CN101560257B - 重金属铜单克隆抗体及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明重金属铜单克隆抗体的制备方法，属于生物技术领域。专用于特异性识别重金属铜单克隆抗体的制备，及其在农产品和农业生产环境中铜残留的高灵敏快速检测。重金属铜离子与载体蛋白通过双功能金属螯合剂1-(4-异硫氰基苯基)-乙二胺四乙酸偶联形成完全抗原，用该完全抗原免疫Balb/C鼠，脾细胞和Sp2/0骨髓瘤细胞通过杂交瘤技术制备杂交瘤细胞，获得了稳定分泌抗Cu-EDTA的单克隆抗体。本发明抗体的制备技术简便可行：抗原的整个制备过程无需要特别的仪器设备，容易工厂化规模生产。

Description

重金属铜单克隆抗体及其制备方法

(一)技术领域

本发明涉及重金属铜单克隆抗体及其制备方法，属于生物技术领域。专用于特异性识别重金属铜的单克隆抗体制备，以及农产品和农业生产环境中重金属残留的高灵敏快速检测，特别适用于大批量样品检测和现场监测。

(二)背景技术

重金属铜是自然界存在的一种重要的金属元素。由于具有多种优良特性，铜及其化合物在工农业生产中应用十分广泛。然而，铜是一种对人体和高等生物具有很强毒性的金属污染物。早在20世纪80年代台湾的“绿牡蛎”事件爆发之后，铜的污染问题就引起了人们的关注。近年来，随着城市化进程的不断加快和工业化水平的迅速提升，由于生产、生活所致的铜及其化合物污染日趋严重并再度成为全球热点问题之一。

铜是人体所必须的微量元素，缺铜会发生贫血、腹泻等病症，但过量摄入铜也会产生危害。金属铜毒性较小，易溶性铜化合物对水生生物的危害较大。铜的主要污染源是电镀、冶炼、五金加工、矿山开采、石油化工和化学工业等部门排放的废水。含铜废水灌溉农田，铜在土壤中和农作物中累积，会造成农作物，特别是水稻和大麦生长不良，污染粮食籽粒，造成农产品中重金属污染超标，严重影响我国农产品质量和国际竞争力，而且还严重危害人类的身体健康。铜粉尘会刺激鼻子、嘴巴以及眼睛，造成头痛、头痛、头昏、恶心及腹泻，严重者会造成肝、肾的损害甚至死亡。因此，有关铜的排放、迁移、沉降以及控制研究已成为环境污染防治的新兴领域之一。根据世界卫生组织的建议，我国卫生标准规定粮食含铜不超过10mg/kg，为了规范蔬菜的生产、加工和销售，控制重金属等有害物质在蔬菜中的残留量，中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布无公害蔬菜的重金属最大允许残留量铜≤10mg/kg。

传统的重金属检测方法多采用化学仪器检测，如利用原子吸收光谱法、电感耦合等离子体原子发射光谱法、离子色谱仪、X射线荧光光谱法、气相色谱-质谱联用法等，检测仪器昂贵，这些检测方法虽然能够精确测量样品中单种金属的总量，但检测相对费时、费力、费用昂贵，需要进行大量的样品预处理，且样品的检测需在大型分析设备的室内进行，不适应实践中快速简便灵敏的需要。

重金属的免疫检测方法具有快速、廉价、简便、灵敏、特异的优点，可便携而进行现场监测。 克服了传统检测方法的缺点。通过化学合成高选择性重金属离子捕获螯合剂，制备重金属离子螯合物，与载体蛋白偶联获得完全抗原，制备针对环境和农产品中重金属离子螯合物特异性的单克隆抗体。建立重金属离子螯合物免疫学检测方法，该方法的完成，将解决重金属螯合、偶联、单克隆抗体制备等关键技术，建立重金属离子螯合物的免疫学快速检测技术。该专利不仅为食品安全检测，而且为我国农产品等的出入境检测、环境监测部门的水域监测提供有效的技术手段和检测方法。重金属残留的免疫学快速检测试剂盒的开发将会实现很好的经济效益。对我国农产品的可持续健康发展、解决食品安全问题具有重要的现实意义和重要的社会、经济价值。我国在这方面起步较晚，只是在近几年才有单位和研究人员重视并从事重金属免疫速测技术研究，目前国内尚未见该类方法的研究报道。

