CN101041696A - 抗重金属铅单克隆抗体的制备方法 - Google Patents

抗重金属铅单克隆抗体的制备方法 Download PDF

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CN101041696A CN 200710020471 CN200710020471A CN101041696A CN 101041696 A CN101041696 A CN 101041696A CN 200710020471 CN200710020471 CN 200710020471 CN 200710020471 A CN200710020471 A CN 200710020471A CN 101041696 A CN101041696 A CN 101041696A
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刘凤权
朱晓霞
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Abstract

本发明是重金属铅单克隆抗体的制备方法，属于生物技术领域。专用于特异性识别重金属铅的单克隆抗体的制备。重金属铅离子与载体蛋白通过双功能金属螯合剂对氨基苯基－二乙三胺五乙酸偶联获得完全抗原，经免疫Balb/C鼠，脾细胞和Sp2/0骨髓瘤细胞通过杂交瘤技术制备杂交瘤细胞，经筛选获得了稳定的分泌特异性强的抗铅单克隆抗体，该抗体只针对Pb－DTPA有抑制，而不与DTPA起反应。本发明抗原实用性强，抗原和抗体稳定性好。抗原制备技术简便可行：抗原的整个制备过程无需要特别的仪器设备，容易工厂化规模生产。

Description

抗重金属铅单克隆抗体的制备方法
(一)技术领域
本发明是抗重金属铅单克隆抗体的制备，属于生物技术领域。专用于特异性识别重金属铅单克隆抗体的制备，及其在农产品和农业生产环境中重金属残留的高灵敏快速检测，特别适用于大批量样品检测和现场监测。
(二)背景技术
铅是环境污染物中毒性很大的一种重金属，在自然界中分布广，工业用途多。随着我国工业及交通运输业的迅速发展，环境铅污染日趋严重。由于铅是多亲和性毒物，易在人体的某些器官中积蓄起来造成慢性中毒危害人体健康，主要损害神经系统、血液系统、心血管及消化系统，对儿童的作用更为敏感。一些行业通过颁布行业标准规定了铅的最大允许量，如粮食中的铅现行标准是0.4mg/kg，蔬菜是0.2mg/kg，用于农业的污泥，每Kg干燥污泥的铅最高允许量为20mg。
传统的重金属检测方法多采用化学仪器检测，如利用原子吸收光谱法、电感耦合等离子体原子发射光谱法、离子色谱仪、X射线荧光光谱法、气相色谱-质谱联用法等，检测仪器昂贵，这些检测方法虽然能够精确测量样品中单种金属的总量，但检测相对费时、费力、费用昂贵，需要进行大量的样品预处理，且样品的检测需在大型分析设备的室内进行，不适应实践中快速简便灵敏的需要。
重金属的免疫检测方法具有快速、廉价、简便、灵敏、特异的优点，可便携而进行现场监测。克服了传统检测方法的缺点。通过化学合成高选择性重金属离子捕获螯合剂，制备重金属离子螯合物，与载体蛋白偶联获得完全抗原，制备针对环境和农产品中重金属离子螯合物特异性的单克隆抗体。建立重金属离子螯合物免疫学检测方法，该方法的完成，将解决重金属螯合、偶联、单克隆抗体制备等关键技术，建立重金属离子螯合物的免疫学快速检测技术。该专利不仅为食品安全检测，而且为我国农产品等的出入境检测、环境监测部门的水域监测提供有效的技术手段和检测方法。重金属残留的免疫学快速检测试剂盒的开发将会实现很好的经济效益。对我国农产品的可持续健康发展、解决食品安全问题具有重要的现实意义和重要的社会、经济价值。
(三)发明内容
