CN101533014A - 一种快速检测双酚a的胶体金层析试纸条及制备方法 - Google Patents

Abstract

一种快速检测双酚A的胶体金层析试纸条及制备方法，属于生物学免疫方法的检测技术领域。本发明的检测试纸条由衬板和在衬板上依次衔接的样品垫、金标结合垫、包被膜和吸水垫组成，金标结合垫为吸附双酚A金标抗体的玻璃纤维棉，在包被膜上有用双酚酸偶联的载体蛋白溶液印制的直线式隐形检测线T线，用羊抗兔IgG溶液印制的直线式隐形对照线C线，两条线平行排列。本试纸条特异性强，敏感性高，检出最低限量可达到5ppb；简便、快速、时效性强，无需任何其它试剂和仪器，可现场操作，试纸条加入被检样品液后，在15分钟内即可判定检测结果；结果显示形象、直观、准确；节省费用，适用范围广，便于推广。

Description

一种快速检测双酚A的胶体金层析试纸条及制备方法

技术领域

一种快速检测双酚A的胶体金层析试纸条及制备方法，属于生物学免疫方法的检测技术领域。

背景技术

双酚A(Bisphenol A，BPA)是近几年从食品包装材料中新发现的一种“破坏内分泌化学物质(Endocrine Disrupting Chemicals，ECD)”，具有某些雌激素特性。BPA的发现引起了各国对食品及包装材料的广泛关注，已相继有从蔬菜罐头、婴儿用调制液、食品罐等检出BPA的报道。BPA是生产PC树脂及环氧(EP)树脂的主要原料，又用于酚醛树脂、可塑性聚酯、抗氧剂及聚氯乙烯(PVC)稳定剂等。因此，在食品包装材料、容器内壁涂料等方面有着重要的用途。在职业生产和日常生活中，BPA可通过皮肤、呼吸道、消化道等途径进入人体，BPA对皮肤、呼吸道、消化道和角膜均有中等强度刺激性。人类主要通过食用含有BPA材料包装的食物，使用婴儿奶瓶，牙科填充物和密封罐等摄入BPA。双酚A是一种弱雌性激素，对雄性生殖系统有一定的损害，具有内分泌干扰物作用，可能会引起性早熟，对胚胎也会有一定影响。BPA在低剂量时即具有DNA氧化损伤作用。BPA能诱导染色体异常，并能影响宿主的非特异性免疫防御系统。因此其食品包装材料中的残留也越来越引起了国内外的重视。现有的仪器检测法虽然有灵敏度高、适用范围广等优点，但是样品前处理复杂，所需的仪器昂贵，成本高，检测时间长，而且只有特定的专业技术人员才能操作，不能进行现场检测，时效性差，难以推广，很难实现对BPA进行快速、准确的检测。ELISA法以竞争性酶联免疫反应为检测原理，缩短了检测时间，可以定性定量检测。但ELISA方法需要配套的酶标仪和配套试剂，操作过程仍较复杂，因而ELISA方法的应用受到了较大限制。

发明内容

本发明的目的：针对现有检测双酚A的技术的不足和缺陷，提供一种快速检测双酚A的金标层析试纸条及制备方法，使其能更加快速、灵敏、简便地检测双酚A残留。

本发明的技术方案：一种双酚A胶体金层析检测试纸条，由衬板和在衬板上依次衔接的样品垫、金标结合垫、包被膜和吸水垫组成，金标结合垫为吸附双酚酸BHPVA金标抗体的玻璃纤维棉，在包被膜上有用BHPVA偶联的载体蛋白溶液印制的直线式隐形检测线T线，用羊抗兔IgG溶液印制的直线式隐形对照线C线，两条线平行排列。

所述的衬板为不吸水的韧性材料；所述的韧性材料为硬质塑胶条，或不吸水硬纸条；

所述的样品垫为玻璃纤维棉，或为尼龙膜，或为聚偏二氟乙烯膜，或为聚酯膜；

所述的金标结合垫为吸附BHPVA金标抗体的玻璃纤维棉；

所述的包被膜为硝酸纤维素膜，或为纯纤维素膜，或为羧化纤维素膜；

所述的吸水垫为吸水滤纸或滤油纸。

所述的BHPVA金标抗体为胶体金标记的BHPVA多克隆抗体，所述的偶联BHPVA的载体蛋白为牛血清白蛋白BSA，或为鸡卵清白蛋白OVA。

所述试纸条的制备方法，首先制备偶联BHPVA载体蛋白，用于制备相应的检测线T线和抗体；制备BHPVA金标抗体，用于制备吸附BHPVA金标抗体的玻璃纤维棉；制备羊抗兔IgG抗体，用于制备对照线C线；

