CN104076147A - 人型支原体金标快速检测试剂盒 - Google Patents

人型支原体金标快速检测试剂盒 Download PDF

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杜惠芬
杨立雅
王开倩
辛彬先
武建海
王金芳
范丽赟
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Abstract

本发明公开了一种人型支原体金标快速检测试剂盒，属于临床医学检测领域。所述试剂盒由卡盒与试纸条两部分组成：卡盒包括盒盖(4)与盒底(7)，卡盒内置检测试纸条。卡盒正面可见加样孔(1)和检视窗(2)，盒盖正面印有加样孔标注(5)、结果判别说明(6)、信息记录栏(3)。本发明应用胶体金免疫层析技术，以工程表达的人型支原体Lmp1蛋白为抗原制备单克隆抗体，筛选配对性良好的一对高性能抗人型支原体Lmp1单抗分别作为捕获抗体和检测抗体，可检测人体泌尿生殖道分泌物中人型支原体，具有检测方法简单，结果显示准确、快速，无需特殊仪器设备的优点。

Description

人型支原体金标快速检测试剂盒
技术领域
本发明属临床医学检测技术领域，具体涉及胶体金免疫层析检测技术。
背景技术
人型支原体（Mycoplasma hominis，MH）是柔膜菌纲（Mollicutes）支原体属（Mycoplasmas）的一个种，主要寄生在人体泌尿生殖道，能引起男性前列腺炎、尿道炎，女性产后发热、反复流产、死产，新生儿初生重低、脑膜炎、肺炎等疾病。脂关联膜蛋白（Lipid-associated membrane proteins，LAMPs）是MH主要膜表面蛋白，具有高度抗原性并可能是宿主抗体的主要靶位。美国病原微生物所的研究表明，MH LAMPs结构相似，尽管表达量低，但免疫原性强。
检测人型支原体感染的方法有培养法和核酸检测法等。传统的检测方法是培养法，这种方法耗时长且容易出现漏诊，不能很好的适应临床快速检测的要求；而用于核酸检测的PCR方法敏感度好且准确性相对较高，但需要专业的仪器设备进行检验操作。免疫胶体金技术（immunocolloidal gold technique）是一种新型诊断技术，将其与免疫层析技术结合制作的检测试剂盒具有操作简单、无需特殊辅助仪器，结果判读快速等优点。本发明应用胶体金免疫层析技术，选取MH LAMPs中的Lmp1蛋白作为检测抗原，制备检测试剂盒，用于人体泌尿生殖道分泌物标本中的人型支原体检测。
发明内容
本发明旨在提供一种人型支原体金标快速检测试剂盒，用于人体泌尿生殖道分泌物标本中人型支原体抗原的检测，对人型支原体感染进行辅助诊断。本发明可解决人体人型支原体感染检测需专业仪器及耗时长等问题，提供一种检测特异性强、操作简单快速的试剂盒，可广泛用于各级医疗机构及体检普查的检测。
本发明包括卡盒和试纸条两部分。
所述卡盒包括盒盖和盒底两部分，材质为ABS树脂（丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物）；盒盖与盒底由柱和柱槽以插接方式连接，盒盖与盒底均为圆角长方形；卡盒正面可见加样孔和检视窗，加样孔为长圆形，检视窗为长方形；在检视窗位置可见反应膜、检测线T和质控线C，在加样孔位置可见试纸条样品垫；盒盖正面印有加样孔标注、结果判别说明及信息记录栏。
所述试纸条置于卡盒内部，安放在盒底上的试纸条槽中；试纸条由基板、双面胶、胶体金垫、样品垫、胶带、反应膜、吸样垫组成。基板材质为PVC塑料（聚氯乙烯），样品垫及胶体金垫材质为无纺布，反应膜为硝酸纤维素膜，吸样垫材质为吸油纸。所述试纸条利用工程表达的人型支原体Lmp1蛋白为抗原免疫小鼠制备抗Lmp1蛋白单克隆抗体，筛选出配对性良好、亲和力高的一对单克隆抗体分别作为捕获抗体和检测抗体；其中捕获抗体命名为抗体a，检测抗体命名为抗体b；胶体金标记的抗体a吸附于胶体金垫上，反应膜上检测线T位置包被抗体b，质量控制抗体为羊抗鼠IgG抗体。
本发明应用胶体金免疫层析技术，可检测人体泌尿生殖道分泌物标本中的人型支原体。检测时，若待测样品中含有达到阈值的人型支原体Lmp1抗原，足量的人型支原体Lmp1抗原与胶体金垫中的抗体a-胶体金复合物形成 人型支原体Lmp1-抗体a-胶体金复合物，在毛细作用下，人型支原体Lmp1-抗体a-胶体金复合物在反应膜上移动，在检测线T处与抗体b结合形成肉眼可见的红色检测线T，而未与人型支原体Lmp1抗原结合的抗体a-胶体金复合物则越过检测线T与包被在反应膜质控线C位置的羊抗鼠IgG抗体结合形成红色质控线C；若样本中无达阈值的人型支原体Lmp1抗原，则检测线T不可见，只见红色质控线C。
