CN108264553B - 一种重金属铅人工抗原的制备方法及nota在制备重金属铅人工抗原试剂中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种重金属铅人工抗原的制备方法，以2‑S‑(4‑氨基苯）‑1，4，7三氮杂环壬烷‑1，4，7‑三乙酸（p‑NH2‑Bn‑NOTA，简称NOTA）为螯合剂，将铅离子螯合剂复合物与载体蛋白牛血清白蛋白BSA或鸡卵清蛋白OVA偶联，制备人工抗原，该方法在原来传统基础上增加了丙二酸二乙酯处理步骤，提高了偶联效率与抗血清效价。对于不同金属，金属性质不同，它们与相同螯合剂的结合比不同，抗血清效价不同；相同金属，它们与不同螯合剂的结合比不同，抗血清效价不同。重金属铅与螯合剂NOTA与丙二酸二乙酯的结合较为稳定且抗血清效价较高。本发明还公开了NOTA在制备重金属铅人工抗原试剂中的应用。
Description
技术领域
本发明属于重金属离子免疫化学技术领域，具体涉及一种重金属铅人工抗原的制备方法及NOTA在制备重金属铅人工抗原试剂中的应用。
背景技术
重金属污染主要指铅、镉、汞、镍、铬、砷、锌、铜等污染物对环境的污染。重金属分布广泛、难以降解，可通过大气、水、食物链进入人体，与体内蛋白质及各种酶发生作用，使它们失去活性，并在某些器官中富集，如果超过人体所能耐受的限度，会造成人体急性或慢性中毒，具有致癌、致畸及致突变作用，对人体具有很大的危害。
不同的重金属都有其不同的属性，例如铅的性质比较稳定，一般的有机物很难与其发生反应。因此，加强重金属在环境、农产品和食品中残留检测成为保障重金属安全的重要手段，而新形势下检测新技术的研究和开发显得尤为迫切。
传统的重金属检测方法主要采用原子吸收光谱分析(Atomic AbsorptionSpectroscopy，AAS)、电感耦合等离子发射光谱(InductiveLy CoupLedpLasma AtomicEmission Spectroscopy，ICP-AES)、阳极溶出伏安法(Anodic Stripping VoLtammetry，ASV)、色谱法和各种联用检测方法。这些方法虽然能对各种环境样品中的重金属离子进行有效分析，但大多需要大型仪器，分析方法成本高，样品需要经过消解，分析时间长，不适于重金属的现场快速检测，难以适应环境及市场产品的现场抽查、生产企业自查及产品进出口快速通关的要求。
免疫学检测技术具有检测速度快、分析容量大、费用低廉、仪器简单易携、使用人员技术要求不高，容易普及和推广、灵敏度高和选择性强等优点，尤其适合现场筛选和大量样品的快速分析，已成为 21世纪最具竞争性和挑战性的检测分析技术。以该技术为基础开发的一系列检测产品，如ELISA检测试剂盒、胶体金试纸条、免疫传感器等已广泛应用于现场样品和大量样品的快速检测。
重金属离子免疫检测的关键在于抗重金属特异性抗体的制备，而特异性抗体制备的关键又在于优质重金属免疫原的合成。一方面，由于重金属离子带有电荷，能与动物体内生物分子发生强烈的不可逆反应，引起动物中毒反应；另一方面，重金属的分子量低，不具有免疫原性，需将它与载体蛋白偶联，才能形成完整的免疫原，但是由于重金属离子直接与蛋白连接，会使蛋白质变性，因此，需利用双功能螯合剂螯合重金属离子，制备金属-螯合剂复合物，将该复合物再与蛋白偶联后制备完全抗原，进而免疫动物制备特异性抗体。采取的是一种开环式的双功能螯合剂进行螯合，后再与载体蛋白偶联制备人工抗原进行动物免疫和抗体的制备，在此基础上建立不同的免疫分析技术和方法。