技术问题  本发明的目的是提供铅单克隆抗体的制备方法，通过合成铅抗原，免疫BalB/C鼠，利用杂交瘤技术制备特异性强的铅单克隆抗体，并用于农产品和农业生产环境中重金属残留的高灵敏快速检测。
技术方案
1、铅单克隆抗体的制备方法，包括：
1)抗原制备：
称取血蓝蛋白15mg溶于2ml 10mM，pH7.4 N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸缓冲液中形成7.5mg/ml血蓝蛋白溶液；
称取双功能金属螯合剂对氨基苯基-二乙三胺五乙酸8mg溶于0.8ml超纯水形成金属螯合剂溶液；
将0.8ml金属螯合剂对氨基苯基-二乙三胺五乙酸溶液搅拌下逐滴滴加到2ml 7.5mg/ml血蓝蛋白溶液中后，再逐滴加入0.2ml 20mM戊二醛，室温下反应24hr；
反应产物用30Kd的超滤管纯化，超滤管预先用100mM乙二胺四乙酸浸泡，用超纯水充分冲洗后，超滤管内加入反应产物超滤，超滤管内用10mM，pH7.4N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸缓冲液5次除去其中未反应的小分子金属螯合剂，所得产物即为纯化的血蓝蛋白-对氨基苯基-二乙三胺五乙酸；
30mg牛血清白蛋白溶于6ml 10mM，pH7.4 N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸缓冲液中，称取18mg对氨基苯基-二乙三胺五乙酸溶于1.8ml超纯水中，
取6ml浓度为5mg/ml的牛血清白蛋白搅拌下逐滴滴加到1.8ml的对氨基苯基-二乙三胺五乙酸溶液中，同时加入5ml浓度为20mM的戊二醛溶液，室温下搅拌24hr；
反应产物用上述30Kd超滤管方法进行纯化除去其中未反应的小分子金属螯合剂，所得产物即为纯化的牛血清白蛋白-对氨基苯基-二乙三胺五乙酸溶液，将牛血清白蛋白-对氨基苯基-二乙三胺五乙酸溶液等分成两份，一份直接用作包被抗原，一份用于下面的反应；
称取43.8mg纯度为99.999％的铅颗粒溶于1ml 6M硝酸中，形成212.6mM硝酸铅溶液；
取99μl硝酸铅溶液搅拌下分别逐滴滴加到纯化过的血蓝蛋白-对氨基苯基-二乙三胺五乙酸和牛血清白蛋白-对氨基苯基-二乙三胺五乙酸溶液中，用0.5M盐酸调节pH至7.0，室温下反应3小时；
反应产物用上述30Kd的超滤管方法进行纯化去除未反应的金属离子，纯化后的产物分别为血蓝蛋白-对氨基苯基-二乙三胺五乙酸-Pb和牛血清白蛋白-对氨基苯基-二乙三胺五乙酸-Pb，以所含蛋白量计算获得的铅人工抗原的量，以血蓝蛋白-对氨基苯基-二乙三胺五乙酸-Pb作免疫原，以牛血清白蛋白-对氨基苯基-二乙三胺五乙酸-Pb作为包被抗原；
2)小鼠免疫：
将制备好的血蓝蛋白-对氨基苯基-二乙三胺五乙酸-Pb作为免疫原免疫6-8周龄雌性健康BalB/c鼠，每次每只小鼠的免疫原用量均为200μg，共免疫五次，前两次免疫间隔3周采用等体积的抗原和佛氏完全佐剂乳化，腹腔注射，以后三次免疫间隔2周用等体积的佛氏不完全佐剂和免疫原乳化；
从第四次开始，每次免疫后一周鼠尾静脉采血通过间接非竞争ELISA检测抗体的特异性，分别用相同浓度的牛血清白蛋白-对氨基苯基-二乙三胺五乙酸和牛血清白蛋白-对氨基苯基-二乙三胺五乙酸-Pb 50μl/孔包被96孔酶联微量分析板，4℃过夜或37℃放置2小时；用含0.5％土温20的磷酸盐缓冲液洗涤5次；含0.5％土温20的磷酸盐缓冲液稀释明胶至1％，100μl/孔，37℃放置1.5小时；含0.5％土温20的磷酸盐缓冲液洗涤5次；加入相同数量的血清37℃1小时；含0.5％土温20的磷酸盐缓冲液洗涤6次；磷酸盐缓冲液1000倍稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体，50μl/孔，37℃1小时；含0.5％土温20的磷酸盐缓冲液洗涤6次；50μl/孔四甲基联苯胺显色，37℃10分钟；加入25μl/孔的2M硫酸终止反应，酶联仪测450nm处吸光值，并计算差异％，差异％＝{牛血清白蛋白-对氨基苯基-二乙三胺五乙酸-Pb的吸光值-牛血清白蛋白-对氨基苯基-二乙三胺五乙酸的吸光值}/牛血清白蛋白-对氨基苯基-二乙三胺五乙酸的吸光值×100％；