本发明调整胶体金标记技术，有效组合抗体蛋白，使所述试剂盒可在常温下（4℃~30℃）保存；同时，本发明具有免疫胶体金技术操作简单、结果判读快速、无需特殊设备的优点。
附图说明
图1是本发明的外观立体示意图。
图2是本发明的盒盖（4）背面示意图。
图3是本发明的盒底（7）正面示意图。
图4是本发明的试纸条正面示意图。
图5是本发明的试纸条侧面示意图。
图中各数字表示内容如下：1.加样孔 2.检视窗 3.信息记录栏 4.盒盖 5.加样孔标注 6.结果判别说明 7.盒底 8.柱 9.柱槽 10.试纸条槽 11.样品垫 12.胶带 13.反应膜 14.检测线T 15.质控线C 16.吸样垫 17.基板 18.双面胶 19.胶体金垫。
具体实施方式
提供下述实施例是为了进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征相组合而得出的任何与本发明相同或相似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
本发明包括卡盒和试纸条两部分，下面结合说明书附图，对本发明外观进行简述：图1所示为所述试剂盒外观立体图，盒体分为盒盖（4）与盒底（7）两部分，盒盖与盒底均为圆角长方形；盒体正面可见加样孔（1）和检视窗（2），加样孔为长圆形，检视窗为长方形；在加样孔位置可见图4所示试纸条样品垫（11），在检视窗位置可见反应膜（13）、检测线T（14）和质控线C（15）；盒盖正面印有加样孔标注（5）、结果判别说明（6）、信息记录栏（7）。
图2和图3分别是盒体打开后，盒盖（4）背面与盒底（7）正面的示意图，整个盒体由图2所示柱（8）和图3所示柱槽（9）以插接方式连接；图4所示试纸条置于盒体内部，具体位置在图3所示盒底（7）上的试纸条槽（10）中；将盒底、试纸条与盒盖组装接合后呈图1所示。
图4所示为试纸条正视图，图5所示为试纸条侧视图。试纸条最底层为基板（17），材质为PVC塑料（聚氯乙烯）；基板上附着一层双面胶（18）用于固定基板与其他部件；试纸条前端（图4、图5所示左侧）放置胶体金垫（19），并覆盖一层较长样品垫（11），样品垫及胶体金垫材质为无纺布，胶体金垫上吸附有抗体a-胶体金复合物；胶体金垫右端压在反应膜（13）上，并以胶带（12）在上端固定，反应膜材质为硝酸纤维素膜，反应膜上包被有检测抗体（即检测线T（14））和质量控制抗体（即质控线C（15））；试纸条末端（图4、图5所示右侧）为吸样垫（16），吸样垫左端覆盖反应膜右端，以提供毛细作用力并吸收样品余液，吸样垫材质为吸油纸。
本发明卡盒部分选择有资质的供应商进行定制，现对试纸条制备方法进行描述：所述试纸条的胶体金垫制备方法如下：① 胶体金的制备：在浓度为0.004%~0.012%的氯金酸中加入其体积的1.3%~2%、浓度为1%~3%的柠檬酸三钠，煮沸10~20分钟，得到胶体金溶液；② 胶体金标记抗体a：将①中所得胶体金溶液中用0.2M碳酸钾溶液调pH 至8.0~9.0，加入一定量抗体a，置磁力搅拌器上搅拌均匀后，按0.1~0.6g/100ml在溶液中加入动物血清蛋白，4℃静置2小时；③ 将②中所得抗体a-胶体金混合溶液经1000转/分钟离心30分钟，弃上清液，取沉淀物；④ 将③中所得沉淀物按4~10ml/100ml溶于0.02M pH 7.4 Tris-Hcl缓冲液（含0.2%~0.6%的动物血清蛋白和0.01%~0.06%叠氮钠）中，得到抗体a-胶体金复合物溶液；⑤ 将无纺布浸入④中所得胶体金溶液中，待浸入的无纺布有液体渗出后，37℃干燥，即得包被有抗体a-胶体金复合物的胶体金垫。
所述试纸条反应膜上的检测线T和质控线C的包被方法如下：取高浓度抗体b，调浓度至1mg/ml，加入适量甲醛，用专用喷膜机在反应膜中段包被检测线T；取高浓度羊抗鼠IgG抗体，调浓度为2mg/ml，加入适量甲醛，用专用喷膜机在反应膜中段距检测线T 4~5mm处包被质控线C；检测线T和质控线C均按10~20μl/ml设置喷量，反应膜完成包被后，立即置入45℃烘箱中，干燥1小时即得。
使用本发明检测时需用一定浓度的磷酸盐稀释液对样品进行稀释处理，稀释液成分如下：每1000mL稀释液含0.004M Na2HPO4，0.001M NaH2PO4，0.15M NaCl，溶剂为蒸馏水。检测时先将泌尿生殖道分泌物棉签拭子置入无菌试管中加入300μL稀释液搅拌浸泡，溶出样品。
使用所述试剂盒检测方法如下：将干燥密封的试剂盒从包装内取出，平放在实验室台面上，用移液器吸取处理后的样本100μL加入加样孔，同时将样本编号填写在盒盖正面信息记录栏，开始观察结果；20分钟内，观察检视窗处质控线C和检测线T是否显红色；若质控线C和检测线T显红色，则说明样本中有达到阈值的人型支原体Lmp1抗原，检测结果呈阳性；若仅质控线C显色，则检测结果呈阴性。

