CN100465642C - 提高环境样品免疫检测抗基质效应的方法及其专用缓冲溶液 - Google Patents
提高环境样品免疫检测抗基质效应的方法及其专用缓冲溶液 Download PDFInfo
- Publication number
- CN100465642C CN100465642C CNB2007101192102A CN200710119210A CN100465642C CN 100465642 C CN100465642 C CN 100465642C CN B2007101192102 A CNB2007101192102 A CN B2007101192102A CN 200710119210 A CN200710119210 A CN 200710119210A CN 100465642 C CN100465642 C CN 100465642C
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- concentration
- buffer solution
- solution
- sample
- antibody
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 66
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 title claims abstract description 38
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims abstract description 19
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 47
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 title claims description 33
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 title claims description 32
- 230000036039 immunity Effects 0.000 title claims description 16
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 99
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 20
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 19
- ATNHDLDRLWWWCB-AENOIHSZSA-M chlorophyll a Chemical compound C1([C@@H](C(=O)OC)C(=O)C2=C3C)=C2N2C3=CC(C(CC)=C3C)=[N+]4C3=CC3=C(C=C)C(C)=C5N3[Mg-2]42[N+]2=C1[C@@H](CCC(=O)OC\C=C(/C)CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)[C@H](C)C2=C5 ATNHDLDRLWWWCB-AENOIHSZSA-M 0.000 claims description 14
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 10
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 10
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 7
- 239000003109 Disodium ethylene diamine tetraacetate Substances 0.000 claims description 7
- ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L EDTA disodium salt (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].OC(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC(O)=O)CC([O-])=O ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 7
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 claims description 7
- 235000019301 disodium ethylene diamine tetraacetate Nutrition 0.000 claims description 7
- 239000002689 soil Substances 0.000 claims description 7
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 6
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 5
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 5
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 claims description 4
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 claims description 4
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 claims description 4
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 claims description 4
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000002957 persistent organic pollutant Substances 0.000 claims description 4
- 239000003905 agrochemical Substances 0.000 claims description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 3
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 claims description 3
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 claims description 3
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 claims description 2
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 claims description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 claims description 2
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 claims description 2
- 229930002875 chlorophyll Natural products 0.000 claims description 2
- 235000019804 chlorophyll Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 abstract description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 93