(三)发明内容

技术问题本发明的目的是提供重金属铜单克隆抗体及其制备方法，通过合成铜抗原，免疫BalB/C鼠，通过杂交瘤技术制备特异性强的铜单克隆抗体，并用于农产品和农业生产环境中重金属残留的高灵敏快速检测。

技术方案

1、一种重金属铜单克隆抗体，是由杂交瘤细胞株DF4产生的。

2、上述重金属铜单克隆抗体的制备方法，包括：

1)抗原制备：

分别称取血蓝蛋白和牛血清白蛋白10mg溶于0.5ml浓度为10mM，pH 9.0的N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸缓冲液中形成血蓝蛋白和牛血清白蛋白溶液，

称取10mg金属螯合剂1-(4-异硫氰基苯基)-乙二胺四乙酸溶于1ml二甲基亚砜中形成23nM金属螯合剂溶液；

分别取78.1μl浓度为23nM的金属螯合剂溶液轻轻搅拌下逐滴滴加到0.5ml血蓝蛋白和牛血清白蛋白溶液中，用10M KOH调节pH至9.0，室温下反应24hr；

反应产物用30Kd的超滤管纯化，超滤管预先用100mM乙二胺四乙酸浸泡，用超纯水充分冲洗后，超滤管内加入反应产物超滤，超滤管内先用10mM，pH 9.0的N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸缓冲洗3次，再用10mM，pH 7.4的N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸缓冲液洗2次除去其中未反应的小分子金属螯合剂，所得产物即分别为纯化的血蓝蛋白-1-(4-异硫氰基苯基)-乙二胺四乙酸和牛血清白蛋白-1-(4-异硫氰基苯基)-乙二胺四乙酸溶液，将牛血清白蛋白-1-(4-异硫氰基苯基)-乙二胺四乙酸溶液等分成两份，一份直接用作包被抗原，另一份与金属铜离子螯合；

76.7mg纯度为99.999％的硝酸铜溶于100μl优级浓硝酸，待充分溶解加超纯水使终体积为 1ml，形成409mM铜溶液；

取7.1μl浓度为409mM的铜溶液搅拌下逐滴滴加到纯化过的血蓝蛋白-1-(4-异硫氰基苯基)-乙二胺四乙酸中，取3.5μl浓度为409mM的铜溶液滴加到牛血清白蛋白-1-(4-异硫氰基苯基)-乙二胺四乙酸溶液中，用0.5M盐酸调节pH至7.0，室温下反应3小时，用上述30Kd的超滤管方法进行纯化去除未反应的金属离子，纯化后的产物分别为血蓝蛋白-1-(4-异硫氰基苯基)-乙二胺四乙酸-Cu和牛血清白蛋白-1-(4-异硫氰基苯基)-乙二胺四乙酸-Cu，以所含蛋白进行计量，以血蓝蛋白-1-(4-异硫氰基苯基)-乙二胺四乙酸-Cu作免疫原，浓度为16.67mg/ml，以牛血清白蛋白-1-(4-异硫氰基苯基)-乙二胺四乙酸-Cu作为包被抗原，浓度为4.55mg/ml；

2)小鼠免疫：

将制备好的血蓝蛋白-1-(4-异硫氰基苯基)-乙二胺四乙酸-Cu作为免疫原免疫6-8周龄雌性BalB/c鼠，每次每只小鼠的免疫原用量200μg，共免疫五次，前两次免疫间隔3周，采用由等体积的免疫原和佛氏完全佐剂(Sigma Chemical Co.，下同)乳化，腹腔注射，以后三次免疫间隔2周用等体积的佛氏不完全佐剂(Sigma Chemical Co.，下同)和免疫原乳化；

从第四次开始，每次免疫后一周，鼠尾静脉采血用竞争ELISA法检测抗体的特异性，用pH 7.4的N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸缓冲液稀释牛血清白蛋白-1-(4-异硫氰基苯基)-乙二胺四乙酸-Cu至4.55μg/ml，包被96孔酶联微量分析板(Corning Co.，下同)，4℃放置过夜或37℃2小时；