制备重金属免疫原的关键在于双功能螯合剂的选择，目前常用的双功能螯合剂主要是乙二胺四乙酸(ethyLenediamie tetraacetic acid， EDTA)或二乙烯三胺五乙酸(diethyLene triamine penLaacetic acid， DTPA)的衍生物及其他具有螯合功能的结构类似物，属于链式开环结构的螯合剂，螯合物是由中心离子和多齿配体结合而成的具有环状结构的配合物。例如，EDTA与金属离子通过羧酸基和氮原子键合而形成比络合物更稳定的金属-EDTA螯合物，而双功能螯合剂应具有两个作用，除了能特异性螯合重金属离子之外，还能与载体蛋白偶联，形成免疫原，用于后续免疫动物、制备抗体。这些常规的螯合剂由于是开环式和直链型的结构，重金属离子和螯合剂的复合物作为抗原识别位点在空间结构上比较简单，特征官能团特征不强，导致所制备的抗原决定簇抗原特性不强，直接影响高特异性和高灵敏度抗体的制备效率。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种重金属铅人工抗原的制备方法。制备的重金属铅人工抗原免疫动物后得到的抗体亲和力高，特异性强，抗血清效价高。
新型双功能螯合剂2-S-(4-氨基苯)-1，4，7三氮杂环壬烷-1，4， 7-三乙酸(p-NH2-Bn-NOTA，简称NOTA)具有三氮闭环结构特征，能更好的结合重金属离子，并且在空间结构上能更好的将重金属铅离子的复合三维结构展现出来作为抗原决定簇，抗原特征更明显，有利于制备亲和力更高、特异性更强的重金属单克隆和多克隆抗体，并且戊二醛法将氨基半抗原与载体蛋白偶联，加入丙二酸二乙酯，使生成的重金属铅人工抗原更加稳定，抗血清效价高。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种重金属铅人工抗原的制备方法，包括以下步骤：
称取5-8mg 2-S-(4-氨基苯)-1，4，7三氮杂环壬烷-1，4，7-三乙酸(p-NH2-Bn-NOTA，简称NOTA)，溶解于2mL 0.01M、pH7.4 4- 羟乙基哌嗪乙磺酸HEPES溶液，制得NOTA螯合剂溶液，此溶液为 A液；
称取124.2mg硝酸铅溶解于5mL超纯水中，制得浓度为 7.5×10-2M的硝酸铅溶液，此溶液为B液；
将150-200μL的B液加入到A液中，室温下避光反应3-5h，此反应液为C液；
向C液中逐滴加入500-800μL，20mM的戊二醛溶液，室温避光反应过夜，此反应液为D液；
称取20-30mg牛血清白蛋白BSA或鸡卵清蛋白OVA溶解于3 mL HEPES，室温下磁力搅拌混匀，此反应液为E液；
将D液逐滴加入到E液中，室温下避光反应24h，后加入150-200 μL丙二酸二乙酯溶液(84.6mg溶解于2 00μL乙醇中)，室温下避光反应1h；
反应液先用8KD的透析袋透析3-5次，再用30KD的超滤离心管7000-9000rpm离心3-5次，用5-10mL的0.01M，pH7.4的HEPES 溶液复溶，后分装，-20℃低温保存，制得重金属铅人工抗原。
人工抗原的鉴定：
采取紫外扫描和SDS-PAGE鉴定其偶联效果，采用ICP-MS法和 Bradford法测定重金属离子和蛋白浓度计算人工抗原的偶联结合比。
本发明重金属铅人工抗原的制备方法选用双功能螯合剂NOTA，能更好的结合重金属离子，作为抗原决定簇，制备的重金属单克隆和多克隆抗体亲和力高，特异性强，并且在戊二醛法偶联后中加入丙二酸二乙酯，制备的重金属铅人工抗原更加稳定，抗血清效价高。
附图说明
图1Pb-NOTA-BSA和Pb-NOTA-OVA紫外扫描图谱。
图2Pb-NOTA-BSA和Pb-NOTA-OVA电泳图谱。
图3NOTA、DOTA、DTPA和EDTA的结构图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案、技术效果更加清楚明白，通过以下实施例对本发明进行进一步详细说明。以下对于具体实施方案的描述仅用于解释本发明，并不限定本发明。