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 77
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 73
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 67
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 66
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 43
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 40
- DIDLWIPCWUSYPF-UHFFFAOYSA-N microcystin-LR Natural products COC(Cc1ccccc1)C(C)C=C(/C)C=CC2NC(=O)C(NC(CCCNC(=N)N)C(=O)O)NC(=O)C(C)C(NC(=O)C(NC(CC(C)C)C(=O)O)NC(=O)C(C)NC(=O)C(=C)N(C)C(=O)CCC(NC(=O)C2C)C(=O)O)C(=O)O DIDLWIPCWUSYPF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 37
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 36
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 33
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 28
- QJZYHAIUNVAGQP-UHFFFAOYSA-N 3-nitrobicyclo[2.2.1]hept-5-ene-2,3-dicarboxylic acid Chemical compound C1C2C=CC1C(C(=O)O)C2(C(O)=O)[N+]([O-])=O QJZYHAIUNVAGQP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 25
- 239000004021 humic acid Substances 0.000 description 25
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 24
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 22
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 20
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 20
- 239000003094 microcapsule Substances 0.000 description 20
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 20
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 20
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 16
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 14
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 14
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 14
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 14
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 14
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 14
- 229930002868 chlorophyll a Natural products 0.000 description 12
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 12
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 12
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 10
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 9
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 8
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 8
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 8
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 8
- ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate Chemical compound [Cu+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 7
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 description 7
- 239000010865 sewage Substances 0.000 description 7
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 7
- UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 4-isocyanato-4'-methyldiphenylmethane Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1CC1=CC=C(N=C=O)C=C1 UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- JPVYNHNXODAKFH-UHFFFAOYSA-N Cu2+ Chemical compound [Cu+2] JPVYNHNXODAKFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 6
- 229910001431 copper ion Inorganic materials 0.000 description 6
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 6
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 6
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 6
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 6
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 6
- 125000003368 amide group Chemical group 0.000 description 5
- 229910000365 copper sulfate Inorganic materials 0.000 description 5
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 5
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 5