Claims (4)

1.一种人型支原体金标快速检测试剂盒，其特征在于包含卡盒和试纸条两部分。
2.根据权利要求1所述的人型支原体金标快速检测试剂盒，其特征在于所述卡盒分为盒盖（4）与盒底（7）两部分；盒盖与盒底由柱（8）和柱槽（9）以插接方式连接，盒盖与盒底均为圆角长方形；卡盒正面可见加样孔（1）和检视窗（2），加样孔为长圆形，检视窗为长方形；在加样孔位置可见试纸条样品垫（11），在检视窗位置可见反应膜（13）、检测线T（14）和质控线C（15）；盒盖正面印有加样孔标注（5）、结果判别说明（6）、信息记录栏（3）。
3.根据权利要求1所述的人型支原体金标快速检测试剂盒，其特征在于所述试纸条置于卡盒内部的盒底（7）上的试纸条槽（10）中，由基板（17）、双面胶（18）、样品垫（11）、胶体金垫（19）、胶带（12）、反应膜（13）、吸样垫（16）组成，胶体金垫上吸附有胶体金标记的捕获抗体，反应膜上包被有检测抗体（显示为检测线T（14））和质量控制抗体（显示为质控线C（15））。
4.根据权利要求3所述试纸条，其特征在于利用工程表达的人型支原体Lmp1蛋白为抗原免疫小鼠制备抗Lmp1蛋白单克隆抗体，筛选出配对性良好、亲和力高的一对单克隆抗体分别作为捕获抗体和检测抗体；其中捕获抗体命名为抗体a，检测抗体命名为抗体b；胶体金标记的抗体a吸附于胶体金垫上，反应膜上检测线T位置包被抗体b，质量控制抗体为羊抗鼠IgG抗体。
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