(1)、将BHPVA与载体蛋白BSA进行偶联制备人工结合抗原BHPVA-BSA：

(2)、将人工结合抗原BHPVA-BSA按常规方法免疫制得抗BHPVA多抗；

(3)、用柠檬酸三钠还原剂将氯金酸还原制成20nm-40nm的胶体金溶液；

(4)、用0.1mol/L K₂CO₃或0.1mol/L HCl调节胶体金溶液为pH9.0，将10mL胶体金溶液加入50mL烧杯中，用电磁搅拌器250rpm搅拌，逐滴加入150μL多抗溶液，平衡过夜，逐滴加入5％BSA，使BSA的终浓度为1％，持续搅拌5min，再将金标抗体溶液常温3000rpm离心15min，弃去由凝聚的金颗粒形成的沉淀，余下的溶液体积以下称原体积，取该余下的红色上清溶液于4℃以11000rpm离心40min，溶液分为二层：透明上清及管底可流动的暗红色沉淀；轻吸并弃去上清液，将可流动的暗红色沉淀用重悬液混悬，恢复原体积后再离心；重复2～4次，以彻底除去未结合的蛋白质，最后用重悬液将沉淀混悬为原体积的1/10，4℃保存备用，获得BHPVA胶体金标记抗体；

所述重悬液为含5％蔗糖的0.002mol/L pH9.0的硼酸钠缓冲液；

(5)、将1:100～500稀释的BHPVA胶体金标记抗体吸附于玻璃纤维棉中，37℃干燥，制备BHPVA金标结合垫；

(6)、在包被膜上用BHPVA偶联的载体蛋白溶液印制直线式隐形检测线T线，用羊抗兔IgG溶液印制直线式隐形对照线C线，两条线平行排列；

(7)、试纸条的组装：将样品垫、金标结合垫、包被膜和吸水垫由一端依次粘附在衬板上，即得到用于免疫检测的双酚A胶体金层析检测试纸条。

胶体金层析试纸条检测反应原理

双酚A(Bisphenol A，BPA)，属于小分子物质。本发明采用竞争法，即样品中的双酚A和固定在包被膜上的包被抗原BHPVA-OVA竞争胶体金标记的抗BHPVA多克隆抗体。

当试纸条以样品垫末端浸入样本后，样品溶液沿着试纸条通过毛细作用从下往上泳动，溶解金标垫上干燥的金标抗体，若待测样品中不存在待测药物，则金标抗体会直接泳动到检测线和硝酸纤维膜上的BHPVA-OVA发生免疫反应，从而胶体金颗粒发生聚集，形成红色的线条，然后其他未结合的金标抗体继续通过毛细管作用向前泳动，与对照线上的羊抗兔二抗发生第二次免疫反应，同样形成红色线条，这样包被膜上就会有两条红色线条，表示样品为阴性。若待测样品中存在待测药品，则金标抗体首先会和样品中的检测物发生免疫反应，当未发生反应的金标抗体有剩余时，才会在检测线上与BHPVA-OVA发生免疫反应，形成红色线条，其颜色强度弱于阴性时的线条强度；而当金标抗体全部和样品中的双酚A发生免疫结合时，就不会再有抗体与对照线包被原结合，从而检测线就不会有红色线条出现。对照线是为检验金标免疫层析方法本身是否有效而设定的，所以无论样品中是否存在待测药物双酚A，对照线都应该显现。如果对照线不显色，则说明试纸条失效。

本发明的有益效果：本发明的检测试纸条具有下列优点：

①特异性强，敏感性高。该胶体金层析检测试纸条以胶体金标记高亲和力的多克隆抗体为基础制备而成，金标抗体中金颗粒与抗体分子之间无共价键形成，二者通过异性电荷间的范德华力相结合，胶体金标记对抗体的特异性和亲和力影响很小，且具有较高的标记率。因此，试纸条具有较强的特异性和较高的敏感性，检出最低限量可达到5ppb。

②简便、快速、时效性强。使用胶体金层析检测试纸条和试纸卡，无需任何其它试剂和仪器，可现场操作，试纸条加入被检样品液后，在15分钟内即可判定检测结果。

③结果显示形象、直观、准确。检测试纸条均以显示红色线T线和C线作为检测结果阳性和阴性标记，即在包被膜上显示一条红色线C线时，表示在被检样品中含有被检物，显示两条红色线T线和C线时，表示在被检样品中不含被检物。结果判定形象、直观、准确，简单明了，不易出现假阳性和假阴性等人为误判。

