酮类药物残留中的应用。
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