3)细胞融合
通过差异率筛选BalB/c鼠，差异率超过50％的BalB/c鼠用N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸缓冲液稀释血蓝蛋白-对氨基苯基-二乙三胺五乙酸-Pb直接免疫，三天后取脾脏，脾细胞和对数生长期的Sp2/0骨髓瘤细胞用ClonaCellTM-HY试剂盒制备杂交瘤细胞，具体操作参见试剂盒说明，37℃，5％二氧化碳培养箱培养10-14天后，通过检测融合孔上清筛选杂交瘤细胞；
4)杂交瘤筛选：
融合孔上清用上述筛选小鼠的间接非竞争ELISA法进行初步筛选，用相同浓度的牛血清白蛋白-对氨基苯基-二乙三胺五乙酸和牛血清白蛋白-对氨基苯基-二乙三胺五乙酸-Pb 50μl/孔包被96孔酶联微量分析板上，4℃放置过夜；用含0.5％土温20的磷酸盐缓冲液洗涤5次；含0.5％土温20的磷酸盐缓冲液稀释明胶至1％，100μl/孔，37℃放置1.5小时；含0.5％土温20的磷酸盐缓冲液洗涤5次；加入相同数量的融合孔上清50μl/孔，以空白孔调零，用SP2/0的上清作阴性对照，37℃1小时，含0.5％土温20的磷酸盐缓冲液洗涤6次；加入磷酸盐缓冲液1000倍稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体，50μl/孔，37℃1小时；含0.5％土温20的磷酸盐缓冲液洗涤6次；四甲基联苯胺显色，50μl/孔，37℃10分钟；加25μl/孔的2M硫酸终止反应，酶联仪测450nm处吸光值，用牛血清白蛋白-对氨基苯基-二乙三胺五乙酸-Pb包被的成阳性而用牛血清白蛋白-对氨基苯基-二乙三胺五乙酸包被的孔的读数接近SP2/0读数的融合孔即为阳性孔；
由于铅离子是小分子不具有免疫原性，单独的金属离子也足以形成抗原表位，作必须借助螯合剂二乙三胺五乙酸形成半抗原与抗体反应，为了进一步确定得到阳性孔所分泌抗体是针对金属铅而不与二乙三胺五乙酸反应，通过竞争ELISA进一步确定抗体的特异性，用牛血清白蛋白-对氨基苯基-二乙三胺五乙酸-Pb 50μl/孔包被酶标板，4℃放置过夜，0.5％土温20的磷酸盐缓冲液洗涤5次；0.5％土温20的磷酸盐缓冲液稀释明胶至1％，100μl/孔，37℃1.5小时；0.5％土温20的磷酸盐缓冲液洗涤5次；各种浓度1，2，5，10，20，50mM二乙三胺五乙酸溶液与等体积的融合孔上清充分混匀室温反应45分钟，50μl/孔加入到酶联板上，37℃1小时；0.5％土温20的磷酸盐缓冲液洗涤6次；磷酸盐缓冲液溶液1000倍稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体，50μl/孔，37℃1小时；0.5％土温20的磷酸盐缓冲液洗涤6次；四甲基联苯胺50μl/孔，37℃显色10分钟，加入25μl/孔的2M硫酸终止反应，酶联仪上450nm处读数，用不加乙二胺四乙酸的孔作阳性对照吸光值A0，加乙二胺四乙酸孔的吸光值A，  若A＝A0，则A对应的加乙二胺四乙酸的浓度则为乙二胺四乙酸的最佳浓度，且所选乙二胺四乙酸浓度必须大于金属离子的最大浓度。
有益效果  本发明与现有方法相比，其优点和积极效果表现在：
(1)抗原实用性强：铅抗原合成与抗体制备技术具有重要的使用价值和实际意义。上述方法利用双功能金属螯合剂，有效地合成铅抗原，免疫Balb/C鼠，通过杂交瘤技术制备特异性识别重金属铅的单克隆抗体，为重金属铅免疫速测试剂盒的研制解决了一个技术难点，为重金属铅高效快速简便的残留分析开山辟路，必将迅速推动我国铅免疫速测试剂盒的开发。