④节省费用，适用范围广，便于推广。使用检测试纸条，比用仪器分析和ELISA试剂盒的费用大幅下降。另外，试纸条的适用范围广，可满足不同层次人员需要，包括专业检验，海关检疫，卫生检疫，质量监测，加工企业和养殖场户等，便于推广应用，具有广阔的市场前景和明显的经济、社会效益。

附图说明

图1、双酚A胶体金层析检测试纸条剖面结构示意图。

图2、双酚A胶体金层析检测试纸条俯视结构示意图。

具体实施方式

要制成双酚A检测试纸条，首先需要制备偶联BHPVA载体蛋白，用于制备相应的检测线(T线)和抗体；而且需要制备BHPVA金标抗体，用于制备相应的金标抗体纤维棉；另外需要制备羊抗兔IgG抗体，用于制备对照线(C线)。

1、BHPVA与载体蛋白偶联

活性酯法：将双酚A的类似物双酚酸(BHPVA)与载体蛋白BSA进行偶联制备人工结合抗原BHPVA-BSA。具体制备方法如下：

7.2mg(0.025mmol)双酚酸溶于1mL DMSO(二甲基亚砜)溶液中，充分溶解后分别加入EDC(碳二亚胺)和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)室温搅拌反应3h，为A液。45mg(0.00068mmol)牛血清白蛋白(BSA)溶于4mL NaHCO₃(0.1mol/L)溶液中后逐滴加入上述反应液，室温下搅拌反应3h，即得人工抗原混合液。

透析袋前处理：取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去离子水冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用。

将人工抗原混合液移入透析袋中，用2×2L的0.01M的PBS溶液和2×2L的去离子水透析3天。最后使用冻干法将透析袋中的液体制成粉末，即得到人工抗原：BHPVA-BSA。

2、抗BHPVA多克隆抗体的制备

多抗制备：用BHPVA-BSA抗原免疫新西兰白兔，免疫剂量为1mg/次，背部皮下多点注射。首免，用BHPVA-BSA抗原与等量弗氏完全佐剂(FCA)混合，充分乳化；加强免疫，用BHPVA-BSA抗原与等量弗氏不完全佐剂(FIA)混合，充分乳化，首免后3周进行，连续免疫4-5次，每次间隔2～3周，最后一次免疫后10～15天，以ELISA法测其定效价达到10⁵以上时，采血并分离收集血清。以饱和硫酸铵盐析法提取IgG抗体，-20℃冻存备用。

3、BHPVA金标抗体和金标物结合垫的制备

柠檬酸三钠还原法制备胶体金：由于氯化金极易吸湿，因此使用小剂量封装的氯化金时，必须一次配完。将1g的氯化金一次溶解于双蒸水中配成1％的水溶液。放在4℃冰箱内保存，保存时间长达几个月至1年左右。再取1％的氯金酸溶液10mL，配制成浓度为0.1g/L的氯金酸溶液。取0.1g/L氯金酸溶液50mL放入锥形瓶，用恒温电磁搅拌器加热至沸腾并持续2min，在100r/min磁力搅拌下，加入1％柠檬酸三钠水溶液2mL，保持温度和搅拌速度不变，继续搅拌加热6min，直至溶液呈透亮的酒红色。室温冷却，4℃保存备用。获得直径为20-40nm的胶体金溶液。

用0.1mol/L K₂CO₃或0.1mol/L HCl调节胶体金溶液为pH9.0，将10mL胶体金溶液加入50mL烧杯中，用电磁搅拌器250rpm搅拌，逐滴加入150μL抗体溶液，平衡过夜。逐滴加入5％ BSA，使BSA的终浓度为1％，持续搅拌5min，以饱和游离的胶体金。再将金标抗体溶液常温低速(3000rpm)离心15min，弃去由凝聚的金颗粒形成的沉淀。取红色上清溶液于4℃以11000rpm离心40min。溶液分为二层：透明上清及管底可流动的暗红色沉淀。轻吸并弃去上清液，将可流动的暗红色沉淀用重悬液混悬，恢复原体积后再离心。如此重复2～4次。以彻底除去未结合的蛋白质。最后用重悬液将沉淀混悬为原体积的1/10，4℃保存备用，获得BHPVA胶体金标记抗体。