用含0.5％吐温20的磷酸盐缓冲液洗涤3次；

用含0.5％吐温20的磷酸盐缓冲液稀释明胶至1％(m/v)，100μl/孔，37℃放置1.5小时；

含0.5％吐温20的磷酸盐缓冲液洗涤3次；

用pH 7.4的N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸缓冲液稀释乙二胺四乙酸至10mM；

用等量的10mM乙二胺四乙酸与100μg/ml铜标准溶液(Sigma Co.)室温下反应45min，得到铜-乙二胺四乙酸反应物；

血清分别与等量的10mM乙二胺四乙酸和等量的铜-乙二胺四乙酸反应物室温下反应45min后，50μl/孔加入96孔酶联微量分析板，37℃1小时；

用含0.5％吐温20的磷酸盐缓冲液洗涤3次；

磷酸盐缓冲液溶液1000倍稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体(华美公司，下同)，50μl/孔，37℃1小时；

含0.5％吐温20的磷酸盐缓冲液洗涤5次；

四甲基联苯胺50μl/孔，37℃显色10分钟；

加25μl/孔的2M硫酸终止反应，酶联仪(Thermo Co.，下同)上450nm处读数。以不加乙二胺四乙酸的吸光值为阳性对照，阳性对照吸光值为A₀，加乙二胺四乙酸的孔吸光值为A₁，加乙二胺四乙酸和铜离子的孔吸光值为A₂，若A₀，A₁，A₂的值差不多相等，则说明所制备的抗体不是针对铜离子，若A₀，A₁的值差不多相等，而A₂的值很低，则说明所制备的抗体是针对铜离子，因为其不与乙二胺四乙酸反应，而与铜-乙二胺四乙酸反应物反应，这样的BalB/c鼠的脾脏即可用于细胞融合。

3)细胞融合

选取通过竞争ELISA筛选后，对铜有特异性结合BalB/c鼠用pH 7.4的N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸缓冲液稀释血蓝蛋白-1-(4-异硫氰基苯基)-乙二胺四乙酸-Cu直接免疫，三天后取脾脏，脾细胞和对数生长期的Sp2/0骨髓瘤细胞用ClonaCell^TM-HY试剂盒制备杂交瘤细胞，具体操作参见试剂盒说明，37℃，5％二氧化碳培养箱培养10-14天后，通过检测融合孔上清筛选杂交瘤细胞；

4)杂交瘤筛选：

融合孔上清用间接非竞争ELISA法进行初步筛选，用相同浓度的牛血清白蛋白-1-(4-异硫氰基苯基)-乙二胺四乙酸和牛血清白蛋白-1-(4-异硫氰基苯基)-乙二胺四乙酸-Cu 50μl/孔包被96孔酶联微量分析板上，4℃放置过夜；用含0.5％土温20的磷酸盐缓冲液洗涤5次；含0.5％土温20的磷酸盐缓冲液稀释明胶至1％，100μl/孔，37℃放置1.5小时；含0.5％土温20的磷酸盐缓冲液洗涤5次；加入相同数量的融合孔上清50μl/孔，以空白孔调零，用SP2/0的上清作阴性对照，37℃1小时，含0.5％土温20的磷酸盐缓冲液洗涤6次；加入磷酸盐缓冲液1000倍稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体，50μl/孔，37℃1小时；含0.5％土温20的磷酸盐缓冲液洗涤6次；四甲基联苯胺显色，50μl/孔，37℃10分钟；加25μl/孔的2M硫酸终止反应，酶联仪测450nm处吸光值，用牛血清白蛋白-1-(4-异硫氰基苯基)-乙二胺四乙酸-Cu包被的成阳性而用牛血清白蛋白-1-(4-异硫氰基苯基)-乙二胺四乙酸包被的孔的读数接近SP2/0读数的融合孔即为阴性孔；