(2)抗原和抗体稳定性好：此法合成的铅抗原具有较好的稳定性，-20℃冰箱至少可以存放4年不影响其免疫原性。液氮保存的杂交瘤细胞至少可以保持3年，抗体的稳定性也比较好，纯化的抗体-20℃冰箱可存放2年。
(3)抗原制备技术简便可行：抗原的整个制备过程无需要特殊的仪器设备，容易工厂化规模生产。
具体实施方式
实施例1铅标准溶液的检测
采用间接竞争ELISA方法，对检测曲线进行初步探索。方法如下：
包被：用10mM、pH7.4 N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸缓冲液稀释包被抗原牛血清白蛋白-对氨基苯基-二乙三胺五乙酸-Pb，50μl/孔加到96孔酶联微量分析板(Corning Co.)上，4℃放置过夜或37℃放置2h；
洗涤：PBST洗涤5次；
封闭：PBST稀释明胶至1％，100μl/孔，37℃1.5小时；
洗涤：PBST洗涤5次；
加样：用含2mM二乙三胺五乙酸(Sigma Co.)的N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸缓冲液将铅标准溶液(Sigma Co.)逐级稀释成2，0.2，0.02，0.002，0.0002，0.00002，0.000002mM，稀释好的铅溶液室温放置30min，再与稀释到一定倍数的融合孔上清等体积混匀室温反应45分钟后，50μl/孔加入到酶联板上，37℃1小时；
洗涤：PBST洗涤6次；
加酶标二抗：PBS溶液1000倍稀释HRP-羊抗鼠抗体(华美公司)，50μl/孔，37℃1小时；
洗涤：PBST洗涤6次
显色：新鲜配置的四甲基联苯胺50μl/孔，37℃显色10分钟
终止反应：加2M的硫酸，25μl/孔
酶联仪(Thermo Co.)上450nm处读数，空白基质作阳性对照吸光值Bo，待测样品吸光值B并计算抑制率，通过数据处理计算Logit(B/Bo)＝Ln[(B/Bo)/(1-B/Bo)]，抗体的IC50＝2.67±0.034mM，结果表明，制备的抗体对铅具有很好的识别作用，可用于研制铅免疫速测试剂盒。
实施例2自来水样品中检测铅残留量
牛血清白蛋白-对氨基苯基-二乙三胺五乙酸-Pb稀释成0.5μg/ml包被微量分析板，阳性孔上清稀释10倍作为工作浓度，1％明胶作封闭物，抗原抗体反应基质(HBS)含1mM DTPA pH值为5.0、离子强度为0mol/L，微量分析板中每孔50μl；
待测样品准备：
自来水样品：量取三份自来水(实验室)400μl，分别加入1000μg/ml铅标准溶液0.801μl至三份水样中，配制成0.04mM的液体样品；
采用铅ELISA检测方法对以上样品进行检测，操作如下：
1)包被：
牛血清白蛋白-对氨基苯基-二乙三胺五乙酸-Pb 0.95μg/ml在微量分析板中每孔加50μl，4℃冰箱过夜或37℃放置2小时，PBST洗涤5次并倒置、在吸水纸上拍干；
2)封闭：
1％明胶作封闭物，微量分析板每孔100μl，37℃反应1.5小时，倒净，PBST洗涤5次并倒置、在吸水纸上拍干；
3)加抗体及抗体与待测样品的混合液：
液体样品与反应基质等体积混匀成待测液，稀释10倍的铅抗体上清与待测液等体积充分混合，以每孔50μl加到微量分析板中，37℃反应1小时，倒净，PBST洗涤6次并倒置、在吸水纸上拍干；
4)加酶标二抗：
用pH7.4、0.15mol/L的PBS缓冲液液将商品化的HRP-羊抗鼠抗体稀释1000倍，50μl/孔，37℃反应1小时，倒净，PBST洗涤8次并倒置、在吸水纸上拍干；
5)显色：
四甲基联苯胺50μl/孔，37℃显色10分钟；
6)终止反应并读数
加2M的硫酸，25μl/孔终止反应，酶联仪上450nm处读出吸光值，空白基质作阳性对照，Bo＝0.932，待测样品吸光值B＝0.463。