将1:100～500稀释的胶体金标记抗体吸附于精制玻璃纤维棉中，37℃干燥，制备BHPVA金标物结合垫。

实施例1：把0.5mg/mL的包被抗原及羊抗兔IgG喷在包被膜上，分别作为检测线(T)和对照线(C)，在37℃烘箱干燥10min。以同样方法，将一定浓度的金标抗体包被在结合垫上。试纸条组成为一个衬板，在其上按顺序粘上样品垫、胶体金结合垫、包被膜和吸水垫。将贴好的板切割成3mm宽的条，然后将试纸条与干燥剂一起装入铝箔袋内密封保存。

检测操作方法：将双酚A胶体金层析检测试纸条样品端插入待测样品液中，插入深度不超过标记线，约10～20秒钟取出检测试纸条，水平放置，15分钟左右观察判定检测结果。

结果判定：如果在包被膜上仅有C线一条红线显现，表示检测结果为阳性，说明在待测样品中含有双酚A；如果在包被膜上C线和T线两条红线都显现，表示检测结果为阴性，说明在待测样品中不含双酚A或含量低于检测限；如果在包被膜上C线红线不显现，则表明试纸条已失效。

Claims (4)

1.一种双酚A胶体金层析检测试纸条，其特征在于由衬板和在衬板上依次衔接的样品垫、金标结合垫、包被膜和吸水垫组成，金标结合垫为吸附双酚酸BHPVA金标抗体的玻璃纤维棉，在包被膜上有用BHPVA偶联的载体蛋白溶液印制的直线式隐形检测线T线，用羊抗兔IgG溶液印制的直线式隐形对照线C线，两条线平行排列。

2.根据权利要求1中所述的试纸条，其特征是：所述的衬板为不吸水的韧性材料；所述的韧性材料为硬质塑胶条，或不吸水硬纸条；

所述的样品垫为玻璃纤维棉，或为尼龙膜，或为聚偏二氟乙烯膜，或为聚酯膜；

所述的金标结合垫为吸附BHPVA金标抗体的玻璃纤维棉；

所述的包被膜为硝酸纤维素膜，或为纯纤维素膜，或为羧化纤维素膜；

所述的吸水垫为吸水滤纸或滤油纸。

3.根据权利要求1中所述的试纸条，其特征是：所述的BHPVA金标抗体为胶体金标记的BHPVA多克隆抗体，所述的偶联BHPVA的载体蛋白为牛血清白蛋白BSA，或为鸡卵清白蛋白OVA。

4.权利要求1所述试纸条的制备方法，其特征在于首先制备偶联BHPVA载体蛋白，用于制备相应的检测线T线和抗体；制备BHPVA金标抗体，用于制备吸附BHPVA金标抗体的玻璃纤维棉；制备羊抗兔IgG抗体，用于制备对照线C线；

(1)、将BHPVA与载体蛋白BSA进行偶联制备人工结合抗原BHPVA-BSA：

(2)、将人工结合抗原BHPVA-BSA按常规方法免疫制得抗BHPVA多抗；

(3)、用柠檬酸三钠还原剂将氯金酸还原制成20nm-40nm的胶体金溶液；

(4)、用0.1mol/L K₂CO₃或0.1mol/L HCl调节胶体金溶液为pH 9.0，将10mL胶体金溶液加入50mL烧杯中，用电磁搅拌器250rpm搅拌，逐滴加入150μL多抗溶液，平衡过夜，逐滴加入5％ BSA，使BSA的终浓度为1％，持续搅拌5min，再将金标抗体溶液常温3000rpm离心15min，弃去由凝聚的金颗粒形成的沉淀，余下的溶液体积以下称原体积，取该余下的红色上清溶液于4℃以11000rpm离心40min，溶液分为二层：透明上清及管底可流动的暗红色沉淀；轻吸并弃去上清液，将可流动的暗红色沉淀用重悬液混悬，恢复原体积后再离心；重复2～4次，以彻底除去未结合的蛋白质，最后用重悬液将沉淀混悬为原体积的1/10，4℃保存备用，获得BHPVA胶体金标记抗体；

所述重悬液为含5％蔗糖的0.002mol/L pH 9.0的硼酸钠缓冲液；

(5)、将1:100～500稀释的BHPVA胶体金标记抗体吸附于玻璃纤维棉中，37℃干燥，制备BHPVA金标结合垫；

(6)、在包被膜上用BHPVA偶联的载体蛋白溶液印制直线式隐形检测线T线，用羊抗兔IgG溶液印制直线式隐形对照线C线，两条线平行排列；

(7)、试纸条的组装：将样品垫、金标结合垫、包被膜和吸水垫由一端依次粘附在衬板上，即得到用于免疫检测的双酚A胶体金层析检测试纸条。

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