由于铜离子是小分子不具有免疫原性，单独的金属离子也足以形成抗原表位，作必须借助螯合剂乙二胺四乙酸形成半抗原与抗体反应，为了进一步确定得到阳性孔所分泌抗体是针对金属铜而不与乙二胺四乙酸反应，通过竞争ELISA进一步确定抗体的特异性，用牛血清白蛋白-1-(4-异硫氰基苯基)-乙二胺四乙酸-Cu 50μl/孔包被酶标板，4℃放置过夜，0.5％土温20的磷酸盐缓冲液洗涤5次；0.5％土温20的磷酸盐缓冲液稀释明胶至1％，100μl/孔，37℃1.5小时；0.5％土温20的磷酸盐缓冲液洗涤5次；各种浓度0.2，0.4，1，2，5，10，20，40，50mM乙二胺四乙酸溶液与等体积的融合孔上清充分混匀室温反应45分钟，50μl/孔加入到酶联板上，37℃1小时；0.5％土温20的磷酸盐缓冲液洗涤6次；磷酸盐缓冲液溶液1000倍稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体，50μl/孔，37℃1小时；0.5％土温20的磷酸盐缓冲液洗涤6次；四甲基联苯胺50μl/孔，37℃显色10分钟，加入25μl/孔的2M硫酸终止反应，酶联仪上450nm处读数，用只加乙二胺四乙酸而不含铜离子的孔作阳性对照吸光值为A₀，加乙二胺四乙酸和铜离子的孔吸光值为A，若A＜A₀，则说明所制备的抗体是针对铜离子，而不与乙二胺四乙酸反应，这样的孔即为阳性孔，阳性孔通过有限稀释法进行亚克隆，其杂交瘤细胞分泌的上清即为所制的铜单克隆抗体。其杂交瘤细胞分泌的上清即为所制的铜单克隆抗体。产生上述单克隆抗体的杂交瘤细胞DF4于2009年2月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C200907。

有益效果   本发明与现有方法相比，其优点和积极效果表现在：

(1)抗原实用性强：铜抗原合成与抗体制备技术具有重要的使用价值和实际意义，上述方法利用金属螯合剂1-(4-异硫氰基苯基)-乙二胺四乙酸，制备有效的铜抗原，免疫Balb/C鼠，通过杂交瘤技术获得特异性识别重金属铜的单克隆抗体，为重金属铜免疫速测试剂盒的研制解决了一个技术难点，为重金属铜高效快速简便的残留分析开山辟路，必将迅速推动我国铜免疫速测试剂盒的出现。

(2)抗原和抗体稳定性好：此法合成的铜抗原具有较好的稳定性，-20℃冰箱至少可以存放5年不影响其免疫原性。杂交瘤细胞冻存于液氮至少保持3年，抗体的稳定性也比较好，纯化的抗体-20℃冰箱至少可以存放2年。

(3)准确性高：与我国目前市场上常用的快速检测方法速测灵、速测卡、速测仪等检测方法相比，重金属铜ELISA检测方法准确度较高，重复性较好(平均变异系数低于5％)，抗体特异性识别铜离子，由表1可知，与Cd²⁺、In³⁺的交叉反应率(CR)均小于1.5％，与其它金属离子Cr³⁺，Fe³⁺，Hg¹⁺，Mn²⁺，Mg²⁺，Ca²⁺，Pb²⁺，Ag¹⁺，Ni²⁺，Co²⁺，Zn²⁺，Hg²⁺，Cu¹⁺和Co³⁺则没有交叉反应，表明单克隆抗体对重金属铜有较好的特异性，能用于重金属铜的检测。具体操作方法参照Xiaoxia Zhu；Baishi Hu；YangLou.Characterization of Monoclonal Antibodies for Lead-Chelate Complexes：Applications inAntibody-Based Assays.J.Agric.Food Chem.2007，55，4993-4998。

表1单克隆抗体与不同金属离子的交叉反应

(4)灵敏性高：检测曲线在0.01-10μg/ml范围内呈显著线性关系，检测极限值为0.014μg/ml。具体操作方法参照Xiaoxia Zhu；Baishi Hu；Yang Lou.Characterization of Monoclonal Antibodies forLead-Chelate Complexes：Applications in Antibody-Based Assays.J.Agric.Food Chem.2007，55，4993-4998。

杂交瘤细胞株DF4，于2009年2月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：武汉武汉大学邮编：430072，保藏编号为CCTCC NO：C200907。

具体实施方式

实施例1铜标准溶液(Sigma Co.)的检测

采用间接竞争ELISA方法，对检测曲线进行初步探索，方法如下：

包被：用10mM，pH7.4N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸缓冲液稀释包被抗原牛血清白蛋白-1-(4-异硫氰基苯基)-乙二胺四乙酸-Cu，50μl/孔加到96孔酶联微量分析板上，4℃放置过夜；