实施例1
称取7mg NOTA，溶解于2ml 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES) 溶液(0.01M，pH7.4)，制备成NOTA螯合剂溶液，此反应液为A液；
称取124.2mg硝酸铅溶解于5ml超纯水中，制备成7.5×10-2M 的硝酸铅溶液，此反应液为B液；
吸取180μl的B液逐滴加入到A液中，室温下避光反应3h，此反应液为C液；
向C液中逐滴加入700μl，20mM的戊二醛溶液，室温避光反应过夜，此反应液为D液；
称取20mg牛血清白蛋白(BSA)溶解于4ml HEPES，室温下磁力搅拌混匀，此反应液为E液；
将D液逐滴加入到E液中，室温下避光反应24h，后加入150-200 μL丙二酸二乙酯溶液(84.6mg溶解于2 00μL乙醇中)，室温下避光反应1h；
反应液先用8KD的透析袋透析3次，再用30KD的超滤离心管 8000rpm离心5次，用5ml的0.01M，pH7.4的HEPES溶液复溶，后分装，-20℃低温保存。
经SDS-PAGE显示偶联物电泳条带比单一的蛋白条带有滞后拖尾现象，偶联物的分子量比单一蛋白分子量要大，说明偶联成功，另外紫外扫描显示最大吸收波长有变化，进一步说明偶联成功。通过测定重金属含量和偶联物蛋白浓度计算结合比为28:1，偶联效率高。结合比越高，说明一个蛋白分子上偶联重金属离子的数量越多，偶联效率也越高，结合比为28：1，则表示一个蛋白分子上结合28个重金属离子。
对比例1
称取7mg NOTA，溶解于2ml 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES) 溶液(0.01M，pH7.4)，制备成NOTA螯合剂溶液，此反应液为A液；
称取124.2mg硝酸铅溶解于5ml超纯水中，制备成7.5×10-2M 的硝酸铅溶液，此反应液为B液；
吸取180μl的B液逐滴加入到A液中，室温下避光反应3h，此反应液为C液；
向C液中逐滴加入700μl，20mM的戊二醛溶液，室温避光反应过夜，此反应液为D液；
称取20mg牛血清白蛋白(BSA)溶解于4ml HEPES，室温下磁力搅拌混匀，此反应液为E液；
将D液逐滴加入到E液中，室温下避光反应24h，反应液先用8 KD的透析袋透析3次，再用30KD的超滤离心管8000rpm离心5 次，用5ml的0.01M，pH7.4的HEPES溶液复溶，后分装，-20℃低温保存。
经SDS-PAGE显示偶联物电泳条带比单一的蛋白条带有滞后拖尾现象，偶联物的分子量比单一蛋白分子量要大，说明偶联成功，另外紫外扫描显示最大吸收波长有变化，进一步说明偶联成功。通过重金属含量测定和偶联物蛋白浓度测定计算结合比为10:1。
对比例2
称取7mg p-NH2-Bn-DTPA(以下简称DTPA)，溶解于2ml 4- 羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)溶液(0.01M，pH7.4)，制备成DTPA螯合剂溶液，此反应液为A液；
称取124.2mg硝酸铅溶解于5ml超纯水中，制备成7.5×10-2M 的硝酸铅溶液，此反应液为B液；
吸取190μl的B液逐滴加入到A液中，室温下避光反应3h，此反应液为C液；
向C液中逐滴加入680μl，20mM的戊二醛溶液，室温避光反应过夜，此反应液为D液；
称取20mg牛血清白蛋白BSA溶解于3ml HEPES，室温下磁力搅拌混匀，此反应液为E液；
将D液逐滴加入到E液中，室温下避光反应24h，后加入150-200 μL丙二酸二乙酯溶液(84.6mg溶解于2 00μL乙醇中)，室温下避光反应1h；