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 5
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 5
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 4
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 4
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 4
- 238000009739 binding Methods 0.000 description 4
- 239000012496 blank sample Substances 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 4
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 4
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 238000003825 pressing Methods 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 4
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 238000002414 normal-phase solid-phase extraction Methods 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 3
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 3
- WBODDOZXDKQEFS-UHFFFAOYSA-N 1,2,3,4-tetramethyl-5-phenylbenzene Chemical group CC1=C(C)C(C)=CC(C=2C=CC=CC=2)=C1C WBODDOZXDKQEFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005631 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid Substances 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011725 BALB/c mouse Methods 0.000 description 2
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- SRUWWOSWHXIIIA-UKPGNTDSSA-N Cyanoginosin Chemical compound N1C(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@@H](C)[C@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)C(=C)N(C)C(=O)CC[C@H](C(O)=O)N(C)C(=O)[C@@H](C)[C@@H]1\C=C\C(\C)=C\[C@H](C)[C@@H](O)CC1=CC=CC=C1 SRUWWOSWHXIIIA-UKPGNTDSSA-N 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 2
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N isopropyl alcohol Natural products CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 2
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 108010067094 microcystin Proteins 0.000 description 2
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 2
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 2
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 2
- WXKPPMQZRGORPB-UHFFFAOYSA-M sodium;2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid;acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O WXKPPMQZRGORPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LPXQRXLUHJKZIE-UHFFFAOYSA-N 8-azaguanine Chemical compound NC1=NC(O)=C2NN=NC2=N1 LPXQRXLUHJKZIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005508 8-azaguanine Drugs 0.000 description 1
- 240000003291 Armoracia rusticana Species 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZAFNJMIOTHYJRJ-UHFFFAOYSA-N Diisopropyl ether Chemical group CC(C)OC(C)C ZAFNJMIOTHYJRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 240000007049 Juglans regia Species 0.000 description 1
- 235000009496 Juglans regia Nutrition 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000005662 Paraffin oil Substances 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N Phenolsulfonephthalein Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1(C=2C=CC(O)=CC=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002535 Polyethylene Glycol 1500 Polymers 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- KXKVLQRXCPHEJC-UHFFFAOYSA-N acetic acid trimethyl ester Natural products COC(C)=O KXKVLQRXCPHEJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 229960001931 ampicillin sodium Drugs 0.000 description 1
- KLOHDWPABZXLGI-YWUHCJSESA-M ampicillin sodium Chemical compound [Na+].C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C([O-])=O)(C)C)=CC=CC=C1 KLOHDWPABZXLGI-YWUHCJSESA-M 0.000 description 1
