CN104090100B - 布鲁氏菌抗体金标快速检测试剂盒 - Google Patents

布鲁氏菌抗体金标快速检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种布鲁氏菌抗体金标快速检测试剂盒，属于临床医学检测领域。所述试剂盒由卡盒与试纸条两部分组成：卡盒包括盒盖(4)与盒底(7)，卡盒内置检测试纸条。卡盒正面可见加样孔(1)和检视窗(2)，盒盖正面印有加样孔标注(5)、结果判别说明(6)、信息记录栏(3)。本发明应用胶体金免疫层析技术，以工程表达的布鲁氏菌BP26、OMP25或OMP31抗原为检测抗原，以高效抗人IgG单克隆抗体作为捕获抗体制作“间接法”检测试剂盒，可检测人体血清、血浆或全血中布鲁氏菌的抗体，具有检测方法简单，结果显示准确、快速，无需特殊仪器设备的优点。

Description

布鲁氏菌抗体金标快速检测试剂盒
技术领域
本发明属临床医学检测技术领域，具体涉及胶体金免疫层析检测技术。
背景技术
布鲁氏菌（Brucella）属于兼性胞内寄生的革兰氏阴性球杆菌，无孢子和荚膜，不运动，已经确认布鲁氏菌有9个种，其中具有致病性的有7个种，包括B.abortus、B.melitensis等。布鲁氏菌能引起人和多种动物的急、慢性感染，其引发的疾病简称布病，被感染的人和动物表现流产及不孕不育等症状。所有数据显示全世界由于布病引起的损失是严重的，既包括对动物产品所带来的直接经济损失，如奶产量下降、流产、延迟受孕等，也包括对公共卫生等所造成的间接经济损失，如治疗的费用及生育能力下降等。由于布鲁氏菌具有高致病性和快速雾化的特性，美国疾病预防控制中心（CDC）已经将布鲁氏菌的3个种列为潜在的生物武器。因为其初始症状很容易和流行性感冒相混淆，布病感染后较难做出诊断。
目前，布鲁氏菌的检测方法主要分为病原分离培养、血清学试验和核酸检测等。病原分离培养主要通过其培养特性及生化试验指标进行鉴别，该方法耗时长，不利于临床快速诊断；核酸检测主要利用各式PCR进行检测，包括多重PCR、巢式PCR、实时荧光定量PCR等，此类方法敏感度好且准确性相对较高，但需要专业的仪器设备进行检验操作；常用的血清学检测方法包括试管凝集试验（SAT）、补体结合试验（CF）、乳汁环状试验（MKT）、虎红平板凝集试验（RBT）及酶联免疫吸附试验（ELISA）等，这些方法大多需要专业的设备或操作人员进行试验，对试验条件要求较高，而胶体金免疫层析（GICA）技术可以克服其它检测方法耗时长、需要专业仪器设备等缺点。
根据徐卫民等2006年的一项研究，滴金免疫测定法的敏感性为95．35%，特异性为98．99%，其与SAT的符合率为97．89%；2008年朱明东等将GICA应用于牛布鲁氏菌病检测，表明GICA方法具有试剂敏感、特异，而且血清用量少，操作简便的特点；2009年邵丰尧等将GICA在布鲁氏菌病监测地区进行了现场应用，同时采用RBT进行检测，验证其检测效果，再次证明了GICA与RBT同样具有较好的敏感性，但是GICA还具有操作简便、快速、微量等优点。从以上的研究来看，GICA具有迅速、准确、方便的特点，在布病诊断中显示了广阔的应用前景。
BP26、OMP31和OMP25是三种布鲁氏菌的结构抗原。OMP是外膜蛋白的简称(outermembraneproteins，OMPs)，其中OMP25据PCR-RFLP分析表明，在布鲁氏菌种及生物型变种中是一个高度保守的基因片段，而OMP31存在于除B.abortus之外其它所有的布鲁氏菌中，免疫原性良好；BP26（periplasmicprotein26）是一种具有强免疫原性、可以由细胞内向外释放的可溶性外周浆蛋白，相对于固定的外膜蛋白来说，具有易于检测的优点。本发明以GICA技术为基础，以工程表达的BP26、OMP31和OMP25抗原为检测抗体制作检测试剂盒。
发明内容
本发明旨在提供一种布鲁氏菌抗体金标快速检测试剂盒，用于人体血清、血浆或全血中布鲁氏菌抗体的检测，对布鲁氏菌感染进行辅助诊断。本发明可解决人体布病感染检测需专业仪器及耗时长等问题，提供一种检测特异性强、操作简单快速的试剂盒，可广泛用于各级医疗机构及体检普查的检测。
本发明包括卡盒和试纸条两部分。
所述卡盒包括盒盖和盒底两部分，材质为ABS树脂（丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物）；盒盖与盒底由柱和柱槽以插接方式连接，盒盖与盒底均为圆角长方形；卡盒正面可见加样孔和检视窗，加样孔为长圆形，检视窗为长方形；在检视窗位置可见反应膜、检测线T和质控线C，在加样孔位置可见试纸条样品垫；盒盖正面印有加样孔标注、结果判别说明及信息记录栏。
所述试纸条置于卡盒内部，安放在盒底上的试纸条槽中；试纸条由基板、双面胶、胶体金垫、样品垫、胶带、反应膜、吸样垫组成。基板材质为PVC塑料（聚氯乙烯），样品垫及胶体金垫材质为无纺布，反应膜为硝酸纤维素膜，吸样垫材质为吸油纸。所述试纸条以高效鼠源抗人IgG单克隆抗体作为捕获抗体，用胶体金标记形成抗人IgG-胶体金复合物并固化于胶体金垫上；以工程表达的布鲁氏菌BP26、OMP25或OMP31抗原包被于反应膜检测线T位置；质控线C位置包被有羊或兔抗鼠IgG抗体。