反应液先用8KD的透析袋透析3次，再用30KD的超滤离心管 8000rpm离心5次，用5ml的0.01M，pH7.4的HEPES溶液复溶，后分装，-20℃低温保存。
经SDS-PAGE实验和紫外扫描图谱显示偶联成功，通过重金属含量测定和偶联物蛋白浓度测定计算结合比为12:1。
对比例3
称取7mg p-NH2-Bn-EDTA(以下简称EDTA)，溶解于2ml 4- 羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)溶液(0.01M，pH7.4)，制备成EDTA 螯合剂溶液，此反应液为A液；
称取124.2mg硝酸铅溶解于5ml超纯水中，制备成7.5×10-2M 的硝酸铅溶液，此反应液为B液；
吸取180μl的B液逐滴加入到A液中，室温下避光反应3h，此反应液为C液；
向C液中逐滴加入680μl，20mM的戊二醛溶液，室温避光反应过夜，此反应液为D液；
称取20mg牛血清白蛋白BSA溶解于3ml HEPES，室温下磁力搅拌混匀，此反应液为E液；
将D液逐滴加入到E液中，室温下避光反应24h，后加入150-200 μL丙二酸二乙酯溶液(84.6mg溶解于2 00μL乙醇中)，室温下避光反应1h；
反应液先用8KD的透析袋透析3次，再用30KD的超滤离心管 8000rpm离心5次，用5ml的0.01M，pH7.4的HEPES溶液复溶，后分装，-20℃低温保存。
经SDS-PAGE实验和紫外扫描图谱显示偶联成功，通过重金属含量测定和偶联物蛋白浓度测定计算结合比为11:1。
对比例4
称取7mg NOTA，溶解于2ml 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES) 溶液(0.01M，pH7.4)，制备成NOTA螯合剂溶液，此反应液为A液；
称取124.2mg硝酸铅溶解于5ml超纯水中，制备成7.5×10-2M 的硝酸铅溶液，此反应液为B液；
吸取180μl的B液逐滴加入到A液中，室温下避光反应3h，此反应液为C液；
向C液中逐滴加入700μl，20mM的戊二醛溶液，室温避光反应过夜，此反应液为D液；
称取20mg牛血清白蛋白(BSA)溶解于4ml HEPES，室温下磁力搅拌混匀，此反应液为E液；
将D液逐滴加入到E液中，室温下避光反应24h，后加入150-200 μL硼氢化钠溶液(20mg溶解于2 00μL纯水中)，室温下避光反应 1h；
反应液先用8KD的透析袋透析3次，再用30KD的超滤离心管 8000rpm离心5次，用5ml的0.01M，pH7.4的HEPES溶液复溶，后分装，-20℃低温保存。
经SDS-PAGE显示偶联物电泳条带比单一的蛋白条带有滞后拖尾现象，偶联物的分子量比单一蛋白分子量要大，说明偶联成功；另外紫外扫描显示最大吸收波长有变化，进一步说明偶联成功。通过重金属含量测定和偶联物蛋白浓度测定计算结合比为21:1。
对比例5
称取7mg DOTA，溶解于2ml 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES) 溶液(0.01M，pH7.4)，制备成DOTA螯合剂溶液，此反应液为A液；
称取124.2mg硝酸铅溶解于5ml超纯水中，制备成7.5×10-2M 的硝酸铅溶液，此反应液为B液；
吸取180μl的B液逐滴加入到A液中，室温下避光反应3h，此反应液为C液；
向C液中逐滴加入700μl，20mM的戊二醛溶液，室温避光反应过夜，此反应液为D液；
称取20mg牛血清白蛋白(BSA)溶解于4ml HEPES，室温下磁力搅拌混匀，此反应液为E液；