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000002585 base Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 238000011095 buffer preparation Methods 0.000 description 1
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 1
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 239000012916 chromogenic reagent Substances 0.000 description 1
- 210000001728 clone cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 238000012851 eutrophication Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007499 fusion processing Methods 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 235000013905 glycine and its sodium salt Nutrition 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 1
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 229910017053 inorganic salt Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 description 1
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 1
- 238000002386 leaching Methods 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 108700039855 mouse a Proteins 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 235000011837 pasties Nutrition 0.000 description 1
- 210000003024 peritoneal macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 229960003531 phenolsulfonphthalein Drugs 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 229920000151 polyglycol Polymers 0.000 description 1
- 239000010695 polyglycol Substances 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- QTENRWWVYAAPBI-YCRXJPFRSA-N streptomycin sulfate Chemical compound OS(O)(=O)=O.OS(O)(=O)=O.OS(O)(=O)=O.CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](N=C(N)N)[C@H](O)[C@@H](N=C(N)N)[C@H](O)[C@H]1O.CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](N=C(N)N)[C@H](O)[C@@H](N=C(N)N)[C@H](O)[C@H]1O QTENRWWVYAAPBI-YCRXJPFRSA-N 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 150000005846 sugar alcohols Polymers 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- VUYXVWGKCKTUMF-UHFFFAOYSA-N tetratriacontaethylene glycol monomethyl ether Chemical compound COCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCO VUYXVWGKCKTUMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 231100001234 toxic pollutant Toxicity 0.000 description 1
- 230000007306 turnover Effects 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 235000020234 walnut Nutrition 0.000 description 1
- 239000002351 wastewater Substances 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明公开了一种提高环境样品免疫检测抗基质效应的方法及其专用缓冲溶液。本发明所提供的环境样品免疫检测专用缓冲溶液，是在现有的浓度为0.05-0.12mol/L、pH为7.0-8.0的缓冲液中，加入下述a)、b)和c)的物质：a)NaCl，使其终浓度为10-100g/L；b)惰性蛋白或明胶，使其终浓度为2-20g/L；所述惰性蛋白是不与免疫反应体系发生反应的蛋白；c)乙二胺四乙酸二钠，使其终浓度为2-20g/L。本发明的提高环境样品免疫检测抗基质效应的方法及其专用缓冲溶液可用于各种环境样品(如水样)的免疫检测中，可有效地减小或消除来自环境样品(如水样)中各种复杂基质在其自然界存在的边界范围内给免疫检测带来的干扰，使实际环境样品免疫检测的稳定性增强。
Description
技术领域
本发明涉及环境样品免疫检测技术领域中一种提高环境样品免疫检测抗基质效应的方法及其专用缓冲溶液。
背景技术
基质(Matrix)是指一种分析物(Analyte)的环境(Milieu)，即指样品中除了目标分析物以外的一切成份及其物理、化学性质(例如粘度、pH、温度等)。
基质效应(Matrix Effect)在医学上按临床及实验室标准化组织的定义是指：(1)样品中除分析物以外的其他成份对分析物测定值的影响；(2)基质对分析方法准确测定分析物的能力的干扰。
环境样品中的各种基质与其它样本中(如医学上的血液样品)的基质有着较大的不同，这是环境样品免疫检测技术非常重要的特点之一。为了能实现对水样进行直接的免疫检测，减少或省略预处理步骤，因此，有必要考察水中的各种基质对免疫检测的影响，做出全面的评价，并对不利的影响和干扰提出解决方案，以保证免疫检测的稳定性、重复性和可靠性。
目前，环境样品的免疫检测研究中，有关环境样品中复杂基质对免疫检测的干扰规律以及对干扰的消除方法等尚未开展起来。而这些对保证免疫检测的稳定性、重复性和可靠性十分关键。
发明内容
本发明的目的是提供一种提高环境样品免疫检测抗基质效应的方法及其专用缓冲溶液。
本发明所提供的缓冲溶液，是在现有的浓度为0.05-0.12mol/L、pH为7.0-8.0的缓冲液中，加入下述a)、b)和c)的物质：
a)NaCl，使其终浓度为10-100g/L；
b)惰性蛋白或明胶，使其终浓度为2-20g/L；所述惰性蛋白是不与免疫反应体系发生反应的蛋白；
c)乙二胺四乙酸二钠，使其终浓度为2-20g/L。
所述现有的缓冲液具体可为磷酸盐缓冲液。
所述惰性蛋白包括但不限于牛血清白蛋白、鸡蛋白蛋白和兔血清白蛋白。
其中，所述NaCl的浓度优选为50g/L。
所述惰性蛋白或明胶的浓度优选为10g/L。
所述乙二胺四乙酸二钠的浓度优选为5g/L。
本发明所提供的提高环境样品免疫检测抗基质效应的方法，是在环境样品免疫检测中，将上述任一种环境样品免疫检测专用缓冲溶液作为缓冲体系，进行境样品的免疫检测。