本发明应用胶体金免疫层析技术，旨在检测血清、血浆或全血中的布鲁氏菌抗体。检测时，若待测样品中含有达到阈值的布鲁氏菌抗体，足量的布鲁氏菌抗体与胶体金垫中的抗人IgG-胶体金复合物形成布鲁氏菌抗体-抗人IgG-胶体金复合物，在毛细作用下，布鲁氏菌抗体-抗人IgG-胶体金复合物在反应膜上移动，在检测线T处与工程表达的布鲁氏菌BP26、OMP25或OMP31抗原结合形成肉眼可见的红色检测线T，而未与布鲁氏菌抗体结合的抗人IgG-胶体金复合物则越过检测线T与包被在反应膜质控线C位置的羊或兔抗鼠IgG抗体结合形成红色质控线C；若样本中无达阈值的布鲁氏菌抗体，则检测线T不可见，只见红色质控线C。
本发明调整胶体金标记技术，有效组合抗体蛋白，使所述试剂盒可在常温下（4℃~30℃）保存；同时，本发明具有免疫胶体金技术操作简单、结果判读快速、无需特殊设备的优点。
附图说明
图1是本发明的外观立体示意图。
图2是本发明的盒盖（4）背面示意图。
图3是本发明的盒底（7）正面示意图。
图4是本发明的试纸条正面示意图。
图5是本发明的试纸条侧面示意图。
图中各数字表示内容如下：1.加样孔2.检视窗3.信息记录栏4.盒盖5.加样孔标注6.结果判别说明7.盒底8.柱9.柱槽10.试纸条槽11.样品垫12.胶带13.反应膜14.检测线15.质控线16.吸样垫17.基板18.双面胶19.胶体金垫。
具体实施方式
提供下述实施例是为了进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征相组合而得出的任何与本发明相同或相似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
本发明包括卡盒和试纸条两部分，下面结合说明书附图，对本发明外观进行简述：图1所示为所述试剂盒外观立体图，盒体分为盒盖（4）与盒底（7）两部分，盒盖与盒底均为圆角长方形；盒体正面可见加样孔（1）和检视窗（2），加样孔为长圆形，检视窗为长方形；在加样孔位置可见图4所示试纸条样品垫（11），在检视窗位置可见反应膜（13）、检测线（14）和质控线（15）；盒盖正面印有加样孔标注（5）、结果判别说明（6）、信息记录栏（7）。
图2和图3分别是盒体打开后，盒盖（4）背面与盒底（7）正面的示意图，整个盒体由图2所示柱（8）和图3所示柱槽（9）以插接方式连接；图4所示试纸条置于盒体内部，具体位置在图3所示盒底（7）上的卡槽（10）中；将盒底、试纸条与盒盖组装接合后呈图1所示。
图4所示为试纸条正视图，图5所示为试纸条侧视图。试纸条最底层为基板（17），材质为PVC塑料（聚氯乙烯）；基板上附着一层双面胶（18）用于固定基板与其他部件；试纸条前端（图4、图5所示左侧）放置胶体金垫（19），并覆盖一层较长样品垫（11），样品垫及胶体金垫材质为无纺布，胶体金垫上吸附有胶体金标记的抗人IgG单克隆抗体；胶体金垫右端压在反应膜（13）上，并以胶带（12）在上端固定，反应膜材质为硝酸纤维素膜，反应膜上包被有检测抗体（即检测线T（14））和控制抗体（即质控线C（15））；试纸条末端（图4、图5所示右侧）为吸样垫（16），吸样垫左端覆盖反应膜右端，以提供毛细作用力并吸收样品余液，吸样垫材质为吸油纸。
本发明卡盒部分选择有资质的供应商进行定制，现对试纸条制备方法进行描述：所述试纸条的胶体金垫制备方法如下：①胶体金的制备：在浓度为0.004%~0.012%的氯金酸中加入其体积的1.3%~2%、浓度为1%~3%的柠檬酸三钠，煮沸10~20分钟，得到胶体金溶液；②胶体金标记抗人IgG：将①中所得胶体金溶液中用0.2M碳酸钾溶液调pH至8.0~9.0，加入一定量抗人IgG，置磁力搅拌器上搅拌均匀后，按0.1~0.6g/100ml在溶液中加入动物血清蛋白，4℃静置2小时；③将②中所得抗人IgG-胶体金混合溶液经1000转/分钟离心30分钟，弃上清液，取沉淀物；④将③中所得沉淀物按4~10ml/100ml溶于0.02MpH7.4Tris-Hcl缓冲液（含0.2%~0.6%的动物血清蛋白和0.01%~0.06%叠氮钠）中，得到抗人IgG-胶体金复合物溶液；⑤将无纺布浸入④中所得胶体金溶液中，待浸入的无纺布有液体渗出后，37℃干燥，即得包被有抗人IgG-胶体金复合物的胶体金垫。
所述试纸条反应膜上的检测线T和质控线C的包被方法如下：取高浓度布鲁氏菌BP26、OMP25或OMP31抗原，调浓度至1mg/ml，加入适量甲醛，用专用喷膜机在反应膜中段包被检测线T；取高浓度羊或兔抗鼠IgG抗体，调浓度为2mg/ml，加入适量甲醛，用专用喷膜机在反应膜中段距检测线T4~5mm处包被质控线C；检测线T和质控线C均按10~20μl/ml设置喷量，反应膜完成包被后，立即置入45℃烘箱中，干燥1小时即得。
本发明使用时需添加一定浓度的磷酸盐稀释液，稀释液成分如下：每1000mL稀释液含0.004MNa2HPO4，0.001MNaH2PO4，0.15MNaCl，溶剂为蒸馏水。
使用所述试剂盒检测方法如下：将干燥密封的试剂盒从包装内取出，平放在实验室台面上，用移液器吸取待测样本（血清、血浆或全血）10μL加入加样孔，再向加样孔中滴加稀释液100μL，同时将样本编号填写在盒盖正面信息记录栏，开始观察结果；20分钟内，观察检视窗处质控线C和检测线T是否显红色；若质控线C和检测线T显红色，则说明样本中有达到阈值的布鲁氏杆菌抗体IgG检测结果呈阳性；若仅质控线C显色，则检测结果呈阴性。