7)数据处理
计算出结合率B/Bo＝49.7％，代入公式1
Logit(B/Bo)＝Ln[(B/Bo)/(1-B/Bo)]    公式1
得到Logit(B/Bo)＝0.012
代入如下检测方程：
Logit(B/Bo)＝-1.0434LogC-2.6768     公式2
其中C为微量分析板孔中测得的速灭威浓度，求得C＝0.00263mM。待测样品中铅残留量为0.00263mM。

Claims (1)

1、铅单克隆抗体的制备方法，包括：
1)抗原制备：
称取血蓝蛋白15mg溶于2ml 10mM，pH 7.4 N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸缓冲液中形成7.5mg/ml血蓝蛋白溶液；
称取双功能金属螯合剂对氨基苯基-二乙三胺五乙酸8mg溶于0.8ml超纯水形成金属螯合剂溶液；
将0.8ml金属螯合剂溶液搅拌下逐滴滴加到2ml 7.5mg/ml血蓝蛋白溶液中，随后滴加0.2ml 20mM戊二醛室温下搅拌24hr；
反应产物用30Kd的超滤管纯化，超滤管预先用100mM乙二胺四乙酸浸泡，用超纯水充分冲洗后，超滤管内加入反应产物超滤，超滤管内用10mM，pH 7.4N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸缓冲液5次除去其中未反应的小分子金属螯合剂，所得产物即为纯化的血蓝蛋白-对氨基苯基-二乙三胺五乙酸；
30mg牛血清白蛋白溶于6ml pH为7.4、10mM的N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸缓冲液，称取18mg对氨基苯-二乙三胺五乙酸溶于1.8ml超纯水中，
取6ml含量为5mg/ml的牛血清白蛋白逐滴滴加到1.8ml的对氨基苯-二乙三胺五乙酸溶液中，同时加入5ml浓度为20mM的戊二醛溶液，室温下搅拌24hr；
反应产物用上述30Kd的超滤管方法进行纯化除去其中未反应的小分子金属螯合剂，所得产物即为纯化的牛血清白蛋白-对氨基苯基-二乙三胺五乙酸溶液，将牛血清白蛋白-对氨基苯基-二乙三胺五乙酸溶液等分成两份，一份直接用作包被抗原，一份用于下面的反应；
称取43.8mg含量为99.999％的铅颗粒溶于1ml优级6M硝酸中，形成212.6mM硝酸铅溶液；
取99μl硝酸铅溶液搅拌下分别逐滴滴加到纯化过的血蓝蛋白-对氨基苯基-二乙三胺五乙酸和牛血清白蛋白-对氨基苯基-二乙三胺五乙酸中，用0.5M盐酸调节pH至7.0，室温下反应3小时；
反应产物用上述30Kd的超滤管方法进行纯化去除未反应的金属离子，纯化后的产物分别为血蓝蛋白-对氨基苯基-二乙三胺五乙酸-Pb和牛血清白蛋白-对氨基苯基-二乙三胺五乙酸-Pb以所含蛋白进行计量为15mg铅的人工抗原含量的溶液，以血蓝蛋白-对氨基苯基-二乙三胺五乙酸-Pb作免疫原，以牛血清白蛋白-对氨基苯基-二乙三胺五乙酸-Pb作为包被抗原；
2)小鼠免疫：
将制备好的血蓝蛋白-对氨基苯基-二乙三胺五乙酸-Pb作为免疫原免疫6-8周龄雌性BalB/c鼠，每次每只小鼠的免疫原用量200μg，共免疫五次，前两次免疫间隔3周采用由等体积的抗原和佛氏完全佐剂乳化，腹腔注射，以后三次免疫间隔2周用等体积的佛氏不完全佐剂和免疫原乳化；