本发明的提高环境样品免疫检测抗基质效应的方法及其专用缓冲溶液可用于各种环境样品(如水样)的免疫检测中，可有效地减小或消除来自环境样品(如水样)中各种复杂基质在其自然界存在的边界范围内给免疫检测带来的干扰，使实际环境样品免疫检测的稳定性增强。
本发明的提高环境样品免疫检测抗基质效应的方法及其专用缓冲溶液能应用在环境样品各种免疫检测技术上，包括环境样品的酶联免疫吸附试验试剂盒(ELISAkit)、环境样品胶体金试纸检测、环境样品免疫传感器/抗体芯片(免疫芯片，抗体阵列)等检测技术方面，能显著提高上述免疫检测技术的稳定性和一致性。
附图说明
图1为添加普通缓冲液的不同pH值条件下的ELISA标准曲线
图2为图1标准曲线的最大吸光度A0和IC50的比较
图3为添加专用缓冲液1的不同pH值条件下的ELISA标准曲线
图4为图3标准曲线的最大吸光度A0和IC50的比较
图5为添加普通缓冲液的不同硬度下的ELISA标准曲线
图6为图5标准曲线的最大吸光度A0和IC50的比较
图7为添加专用缓冲液1的不同硬度下的ELISA标准曲线
图8为图7标准曲线的最大吸光度A0和IC50的比较
图9为添加普通缓冲液的不同腐殖酸浓度下的ELISA标准曲线
图10为图10标准曲线的最大吸光度A0和IC50的比较
图11为添加专用缓冲液1的不同腐殖酸浓度下的ELISA标准曲线
图12为图11标准曲线的最大吸光度A0和IC50的比较
图13为添加普通缓冲液的不同CuSO4浓度下ELISA标准曲线
图14为添加普通缓冲液的不同CuSO4浓度下A0和IC50值的变化
图15为添加专用缓冲液1的不同CuSO4浓度下ELISA标准曲线
图16为添加专用缓冲液1的不同CuSO4浓度下A0和IC50值的变化
图17为添加专用缓冲液1的不同COD浓度下的ELISA标准曲线
图18为添加专用缓冲液1的不同COD浓度下A0和IC50值的变化
图19为添加专用缓冲液1的不同叶绿素a浓度下的ELISA标准曲线
图20为添加专用缓冲液1的不同叶绿素a浓度下A0和IC50值的变化
图21为添加普通缓冲液的不同甲醇浓度下的ELISA标准曲线
图22为添加普通缓冲液的不同甲醇浓度下A0和IC50值的变化
图23为添加专用缓冲液1的不同甲醇浓度下的ELISA标准曲线
图24为添加专用缓冲液1的不同甲醇浓度下A0和IC50值的变化
图25为添加专用缓冲液1的不同甲苯浓度下的ELISA标准曲线
图26为添加专用缓冲液1的不同甲苯浓度下A0和IC50值的变化
图27为添加专用缓冲液1的不同2，4-D浓度下的ELISA标准曲线
图28为添加专用缓冲液1的不同2，，4-D浓度下A0和IC50值的变化
图29为添加专用缓冲液2的不同pH值条件下ELISA标准曲线最大吸光度A0和IC50的比较
图30为添加专用缓冲液2的不同硬度条件下ELISA标准曲线最大吸光度A0和IC50的比较
图31为添加专用缓冲液2的不同腐殖质酸浓度下ELISA标准曲线最大吸光度A0和IC50的比较
图32为添加专用缓冲液3的不同pH值条件下ELISA标准曲线最大吸光度A0和IC50的比较
图33为添加专用缓冲液3的不同硬度条件下ELISA标准曲线最大吸光度A0和IC50的比较
图34为添加专用缓冲液3的不同腐殖质酸浓度下ELISA标准曲线最大吸光度A0和IC50的比较
具体实施方式
本发明通过全面分析和系统考察环境中的各种基质对免疫检测的影响，提出一种免疫检测反应过程中的缓冲体系。具体方法如下：
首先将环境样中有代表性的基质进行分类，以免疫检测为基础，综合分析了各类基质对免疫检测的影响规律及机理，并提出了相应的干扰减小或消除方案。本发明实验中选取的可能影响抗体性质或影响抗原抗体反应的代表性基质包括以下几类：
(1)水中的环境条件干扰因素：pH值、硬度和无机盐浓度；
(2)水体综合污染指标：选取生活污水作为干扰基质；
(3)富营养化水体中普遍存在的物质：腐殖酸和叶绿素a；
(4)水中可能存在的有毒污染物：选取甲苯作为有机干扰基质、选取2，4-D作为农药类干扰基质、选取铜离子作为重金属干扰基质。
(5)样品提取或浓缩过程、以及免疫检测过程可能引入的有机溶剂：甲醇、乙酸和表面活性剂。
考察环境样品中基质效应对免疫检测的干扰，并提出抗干扰解决方案，基本步骤如下：
(1)研究上述各基质在不同浓度条件下对免疫检测的影响规律。即比较干扰基质不同浓度条件下对免疫检测标准曲线的变化，观察标准曲线受不同浓度基质影响变化的趋势和程度，通过对比，定性描述各包括标准曲线的高低、旋转及偏移等在内的影响规律；同时定量的评价各干扰基质对免疫检测最低检测能力和定量检测区间的影响。
(3)通过配制相应的缓冲溶液用作反应稀释液，并在稀释液中添加不同的抗干扰物质来减小或消除这些不利的干扰因素。并重新进行标准曲线的测定，同时评价对不利干扰因素的抑制效果。
(4)最后评价在稀释液中添加的抗干扰物质本身对免疫检测的影响。在系统考虑各基质的影响规律及消除方法的基础上，得出本发明的环境样品免疫检测专用缓冲溶液。
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
骨髓瘤细胞SP2/O种子来源于中国协和医科大学基础医学院细胞中心。6周龄的Balb/c纯系雌性小鼠购自中国协和医科大学实验动物中心。新生牛血清(PAA，LotB00104-0786)，细胞融合用PEG 1500(Roche，11423800)，50×HAT储液(Sigma，H0262，Lot 093K8931)，50×HT储液(Sigma H0137，Lot 064K8927)，IMDM培养基(Gibco，Invitrogen Corp.Lot 1272036)，氨苄青霉素钠(Amresco 0339)，硫酸链霉素(Amresco 0382)，8-Azaguanine(Sigma A5284)，DMSO(Amresco 0231)，石蜡油，无水乙醚、异丙醇(北京化学试剂公司)。MC-LR(Alexis公司(Lausen，Switzerland)，产品编号ALX-350-012)。BSA(Sigma，A7638)。OVA(Sigma，A5378)。
实施例1、抗微囊藻毒素-LR的单克隆抗体MC8C10的获得
一、杂交瘤细胞株MC8C10 CGMCC No.2101的获得
1、微囊藻毒素-LR完全抗原MC-LR-BSA的合成
将微囊藻毒素-LR采用2-巯基乙胺进行化学修饰，在其第七位氨基酸(Mdha)上引入一个活性基团——氨基，再采用戊二醛法将修饰后的微囊藻毒素-LR(MC-LR)与牛血清白蛋白偶联，经过滤层析后得到完全抗原，经MALDI-TOF/MS确定完全抗原的偶联比。具体方法如下：
(1)对微囊藻毒素-LR进行氨基修饰
①将2-巯基乙胺和MC-LR按照摩尔比3000:1充分混和在碱性的碳酸盐缓冲液中(pH＝8.0)；混合物充分摇匀，在50℃反应1.5小时；
②反应完毕，降到室温，加入与2-巯基乙胺等摩尔的乙酸使反应停止；
③中间产物的纯化采用固相萃取技术，得到经氨基修饰的微囊藻毒素-LR。材料为500mg6mL C18 BondElut cartridge(Varian，Walnut Creek，CA)，具体步骤如下：
活化：用4mL甲醇活化，并用6mL高纯水调整，分为2-3次使用；
上样：将水样以5-10mL/min的流速流过固相萃取柱进行富集浓缩。重力过滤；
淋洗：装样完毕后，用5％甲醇水溶液6mL淋洗以净化样品，分为3次使用；
洗脱：待固相萃取柱吹干后，以4mL甲醇(分为2次)将微囊藻毒素洗脱并收集。
(2)半抗原多肽与载体蛋白偶联
选择牛血清白蛋白(BSA)作为载体蛋白，采用戊二醛法将步骤(1)获得的经氨基修饰的微囊藻毒素-LR与载体蛋白进行偶联，具体方法包括以下步骤：
(a)取10mg BSA(1.5×10-7摩尔)，完全溶解于5mL 0.01mol/L PBS(Na2HPO4·12H2O 2.96g，KH2PO4 0.2g，NaCl8.0g加水至1000mL，pH 7.2)中，再加入4mg步骤(1)获得的经氨基修饰的微囊藻毒素-LR(4×10-6摩尔)，使其完全溶解；
(b)缓慢加入5mL 0.2％的戊二醛溶液，与步骤(a)获得的溶液混合，并在室温下，搅拌反应2小时；
(c)加入0.2mL1M甘氨酸，在室温下搅拌1小时，以终止反应；
(d)将步骤(c)获得的溶液用Sephadex G-25凝胶层析柱(Pharmacia)进行过滤层析，得到微囊藻毒素-LR完全抗原MC-LR-BSA。MALDI-TOF/MS检测，结果表明该完全抗原的偶联比为5.12，符合要求。将纯化的完全抗原经-40℃冷冻后，真空浓缩干燥，保存于-20℃冰箱中。
2、免疫动物