Claims (1)

1.一种布鲁氏菌抗体金标快速检测试剂盒，其特征在于包含卡盒和试纸条两部分，卡盒分为盒盖与盒底两部分，盒盖与盒底由柱和柱槽以插接方式连接，盒盖与盒底均为圆角长方形；卡盒正面可见加样孔和检视窗，加样孔为长圆形，检视窗为长方形；在加样孔位置可见试纸条样品垫，在检视窗位置可见反应膜、检测线T和质控线C；盒盖正面印有加样孔标注、结果判别说明、信息记录栏；试纸条置于卡盒内部的盒底上的卡槽中，由基板、双面胶、样品垫、胶体金垫、胶带、反应膜、吸样垫组成，胶体金垫上吸附有胶体金标记的高效鼠源抗人IgG单克隆抗体，反应膜上包被有工程表达的布鲁氏菌BP26、OMP25或OMP31抗原（T）和质量控制抗体羊或兔抗鼠IgG抗体（C），试纸条的胶体金垫制备方法如下：
（1）胶体金的制备：在浓度为0.004%-0.012%的氯金酸中加入其体积的1.3%-2%、浓度为1%-3%的柠檬酸三钠，煮沸10-20分钟，得到胶体金溶液；
（2）胶体金标记抗人IgG：将步骤（1）中所得胶体金溶液用0.2M碳酸钾溶液调pH至8.0-9.0，加入一定量抗人IgG，置磁力搅拌器上搅拌均匀后，按0.1-0.6g/100ml加入动物血清蛋白，4℃静置2小时，1000转/分钟离心30分钟，弃上清液，沉淀物按4-10ml/100ml溶于0.02MpH7.4、含0.2%-0.6%的动物血清蛋白和0.01%-0.06%叠氮钠的Tris-Hcl缓冲液中，得到抗人IgG-胶体金复合物溶液；
（3）将无纺布浸入步骤（2）所得胶体金溶液中，待浸入的无纺布有液体渗出后，37℃干燥，即得包被有抗人IgG-胶体金复合物的胶体金垫。
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