将D液逐滴加入到E液中，室温下避光反应24h，后加入150-200 μL丙二酸二乙酯溶液(84.6mg溶解于2 00μL乙醇中)，室温下避光反应1h；
反应液先用8KD的透析袋透析3次，再用30KD的超滤离心管 8000rpm离心5次，用5ml的0.01M，pH7.4的HEPES溶液复溶，后分装，-20℃低温保存。
经SDS-PAGE显示偶联物电泳条带比单一的蛋白条带有滞后拖尾现象，偶联物的分子量比单一蛋白分子量要大，说明偶联成功，另外紫外扫描显示最大吸收波长有变化，进一步说明偶联成功。通过测定重金属含量和偶联物蛋白浓度计算结合比为19:1，偶联效率高。结合比越高，说明一个蛋白分子上偶联重金属离子的数量越多，偶联效率也越高，结合比为19：1，则表示一个蛋白分子上结合19个重金属离子。
对比例6
称取7mg NOTA，溶解于2ml 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES) 溶液(0.01M，pH7.4)，制备成NOTA螯合剂溶液，此反应液为A液；
称取111.56mg硝酸锌溶解于5ml超纯水中，制备成7.5×10-2M 的硝酸锌溶液，此反应液为B液；
吸取180μl的B液逐滴加入到A液中，室温下避光反应3h，此反应液为C液；
向C液中逐滴加入700μl，20mM的戊二醛溶液，室温避光反应过夜，此反应液为D液；
称取20mg牛血清白蛋白(BSA)溶解于4ml HEPES，室温下磁力搅拌混匀，此反应液为E液；
将D液逐滴加入到E液中，室温下避光反应24h，后加入150-200 μL丙二酸二乙酯溶液(84.6mg溶解于2 00μL乙醇中)，室温下避光反应1h；
反应液先用8KD的透析袋透析3次，再用30KD的超滤离心管 8000rpm离心5次，用5ml的0.01M，pH7.4的HEPES溶液复溶，后分装，-20℃低温保存。
经SDS-PAGE显示偶联物电泳条带比单一的蛋白条带有滞后拖尾现象，偶联物的分子量比单一蛋白分子量要大，说明偶联成功，另外紫外扫描显示最大吸收波长有变化，进一步说明偶联成功。通过测定重金属含量和偶联物蛋白浓度计算结合比为17:1，偶联效率高。结合比越高，说明一个蛋白分子上偶联重金属离子的数量越多，偶联效率也越高，结合比为17：1，则表示一个蛋白分子上结合17个重金属离子。
实施例2
称取7mg NOTA，溶解于2ml 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES) 溶液(0.01M，pH7.4)，制备成DOTA螯合剂溶液，此反应液为A液；
称取124.2mg硝酸铅溶解于5ml超纯水中，制备成7.5×10-2M 的硝酸铅溶液，此反应液为B液；
吸取180μl的B液逐滴加入到A液中，室温下避光反应5h，此反应液为C液；
向C液中逐滴加入700μl，20mM的戊二醛溶液，室温避光反应过夜，此反应液为D液；
称取20mg鸡卵清蛋白OVA溶解于4ml HEPES，室温下磁力搅拌混匀，此反应液为E液；
将D液逐滴加入到E液中，室温下避光反应24h，后加入150-200 μL丙二酸二乙酯溶液(84.6mg溶解于2 00μL乙醇中)，室温下避光反应1h；
反应液先用8KD的透析袋透析3次，再用30KD的超滤离心管 8000rpm离心5次，用5ml的0.01M，pH7.4的HEPES溶液复溶，后分装，-20℃低温保存。
经SDS-PAGE显示偶联物电泳条带比单一的蛋白条带有滞后拖尾现象，偶联物的分子量比单一蛋白分子量要大，说明偶联成功，另外紫外扫描显示最大吸收波长有变化，进一步说明偶联成功。通过重金属含量测定和偶联物蛋白浓度测定计算结合比为24:1，偶联效率高。结合比越高，说明一个蛋白分子上偶联重金属离子的数量越多，偶联率也越高，如结合比为24：1，则表示一个蛋白分子上结合24个重金属离子。