选取6周龄的雌性Balb/c小鼠，采用低剂量长程免疫法进行免疫，方法为：皮下多点注射，30μg MC-LR-BSA/只，共免疫4次，初次免疫加福氏完全佐剂(0.1mL/只)，后三次加强免疫加福氏不完全佐剂(0.1mL/只)，免疫间隔时间为30天。在第三次加强免疫后的第10天，对小鼠进行尾部静脉取血，用间接ELISA法测定效价，其中，包被的MC-LR-BSA的浓度为5μg/mL。对抗血清效价达到1×105以上的小鼠，进行一次冲击免疫，即每只小鼠采用10μl MC-LR-BSA+90μl生理盐水进行腹腔注射，3天后取脾细胞进行细胞融合。
3、细胞融合
1)免疫脾细胞的制备
将步骤2冲击免疫三天后的BALB/c小鼠处死，无菌状态下取出脾脏，去表面包膜及脂肪，剪碎，置于平皿中研磨，加GKN溶液(NaCl 8g，KCl 0.4g，Na2HPO4·2H2O1.77g，NaH2PO4·H2O 0.69g，葡萄糖2g，酚红0.01g，溶于1000mL水中)制成单细胞悬液，用200目铜网过滤，去除大的细胞团块后，离心，用GKN溶液洗涤并重悬脾细胞，计活细胞数，约为1×108个/mL。
2)SP2/O骨髓瘤细胞的处理
取指数生长期的SP2/O骨髓瘤细胞，离心，用GKN溶液洗一次并悬浮于其中，计活细胞数，为1×108个/mL。
3)免疫脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞的融合
将步骤2)的SP2/0骨髓瘤细胞与步骤1)的免疫脾细胞融合，具体过程包括以下步骤：
1.聚乙二醇(PEG)的配制(50％ PEG)：PEG(MW 1500，Roche，11423800)10.0g置于30mL容量小烧瓶中，高压3.6×105Pa15min，冷却至50℃后加入完全培养基(IMDM培养基(Gibco，Invitrogen Corp.Lot 1272036))10.0mL，混匀，分装1.0mL/管，4℃保存。
2.取HAT培养液40mL(50×HAT储液，Sigma，H0262，Lot 093K8931)，完全培养液(IMDM培养基)15mL和50％ PEG分别放入37℃水浴箱中预热，另将一只盛水的烧杯同时放入水浴箱中备用。
3.分别吸取含7.0×107个骨髓瘤细胞SP2/0和7.0×108个脾细胞的悬液加入50mL离心管中，充分混匀，并加IMDM培养基至40mL。
4.1200rpm离心8min，弃去上清液，用吸管吸净残留液体，以免影响PEG的浓度。轻轻弹击离心管底，使两种细胞充分混匀，直至成糊状。
5.将离心管置于预温的烧杯中，用1mL已用7.5％ NaHCO3调整pH值至8.0(7.8-8.2均可)的PEG 0.8mL，将吸管插入管底，继而轻轻搅动沉淀，并缓缓滴加PEG，1min内加完，再在水浴中静置90s。
6.立即滴加37℃预温的完全培养液(IMDM培养基)15mL，使PEG稀释而失去作用。滴加的方法是在30s内加1mL，次30s加3mL，接下来1min加完。注意，当PEG溶液加入后，即可见细胞凝集成小团块状，此时操作宜轻柔，以免干扰细胞融合过程。
7.补加完全培养液(IMDM培养基)至40mL，1000rpm离心10min，弃上清。
8.将细胞沉淀轻悬于预温的HAT培养液40mL中，加到4块已有饲养细胞层(小鼠腹腔巨噬细胞)的96孔板内，每孔加100μl。继而将培养板移至37℃、5％ CO2饱和湿度恒温箱中培养。
4、融合细胞的筛选及克隆化培养
约3天后，当杂交瘤细胞长满孔底1/4-1/2时，培养基变黄，此时用常用的ELISA法检测培养基上清液中的抗体，具体方法包括以下步骤：
1.吸取96孔板每孔的一半上清，采用ELISA法进行阳性杂交瘤细胞筛选(一筛)，具体方法为：
用50mM碳酸盐缓冲液(pH 9.5)稀释包被抗原至2mg/L，加入到96孔酶联板中进行包被，每孔100μl，4℃包被12-24小时，无需封闭；每孔加入各个克隆孔上清液100μL，37℃温育1h，充分洗涤后加入100μL 1：10000的酶标二抗(HRP-羊抗鼠IgG)，37℃温育1h后，加入底物显色，10min后终止，读取A450nm，A450nm值为阴性对照2.1倍的为阳性杂交瘤细胞。对于一筛呈阳性的克隆株，进一步培养后，按照同样方法进行第二次筛选。
其中，包被抗原为MC-LR-OVA，它按照下述方法制备：取3mL OVA，加入0.3mg上述氨基修饰后的MC-LR，加入0.1mL 1.25％戊二醛充分混合，室温反应24h。
2.吸取检测结果呈阳性的孔中的剩余上清，加入新鲜HT培养基(50×HT储液(Sigma H0137，Lot 064K8927))做进一步培养；
3.第二天用与步骤1相同的ELISA法复测第一次呈阳性的上清及吸取的剩余上清(二筛)；
4.将2次ELISA检测均为阳性的克隆细胞吸出，转移至含BALB/c小鼠腹腔细胞的HT培养基制成的24孔(每孔0.9mL HT培养基)营养板的3-4个孔内，进行再克隆。然后吸取上清，采用与步骤1相同的ELISA法对阳性克隆株进行再次确定(三筛)。
对于三筛后的阳性克隆株，采用MC-LR单体、BSA及OVA再进行一次筛选，包被浓度分别为5μg/mL，2μg/mL及2μg/mL，4℃包被过夜，其它条件同上。选取对OVA及BSA均为阴性、对MC-LR检测结果为阳性的克隆株。结果得到4株阳性克隆株。将其中一株阳性克隆株，名称为能分泌抗Microcystin-LR单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞株MC8C10，于2007年06月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址是中国北京市海淀区中关村北一条13号)，保藏编号为CGMCC No.2101。
二、单克隆抗体MC8C10的获得及亚型鉴定
1、获取抗体腹水
选取10周龄BALB/C小鼠，接种细胞前7-10天，预先腹腔注射液体石蜡0.5mL/只。用生理盐水调整杂交瘤细胞株MC8C10 CGMCC No.2101浓度至2×106个/mL，腹腔接种杂交瘤细胞，接种细胞数为1×106个/只，7-10天后采集腹水。
2、腹水的纯化
采用HiTrap rProtein A FF1mL免疫亲和层析柱(Bio-Science AB，Sweden.LotNo.309591)来纯化步骤1获得的小鼠单克隆抗体腹水，得到MC8C10。该层析柱所含的1mL介质最多能结合23mg由小鼠产生的IgG2b型单克隆抗体，并且对于IgG2b型抗体的结合能力是最高的，而对于小鼠产生的其它抗体亚类(如IgG1、IgG2a、IgG3等)的结合能力较弱。偶联缓冲液为0.2mol/L、pH7的磷酸盐缓冲液(将NaH2PO4·2H2O1.216g，Na2HPO4·12H2O 4.369g溶解于100mL双蒸水中)。洗脱缓冲液采用0.1M柠檬酸钠溶液(pH3.5)。结果得到3mg固态的MC8C10。将纯化的抗体分装，-20℃保存。
3、抗体亚型鉴定
采用单克隆抗体亚型检测试盒(ImmunoType TM Kit，Sigma)对步骤2获得的抗体进行免疫球蛋白亚型的鉴定，具体方法为：用PBS以1:1000比例稀释各类抗体(小鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgA及IgM)，然后用稀释抗体包被96孔酶联板(每孔0.1mL，每类抗体两个孔)，37℃温育1小时后，弃包被液，洗涤3次，按0.1mL/孔的量加入步骤2纯化的抗体，室温温育1小时后洗涤3次，按0.1mL/孔的量加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG(购自邦定生物公司)，室温温育30分钟后，洗涤3次，按0.1mL/孔的量加入辣根过氧化物酶底物反应液(1mg/mL TMB)，室温10-15分钟，出现褐色即为阳性结果，最后按0.05mL/孔的量加入2mol/L H2SO4终止反应。结果表明杂交瘤细胞MC8C10分泌的抗体为IgG2b亚类。
这里配制缓冲液均使用双蒸水，化学试剂纯度为分析纯或更高。最后配制的缓冲液采用0.45μm的滤器过滤。
实施例2、利用专用缓冲溶液1提高环境样品免疫检测抗基质效应
所用的专用缓冲液1是在0.1mol/L、pH为7.4的PBS(配置方法：KCl 2.0g；KH2PO4 2.4g；Na2HPO4·12H2O 29g；双蒸水加至1000mL。)中，加入下述a)、b)和c)的物质：a)NaCl，使其终浓度为50g/L；b)牛血清白蛋白，使其终浓度为10g/L；b)乙二胺四乙酸二钠，使其终浓度为5g/L。