从第四次开始，每次免疫后一周，鼠尾静脉采血用间接非竞争ELISA检测抗体的特异性，分别用相同浓度的牛血清白蛋白-对氨基苯基-二乙三胺五乙酸和牛血清白蛋白-对氨基苯基-二乙三胺五乙酸-Pb 50μl/孔包被96孔酶联微量分析板，4℃过夜或37℃放置2小时；用含0.5％土温20的磷酸盐缓冲液洗涤5次；含0.5％土温20的磷酸盐缓冲液稀释明胶至1％，100μl/孔，37℃放置1.5小时；含0.5％土温20的磷酸盐缓冲液洗涤5次；加入相同数量的血清37℃1小时；含0.5％土温20的磷酸盐缓冲液洗涤6次；磷酸盐缓冲液溶液1000倍稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体，50μl/孔，37℃1小时；含0.5％土温20的磷酸盐缓冲液洗涤6次；四甲基联苯胺50μl/孔，37℃显色10分钟；加25μl/孔的2M硫酸终止反应，酶联仪上测450nm处吸光值，并计算差异％，差异％＝{牛血清白蛋白-对氨基苯基-二乙三胺五乙酸-Pb的吸光值-牛血清白蛋白-对氨基苯基-二乙三胺五乙酸的吸光值}/牛血清白蛋白-对氨基苯基-二乙三胺五乙酸的吸光值×100％；
3)细胞融合
通过差异率筛选BalB/c鼠，差异率超过50％的BalB/c鼠用N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸缓冲液稀释血蓝蛋白-对氨基苯基-二乙三胺五乙酸-Pb直接免疫，三天后取脾脏，脾细胞和对数生长期的Sp2/0骨髓瘤细胞通过杂交瘤技术制备杂交瘤细胞，37℃，5％二氧化碳培养箱培养10-14天后，通过检测融合孔上清筛选杂交瘤细胞；
4)杂交瘤筛选：
融合孔上清用上述筛选小鼠的间接非竞争ELISA法进行初步筛选，用相同浓度的牛血清白蛋白-对氨基苯基-二乙三胺五乙酸和牛血清白蛋白-对氨基苯基-二乙三胺五乙酸-Pb 50μl/孔包被96孔酶联微量分析板上，4℃放置过夜；用含0.5％土温20的磷酸盐缓冲液洗涤5次；含0.5％土温20的磷酸盐缓冲液稀释明胶至1％，100μl/孔，37℃放置1.5小时；含0.5％土温20的磷酸盐缓冲液洗涤5次；加入相同数量的融合孔上清50μl/孔，以空白孔调零，用SP2/0的上清作阴性对照，37℃1小时，含0.5％土温20的磷酸盐缓冲液洗涤6次；加入磷酸盐缓冲液1000倍稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体，50μl/孔，37℃1小时；含0.5％土温20的磷酸盐缓冲液洗涤6次；四甲基联苯胺50μl/孔，37℃显色10分钟；加25μl/孔的2M硫酸终止反应，酶联仪测450nm处吸光值，用血清白蛋白-对氨基苯基-二乙三胺五乙酸-Pb包被的成阳性而用牛血清白蛋白-对氨基苯基-二乙三胺五乙酸包被的孔的接近SP2/0的融合孔即为阳性孔；由于铅离子是小分子不具有免疫原性，单独的金属离子也足以形成抗原表位，作必须借助螯合剂二乙三胺五乙酸形成半抗原与抗体反应，为了进一步确定得到阳性孔所分泌抗体是针对金属铅而不与二乙三胺五乙酸反应，通过竞争ELISA进一步确定抗体的特异性，用牛血清白蛋白-对氨基苯基-二乙三胺五乙酸-Pb 50μl/孔包被酶标板，4℃放置过夜，0.5％土温20的磷酸盐缓冲液洗涤5次；0.5％土温20的磷酸盐缓冲液稀释明胶至1％，100μl/孔，37℃1.5小时；0.5％土温20的磷酸盐缓冲液洗涤5次；各种浓度1，2，5，10，20，50mM二乙三胺五乙酸溶液与等体积的融合孔上清充分混匀室温反应45分钟，50μl/孔加入到酶联板上，37℃1小时；0.5％土温20的磷酸盐缓冲液洗涤6次；磷酸盐缓冲液溶液1000倍稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体，50μl/孔，37℃1小时；0.5％土温20的磷酸盐缓冲液洗涤6次；四甲基联苯胺50μl/孔，37℃显色10分钟，加入25μl/孔的2M硫酸终止反应，酶联仪上450nm处读数，用不加乙二胺四乙酸的孔作阳性对照吸光值A0，加乙二胺四乙酸孔的吸光值A，若A＝A0，则A对应的加乙二胺四乙酸的浓度则为乙二胺四乙酸的最佳浓度，且所选乙二胺四乙酸浓度必须大于金属离子的最大浓度。
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