对比例7
称取7mg NOTA，溶解于2ml 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES) 溶液(0.01M，pH7.4)，制备成NOTA螯合剂溶液，此反应液为A液；
称取124.2mg硝酸铅溶解于5ml超纯水中，制备成7.5×10-2M 的硝酸铅溶液，此反应液为B液；
吸取180μl的B液逐滴加入到A液中，室温下避光反应5h，此反应液为C液；
向C液中逐滴加入700μl，20mM的戊二醛溶液，室温避光反应过夜，此反应液为D液；
称取20mg鸡卵清蛋白OVA溶解于4ml HEPES，室温下磁力搅拌混匀，此反应液为E液；
将D液逐滴加入到E液中，室温下避光反应24h；
反应液先用8KD的透析袋透析3次，再用30KD的超滤离心管 8000rpm离心5次，用5ml的0.01M，pH7.4的HEPES溶液复溶，后分装，-20℃低温保存。
经SDS-PAGE显示偶联物电泳条带比单一的蛋白条带有滞后拖尾现象，偶联物的分子量比单一蛋白分子量要大，说明偶联成功，另外紫外扫描显示最大吸收波长有变化，进一步说明偶联成功。通过重金属含量测定和偶联物蛋白浓度测定计算结合比为9:1。
对比例8
称取7mg DTPA，溶解于2ml 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES) 溶液(0.01M，pH7.4)，制备成DTPA螯合剂溶液，此反应液为A液；
称取124.2mg硝酸铅溶解于5ml超纯水中，制备成7.5×10-2M 的硝酸铅溶液，此反应液为B液；
吸取190μl的B液逐滴加入到A液中，室温下避光反应3h，此反应液为C液；
向C液中逐滴加入680μl，20mM的戊二醛溶液，室温避光反应过夜，此反应液为D液；
称取20mg卵清蛋白OVA溶解于3ml HEPES,室温下磁力搅拌混匀，此反应液为E液；
将D液逐滴加入到E液中，室温下避光反应24h，后加入150-200 μL丙二酸二乙酯溶液(84.6mg溶解于2 00μL乙醇中)，室温下避光反应1h；
反应液先用8KD的透析袋透析3次，再用30KD的超滤离心管 8000rpm离心5次，用5ml的0.01M，pH7.4的HEPES溶液复溶，后分装，-20℃低温保存。
经SDS-PAGE实验和紫外扫描显示偶联成功，通过重金属含量测定和偶联物蛋白浓度测定计算结合比为9:1。
对比例9
称取7mg EDTA，溶解于2ml 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES) 溶液(0.01M，pH7.4)，制备成EDTA螯合剂溶液，此反应液为A液；
称取124.2mg硝酸铅溶解于5ml超纯水中，制备成7.5×10-2M 的硝酸铅溶液，此反应液为B液；
吸取180μl的B液逐滴加入到A液中，室温下避光反应3h，此反应液为C液；
向C液中逐滴加入690μl，20mM的戊二醛溶液，室温避光反应过夜，此反应液为D液；
称取20mg卵清蛋白OVA溶解于3ml HEPES,室温下磁力搅拌混匀，此反应液为E液；
将D液逐滴加入到E液中，室温下避光反应24h，后加入150-200 μL丙二酸二乙酯溶液(84.6mg溶解于2 00μL乙醇中)，室温下避光反应1h；
反应液先用8KD的透析袋透析3次，再用30KD的超滤离心管 8000rpm离心5次，用5ml的0.01M，pH7.4的HEPES溶液复溶，后分装，-20℃低温保存。
经SDS-PAGE实验和紫外扫描显示偶联成功，通过重金属含量测定和偶联物蛋白浓度测定计算结合比为10:1。
对比例10