一、消除水中酸碱度给免疫检测带来的影响
采用竞争ELISA方法检测待测水样中的微囊藻毒素-LR。实验设两个处理：抗体溶液1和抗体溶液2处理。
所用的试剂和酶标板按照如下方法制备：
1、待测水样的配制：
a.浓盐酸中HCl含量为36％-38％，用纯水稀释10倍配制成1mol/L的标准溶液，pH＝0.0；
b.称取4g NaOH，溶于100mL纯水中，配制成浓度为1mol/L的标准溶液，pH＝14.0；
c.利用a和b的两种标准溶液的不同配比，配制如下pH梯度溶液：3，4，5，6，7，8，9，10共8个梯度。利用pH计校正。
d.用c中的溶液配制pH分别为3、4、5、6、7、8、9和10，以及浓度(单位：μg/L)分别为1000、300、90、27、8.1、2.43、0.729、0.219、0.0656、0.020、0.006、0的MC-LR标准溶液，共96个待测水样。每个pH的待测水样采用2个平行，测定不同pH条件下MC-LR间接竞争ELISA标准曲线。
2、抗体溶液配制：
A、抗体溶液1的配制
单克隆抗体MC8C10的稀释采用0.01mol/L pH＝7.4的磷酸盐缓冲溶液(配置方法：NaCl 8g；KCl 0.2g；KH2PO4 0.24g；Na2HPO4·12H2O 2.9g；蒸馏水加至1000mL。)，即普通缓冲液，稀释度1：6000。
B、抗体溶液2的配制
将单克隆抗体MC8C10改用专用缓冲液1进行稀释，稀释度1：6000。重复试验，以确定本发明的专用缓冲液对pH值干扰的抑制效果。
3、酶标二抗溶液配制：辣根过氧化物酶-羊抗鼠IgG原液，灌装入试剂瓶中，使用时用洗涤液按1：10000配制成工作浓度。
4、洗涤液配制(10×PBST)：含0.5％(体积百分含量)吐温-20和80g/L氯化钠的0.1mol/L pH＝7.5磷酸盐缓冲液，灌装入试剂瓶中。使用时，将该溶液用纯水稀释10倍再用。
5、底物溶液配制：使用0.1mol/L pH5.0的醋酸钠-柠檬酸缓冲液，每1ml缓冲液中加入50μL 0.1％的H202溶液，灌装入试剂瓶中。
6、显色剂溶液配制：用丙酮配制成10mg/mL的四甲基联苯胺溶液，用0.1mol/LpH5.0的醋酸钠-柠檬酸缓冲液配制成0.2mg/mL的四甲基联苯胺溶液，灌装入试剂瓶中。
7、终止液配制：2mol/L H2SO4溶液，灌装入试剂瓶中。
8、酶标板是包被了包被抗原的96孔聚苯乙烯微量反应板。
酶标板的包被：包被抗原采用实施例1的MC-LR-BSA，包被浓度0.25μg/mL，取120μL包被抗原加入反应板孔中，4℃冰箱中过夜，倒出孔内液体，用洗涤液1×PBST洗涤3-5次，将酶标板倒置在吸水纸上拍打，吸干，在已包被抗原的酶标板小孔中加入150μL 1％的BSA(质量百分含量)封闭，37℃温育1h，用洗涤液1×PBST洗涤3-5次，用吸水纸吸干，真空封装。
具体测定方法如下：将待测水样与抗体溶液同时加入酶标板小孔中，同时设置空白孔(将添加的抗体换成高纯水，其它一致)和阴性对照孔(待测水样用高纯水代替，即不含MC-LR，其它一致)，37℃温育0.5h，倒出孔内液体，重复用洗涤液(10×PBST)洗涤2-5次，将酶标板倒置在吸水纸上拍打；加入酶标二抗溶液于酶标板小孔中，37℃温育0.5h，用洗涤液重复洗3-5次，吸干；加入底物溶液和显色溶液到酶标板小孔中，室温下反应10-15min，用酶标仪在波长450m处测定吸光度A，以不加抗体的小孔作为空白调零。以各浓度的吸光度A为纵坐标，以对应MC-LR浓度的log10值为横坐标，绘制半对数标准曲线图。
对各标准曲线进行模型拟合及评价，采用4参数Logistic模型：
其中：
x：未标记抗原浓度(质量浓度或物质的量浓度)，自变量；
A：x对应的吸光度(Absorbance)，因变量；
A1：上端渐近线(x＝0)，常数；
A2：下端渐近线(x→∞)，常数；
p：与曲线的斜率有关，常数；
x0：曲线的中点，或称拐点，常数；
(1)半抑制浓度IC50是竞争ELISA一个很重要的评价指标。在竞争ELISA中，IC50≡x0。
(2)在竞争ELISA中，依据上述Logistic模型，定义最大吸光度A0如下式。
A0＝A1
添加普通缓冲液的不同pH值条件下的标准曲线如图1所示，各标准曲线的最大吸光度A0和IC50的比较如图2所示。表明酸性条件对免疫反应有强烈的影响，而在碱性条件下则有利于反应的进行；随着pH值的增大，最大吸光度有所增加，但幅度不大；pH值对IC50的值影响比较大，因此而直接影响ELISA的灵敏度。pH值在7-8之间时，IC50值达到最小值，随着酸度或碱度的增加，IC50都会增加，灵敏度下降。抗原抗体之间的氢键结合力以及离子化抗体配位受体受pH值影响较大，pH值同时又可能影响抗原和抗体的分子结构。说明pH值接近中性或动物体液环境时(pH＝7.4)，最利于抗原抗体的结合反应。
为了消除pH值对抗原抗体反应的影响，采用本发明的专用缓冲液1，加大对酸碱度的缓冲能力。添加专用缓冲液1的各标准曲线如图3所示，进一步结合图4表明，该方法是有效的。各标准曲线一致性良好，最大吸光度A0和IC50值都没有明显变化，说明pH值的影响已经消除。结果表明，采用专用缓冲液1作为抗体稀释液，该缓冲液pH值为7.4左右，最有利于抗原抗体的反应，并且还能消除样品中的酸或碱(pH＝3-10)带来的干扰。
二、消除水中硬度给免疫检测带来的影响
采用竞争ELISA方法检测待测水样中的微囊藻毒素-LR。实验设两个处理：抗体溶液1和抗体溶液2处理。除了待测水样外，实验方法和实验材料同步骤一。
(一)待测水样的配制：
1.称取1.11g无水CaCl2，溶解于10mL纯水中，配制1mmol/L的Ca2+溶液。
2.称取2.03g MgCl2·6H2O，溶解于10mL纯水中，配制1mmol/L的Mg2+溶液。
3.用纯水配制如下浓度梯度的Ca2+和Mg2+混合液(摩尔比1：1，单位：mmol/L)：20、15、10、8、6、4、2、0，对应的硬度梯度为(单位：德国度)：112、84、56、44.8、33.6、22.4、11.2、0。
4.MC-LR的贮备液浓度为100mg/L，用步骤3的溶液分别配制不同硬度条件下的MC-LR标准溶液，作为待测水样：梯度如下(μg/L)：0，0.006，0.02，0.0656，0.22，0.729，2.43，8.1，27，90，300，1000。共96个待测水样。每个硬度条件下采用2个平行，测定不同硬度下MC-LR间接竞争ELISA标准曲线。
(二)结果分析
添加普通缓冲液的硬度对ELISA反应有一定的影响，实验结果如图5及6所示。结果表明，当钙镁离子浓度大于等于8mmol/L时(对应的硬度为44.8)，会较大程度上影响间接竞争ELISA的抗原抗体结合反应，标准曲线部分变形，本底值升高，重复性降低，标准偏差增大，无法进行定量计算。
为了降低样品中的硬度带来的影响，抗体稀释液采用本发明的专用缓冲液1，实验结果如图7及8所示。结果表明，此时硬度对免疫检测的影响明显地被消除。当钙镁离子浓度小于等于20mmol/L(对应的硬度为112)时，各标准曲线的一致性良好，最大吸光度和半抑制浓度都没有明显的变化。
三、消除水中腐殖质酸给免疫检测带来的影响
采用竞争ELISA方法检测待测水样中的微囊藻毒素-LR。实验设两个处理：抗体溶液1和抗体溶液2处理。除了待测水样外，实验方法和实验材料同步骤一。
(一)待测水样的配制：
1.用纯水配制0.3倍浓度梯度的腐殖酸(HA)(北京化学试剂公司)溶液如下(单位：mg/L)：1000、300、90、27、8.1、2.43、0.729、0。
2.MC-LR的贮备液浓度为100mg/L，分别用步骤1的溶液配制不同腐殖酸浓度条件下的MC-LR标准溶液，作为待测水样：梯度如下(μg/L):0，0.006，0.02，0.0656，0.22，0.729，2.43，8.1，27，90，300，1000。共96个待测水样。每个腐殖酸浓度采用2个平行，测定不同硬度下MC-LR间接竞争ELISA标准曲线。
(二)结果分析
添加普通缓冲液的不同浓度的腐殖酸溶液条件下ELISA标准曲线如图9所示，各标准曲线的空白样品吸光度(最大吸光度，A0)及半抑制浓度IC50的比较如图10所示。实验结果表明，HA浓度大于1g/L时，便明显地影响间接竞争ELISA反应，致使反应没有梯度产生。腐殖酸的溶解度随着pH升高而增加，实验观察发现，腐殖酸溶解度在纯水中较难溶解，当配制浓度为1g/L时，仍然可见沉淀。当有沉淀存在时，可能因为没有溶解的腐殖酸能吸附微囊藻毒素或者抗体，并一起吸附到酶标板上，导致免疫反应失败。当腐殖酸浓度大于等于27mg/L时，会较大程度上影响间接竞争ELISA的抗原抗体结合反应，标准曲线部分变形，重复性降低，标准偏差增大，曲线变得不可预测，也无法拟合，因而无法进行定量计算。另外，随着腐殖酸浓度的升高，空白样品的吸光度(A0)下降，而非特异性吸附并没有明显的提高；IC50值也不断增加。