洗涤：PBST洗涤3次；

封闭：PBST稀释明胶至1％(m/v)，100μl/孔，37℃1.5小时；

洗涤：PBST洗涤3次；

加样：用含2mM乙二胺四乙酸磷酸盐缓冲液逐级稀释硝酸铜标准溶液成10^-5μg/ml、10^-4μg/ml、10^-3μg/ml、10^-2μg/ml、10^-1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml系列浓度，稀释好的溶液室温放置30min，再与稀释到一定倍数的铜抗体等体积混匀室温反应45分钟，加入到酶联板上50μl/孔，37℃1小时。

洗涤：PBST洗涤3次；

加酶标二抗：PBS溶液1000倍稀释HRP-羊抗鼠抗体，50μl/孔，37℃1小时；

洗涤：PBST洗涤5次；

显色：TMB 50μl/孔，37℃显色10分钟；

终止反应：加2M的硫酸，25μl/孔；

酶联仪上450nm处读数，空白基质作阳性对照吸光值Bo，待测样品吸光值B并计算抑制率，通过数据处理计算Logit(B/Bo)＝Ln[(B/Bo)/(1-B/Bo)]，抗体的IC₅₀＝0.671μg/ml，结果表明，制备的抗体能很好的识别铜，可用于研制铜免疫速测试剂盒。

实施例2自来水样品中检测铜残留量

牛血清白蛋白-1-(4-异硫氰基苯基)-乙二胺四乙酸-Cu 0.4μg/ml包被微量分析板中50μl/孔，铜抗体上清稀释4倍作为工作浓度，1％(m/v)明胶作封闭物，抗原抗体反应基质(N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸缓冲液)pH值为5.0、离子强度为0.15mol/L，微量分析板中50μl/孔。

待测样品准备：

自来水样品：量取自来水100μl，加入1000ug/ml铜标准溶液0.5μl，配制成5ug/ml的液体样品。

采用铜ELISA检测方法对以上样品进行检测，操作如下：

1)包被：

牛血清白蛋白-1-(4-异硫氰基苯基)-乙二胺四乙酸-Cu 0.4μg/ml在微量分析板中每孔加50μl，4℃冰箱过夜或37℃放置2小时，PBST洗涤3次并倒置、在吸水纸上拍干；

2)封闭：

1％(m/v)明胶作封闭物，微量分析板每孔100μl，37℃反应1.5小时，倒净，PBST洗涤3次并 倒置、在吸水纸上拍干；

3)加抗体及抗体与待测样品的混合液：

取待测样品100μL加到900μL反应基质中配制成待测液，稀释4倍的铜抗体上清与待测液和空白基质液等体积充分混合，以每孔50μL加到微量分析板中，37℃反应1小时，倒净，PBST洗涤3次并倒置、在吸水纸上拍干；

4)加酶标二抗：

用pH7.4、0.15mol/L的PBST缓冲液液将商品化的HRP-羊抗鼠抗体稀释1000倍，微量分析板每孔加50μl，37℃反应1小时，倒净，PBST洗涤5次并倒置、在吸水纸上拍干。

5)显色：

TMB底物溶液50μl/孔，37℃显色反应10分钟；

6)终止反应并读数

加2mol/L的硫酸，25μl/孔终止显色反应，酶联仪上450nm处读出吸光值，空白基质作阳性对照，Bo＝0.672，待测样品吸光值B＝0.395；

7)数据处理

计算出结合率B/Bo＝58.8％，代入公式1

Logit(B/Bo)＝Ln[(B/Bo)/(1-B/Bo)]    公式1

得到Logit(B/Bo)＝0.356

代入如下检测方程：

Logit(B/Bo)＝-0.8275LogC-0.1437    公式2

其中C为微量分析板孔中测得的铜离子浓度，求得C＝0.249ppm。待测样品中铜离子残留量(以浓度X表示)可通过公式3求得：

X＝10×2C    公式3

求得待测样本重金属铜残留量浓度X＝4.98ppm。

Claims (2)

1.一种抗重金属铜单克隆抗体，由小鼠杂交瘤细胞株DF4，CCTCC NO：C200907所产生的。

2.一种产生抗重金属铜单克隆抗体的杂交瘤细胞，其特征在于，它是小鼠杂交瘤细胞株DF4，CCTCC NO：C200907。