称取7mg NOTA，溶解于2ml 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES) 溶液(0.01M，pH7.4)，制备成DOTA螯合剂溶液，此反应液为A液；
称取124.2mg硝酸铅溶解于5ml超纯水中，制备成7.5×10-2M 的硝酸铅溶液，此反应液为B液；
吸取180μl的B液逐滴加入到A液中，室温下避光反应5h，此反应液为C液；
向C液中逐滴加入700μl，20mM的戊二醛溶液，室温避光反应过夜，此反应液为D液；
称取20mg鸡卵清蛋白OVA溶解于4ml HEPES，室温下磁力搅拌混匀，此反应液为E液；
将D液逐滴加入到E液中，室温下避光反应24h，后加入150-200 μL硼氢化钠溶液(20mg溶解于2 00μL纯水中)，室温下避光反应 1h；
反应液先用8KD的透析袋透析3次，再用30KD的超滤离心管 8000rpm离心5次，用5ml的0.01M，pH7.4的HEPES溶液复溶，后分装，-20℃低温保存。
经SDS-PAGE显示偶联物电泳条带比单一的蛋白条带有滞后拖尾现象，偶联物的分子量比单一蛋白分子量要大，说明偶联成功，另外紫外扫描显示最大吸收波长有变化，进一步说明偶联成功。通过重金属含量测定和偶联物蛋白浓度测定计算结合比为18:1。
对比例11
称取7mg DOTA，溶解于2ml 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES) 溶液(0.01M，pH7.4)，制备成DOTA螯合剂溶液，此反应液为A液；
称取124.2mg硝酸铅溶解于5ml超纯水中，制备成7.5×10-2M 的硝酸铅溶液，此反应液为B液；
吸取180μl的B液逐滴加入到A液中，室温下避光反应3h，此反应液为C液；
向C液中逐滴加入700μl，20mM的戊二醛溶液，室温避光反应过夜，此反应液为D液；
称取20mg卵清蛋白OVA溶解于3ml HEPES,室温下磁力搅拌混匀，此反应液为E液；
将D液逐滴加入到E液中，室温下避光反应24h，后加入150-200 μL丙二酸二乙酯溶液(84.6mg溶解于2 00μL乙醇中)，室温下避光反应1h；
反应液先用8KD的透析袋透析3次，再用30KD的超滤离心管8000rpm离心5次，用5ml的0.01M，pH7.4的HEPES溶液复溶，后分装，-20℃低温保存。
经SDS-PAGE显示偶联物电泳条带比单一的蛋白条带有滞后拖尾现象，偶联物的分子量比单一蛋白分子量要大，说明偶联成功，另外紫外扫描显示最大吸收波长有变化，进一步说明偶联成功。通过测定重金属含量和偶联物蛋白浓度计算结合比为13:1，偶联效率高。结合比越高，说明一个蛋白分子上偶联重金属离子的数量越多，偶联效率也越高，结合比为13：1，则表示一个蛋白分子上结合13个重金属离子。
对比例12
称取7mg NOTA，溶解于2ml 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES) 溶液(0.01M，pH7.4)，制备成NOTA螯合剂溶液，此反应液为A液；
称取111.56mg硝酸锌溶解于5ml超纯水中，制备成7.5×10-2M 的硝酸锌溶液，此反应液为B液；
吸取180μl的B液逐滴加入到A液中，室温下避光反应3h，此反应液为C液；
向C液中逐滴加入700μl，20mM的戊二醛溶液，室温避光反应过夜，此反应液为D液；
称取20mg卵清蛋白OVA溶解于3ml HEPES,室温下磁力搅拌混匀，此反应液为E液；
将D液逐滴加入到E液中，室温下避光反应24h，后加入150-200 μL丙二酸二乙酯溶液(84.6mg溶解于2 00μL乙醇中)，室温下避光反应1h；
反应液先用8KD的透析袋透析3次，再用30KD的超滤离心管 8000rpm离心5次，用5ml的0.01M，pH7.4的HEPES溶液复溶，后分装，-20℃低温保存。
经SDS-PAGE显示偶联物电泳条带比单一的蛋白条带有滞后拖尾现象，偶联物的分子量比单一蛋白分子量要大，说明偶联成功，另外紫外扫描显示最大吸收波长有变化，进一步说明偶联成功。通过测定重金属含量和偶联物蛋白浓度计算结合比为12:1，偶联效率高。结合比越高，说明一个蛋白分子上偶联重金属离子的数量越多，偶联效率也越高，结合比为12：1，则表示一个蛋白分子上结合12个重金属离子。
实施例3
将实施例1、对比例1、2、3、4、5和6制备的抗原分别对BALB/C 小鼠进行免疫，初次免疫采用完全佐剂乳化抗原，计量为250μg/小鼠(以蛋白为计量单位)，后每间隔21天加强免疫，共加强免疫3次，加强免疫采用不完全佐剂进行乳化，免疫计量为150μg/小鼠，最后进行末免，末免采用抗原直接腹腔注射的方式进行，免疫计量为300 μg/小鼠，后采血进多抗血清的效价测定，检测抗原分别为实施例2、对比例、7、8、9、10、11和12，结果如下：
以上数据表明，实施例1的结合比与抗血清效价均较高，由于对比例1中缺少与丙二酸二乙酯的反应步骤，其结合比与抗血清效价显著降低，这说明丙二酸二乙酯不仅可以提高偶联效率，还可以显著提高抗血清效价。虽然对比例2、3和5也采用了丙二酸二乙酯进行了处理，但是对比例2、3和5的结合比与抗血清效价低于实施例1，这说明OVA、BSA与螯合剂NOTA和铅离子生成的螯合物较稳定，并且能更好的把重金属抗原决定簇展现出来，抗原免疫特性更佳，制备的抗体特异性强，螯合剂NOTA优于DOTA、DTPA与EDTA。对比例4采用了硼氢化钠进行了处理，结合比与抗血清效价高于对比例1、2和3，但是低于实施例1，这说明硼氢化钠可以提高偶联效率并能提高抗血清效价，但是效果次于丙二酸二乙酯。这说明重金属铅与螯合剂NOTA与丙二酸二乙酯的结合较为稳定且抗血清效价较高。实施例1与对比例6相比说明了对于不同金属，金属性质不同，它们与相同螯合剂的结合比不同，抗血清效价不同。
根据实施例1和实施例2的对比，不同的金属采用不同的血清类蛋白进行处理，效果也有所不同，对于金属铅来说，在螯合剂为NOTA、还原剂为丙二酸二乙酯的条件下，采用牛血清类蛋白BSA能获得最佳处理效果。
Claims (1)
1.一种重金属铅人工抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
称取7mg 2-S-(4-氨基苯)-1，4，7三氮杂环壬烷-1，4，7-三乙酸(NOTA)，溶解于2mL0.01M、pH7.4 4-羟乙基哌嗪乙磺酸HEPES溶液，制得NOTA螯合剂溶液，此溶液为A液；
称取124.2mg硝酸铅溶解于5mL超纯水中，制得浓度为7.5×10-2M的硝酸铅溶液，此溶液为B液；
将180μL的B液加入到A液中，室温下避光反应3h，此反应液为C液；
向C液中逐滴加入700μL，20mM的戊二醛溶液，室温避光反应过夜，此反应液为D液；
称取20mg牛血清白蛋白BSA或鸡卵清蛋白OVA溶解于4mL HEPES，室温下磁力搅拌混匀，此反应液为E液；
将D液逐滴加入到E液中，室温下避光反应24h，后加入150-200μL丙二酸二乙酯溶液，室温下避光反应1h；所述丙二酸二乙酯溶液为84.6mg丙二酸二乙酯溶解于200μL乙醇中；
反应液先用8KD的透析袋透析3次，再用30KD的超滤离心管8000rpm离心5次，用5mL的0.01M，pH7.4的HEPES溶液复溶，后分装，-20℃低温保存，制得重金属铅人工抗原。
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