腐殖酸的影响不仅是其酸性带来的影响，结果表明，即使采用10×PBS也未能彻底消除其酸度的影响，可见腐殖酸还有其它的影响途径。进一步分析得出，腐殖酸分子量由数千到数万，分子结构非常复杂，属于大分子聚合物。其分子上存在很多不同直径的空间或洞穴，这些空隙中可以容纳吸收有机污染物和重金属离子等。有可能MC-LR分子被其吸附，而无法与抗体结合，即竞争性的有利半抗原浓度降低，会导致ELISA吸光度下降和半抑制浓度的升高。
为了消除腐殖酸带来的影响，采用本发明的专用缓冲液1来稀释抗体，并进行间接竞争ELISA实验，结果如图11及12所示。结果表明，BSA能有效地抑制腐殖酸带来的影响。但当腐殖酸浓度为1000mg/L时，IC50略有上升，达到了6.6μg/L。说明对于腐殖质适用的边界条件为0-300mg/L。
四、消除水中重金属给免疫检测带来的影响
采用竞争ELISA方法检测待测水样中的微囊藻毒素-LR。实验设两个处理：抗体溶液1和抗体溶液2处理。除了待测水样外，实验方法和实验材料同步骤一。
(一)待测水样的配制：
1.用纯水配制CuSO4·5H2O(北京化学试剂公司)溶液如下(单位：mg/L)：5000、1000、200、40、8、1.6、0.32。
2.MC-LR的贮备液浓度为100mg/L，分别用步骤1的溶液配制不同硫酸铜浓度条件下的MC-LR标准溶液，作为待测水样：梯度如下(μg/L)：0，0.006，0.02，0.0656，0.22，0.729，2.43，8.1，27，90，300，1000。共96个待测水样。每个硫酸铜浓度采用2个平行，测定不同硫酸铜浓度下MC-LR间接竞争ELISA标准曲线。
(二)结果分析
添加普通缓冲液的不同浓度的硫酸铜溶液条件下ELISA标准曲线如图13所示，各标准曲线的空白样品吸光度(最大吸光度，A0)及半抑制浓度IC50的比较如图14所示。实验表明，当CuSO4浓度为5g/L时，加入一抗后溶液即变蓝，出现混浊，并有蓝色沉淀；显色后，该浓度条件下的吸光度比其它浓度条件下高许多，梯度不明显，数据不可拟合。可能原因是抗体被铜离子沉淀下来并吸附到酶标板上，3次洗涤液没有将其洗脱下来。
另外，随着铜离子浓度的升高，本底值也有升高趋势，表明部分抗体被铜离子沉淀下来；并且，标准曲线变形严重，说明抗原抗体反应受到了明显地影响。
为了降低样品中铜离子带来的影响，采用本发明的专用缓冲液1来稀释抗体，并进行间接竞争ELISA实验，结果如图15及16所示。结果表明，此时铜离子对免疫检测的影响明显地受到抑制。当硫酸铜浓度小于等于1000mg/L时，各标准曲线的一致性良好，最大吸光度和半抑制浓度都没有明显的跳跃；当样品中的硫酸铜浓度为5000mg/L时，由于浓度太高，对免疫反应的影响仍然很严重。所以对于硫酸铜适用的边界条件为0-1000mg/L。
五、消除水中综合污染物给免疫检测带来的影响
采用竞争ELISA方法检测待测水样中的微囊藻毒素-LR。实验只设抗体溶液2处理。除了待测水样外，实验方法和实验材料同步骤一。
(一)待测水样的配制：
1.生活污水取自清华大学学生宿舍1号楼下水道，水样采集后采用普通滤纸过滤，滤液CODCr测定结果为469mg/L。用纯水梯度稀释生活污水如下：100％、80％、60％、50％、40％、20％、10％、0。
2.MC-LR的贮备液浓度为100mg/L，采用步骤1的溶液配制不同生活污水浓度条件下的MC-LR标准溶液，作为待测水样：梯度如下(μg/L)：0，0.006，0.02，0.0656，0.22，0.729，2.43，8.1，27，90，300，1000。共96个待测水样。每个样品采用2个平行，测定不同生活污水浓度条件下MC-LR间接竞争ELISA标准曲线。
(二)结果分析
添加专用缓冲液1的不同污染程度的生活污水对ELISA检测的影响结果如图17及图18所示，可以看出，生活污水对ELISA的影响比较明显，随着污水浓度的升高，其中的基质会明显地影响ELISA的吸光度，使吸光度整体下降。而且标准曲线的IC50值也会有起伏的变化。当CODCr浓度高于200mg/L时，A0值有明显的下降，曲线的上平台吸光度从0.6下降到0.45左右。当CODCr浓度高于375mg/L时，曲线的形状与标准的反S型相差较大，变得不规则，因而不能进行定量检测。综上所述，本研究确定的CODCr边界条件为0-200mg/L。
六、消除水中叶绿素给免疫检测带来的影响
采用竞争ELISA方法检测待测水样中的微囊藻毒素-LR。实验只设抗体溶液2处理。除了待测水样外，实验方法和实验材料同步骤一。
(一)待测水样的配制：
1.用纯水配制0.3倍梯度稀释的叶绿素a(Fluka 44014，分离自Cyanobacteriasp.，纯度≥96.0％)溶液如下(mg/L)：1000、300、90、27、8.1、2.43、0.729、0。
2.MC-LR的贮备液浓度为100mg/L，采用步骤1的溶液配制不同叶绿素a浓度条件下的MC-LR标准溶液，作为待测水样：梯度如下(μg/L)：0，0.006，0.02，0.0656，0.22，0.729，2.43，8.1，27，90，300，1000。共96个待测水样。每个样品采用2个平行，测定不同叶绿素a浓度条件下MC-LR间接竞争ELISA标准曲线。
(二)结果分析
添加专用缓冲液1的叶绿素a对MC-LR免疫检测的影响结果如图19及图20所示，由图可知，采用本发明的专用缓冲液，叶绿素a对ELISA的影响不明显。即使叶绿素a浓度达到了1000mg/L时，标准曲线的形状仍然符合标准的反S型，并且各条标准曲线一致性良好。进一步分析A0和IC50值的变化趋势，结果表明，叶绿素a浓度达到了1000mg/L后，各标准曲线的最大吸光度和半抑制浓度都没有明显的变化。因此，本研究确定的叶绿素a的边界条件为0-1000mg/L。
七、消除水中有机溶剂给免疫检测带来的影响
采用竞争ELISA方法检测待测水样中的微囊藻毒素-LR。实验设两个处理：抗体溶液1和抗体溶液2处理。除了待测水样外，实验方法和实验材料同步骤一。
(一)待测水样的配制：
1.用纯水配制梯度浓度的甲醇(北京化学试剂公司)溶液如下(体积百分比)：50％、40％、30％、20％、15％、10％、5％、0。
2.MC-LR的贮备液浓度为100mg/L，分别用步骤1的溶液配制不同甲醇浓度条件下的MC-LR标准溶液，作为待测水样：梯度如下(μg/L)：0，0.006，0.02，0.0656，0.22，0.729，2.43，8.1，27，90，300，1000。共96个待测水样。每个甲醇浓度采用2个平行，测定不同甲醇浓度下MC-LR间接竞争ELISA标准曲线。
(二)结果分析
添加普通缓冲液的不同浓度的甲醇溶液条件下ELISA标准曲线如图21所示，各标准曲线的空白样品吸光度(最大吸光度，A0)及半抑制浓度IC50的比较如图22所示。由图可以看出，甲醇对于免疫反应的影响是明显的。随着甲醇浓度的提高，最大吸光度下降，IC50值降低，ELISA的灵敏度降低。当样品中甲醇的浓度超过40％(v/v)时，曲线发生明显地变形，ELISA被明显地干扰。研究表明，若不采取其它措施，样品中甲醇的允许浓度最高为15％。
有机溶剂主要来自于固体样品的提取过程，有机溶剂可能破坏抗原-抗体之间的范德华键和疏水作用力，使抗原-抗体复合物解离，可大大降低检测的灵敏度。
为了降低样品中甲醇带来的影响，采用本发明的专用缓冲液1来稀释抗体，实验结果如图23及24所示。结果表明，此时甲醇对免疫检测的影响明显地受到抑制。即使样品中的甲醇浓度为50％时，尽管最大吸光度略有上升，但IC50值没有明显变化，方法的灵敏度因而也没有很大变化。综合分析，甲醇的边界条件为体积百分比0-20％。
八、消除水中有毒有机污染物给免疫检测带来的影响
采用竞争ELISA方法检测待测水样中的微囊藻毒素-LR。实验只设抗体溶液2处理。除了待测水样外，实验方法和实验材料同步骤一。
(一)待测水样的配制：
1.用纯水配制0.3倍梯度稀释的甲苯(北京化学试剂公司)溶液如下(单位：mg/L)：500、150、45、13.5、4.05、1.215、0.36、0。
2.MC-LR的贮备液浓度为100mg/L，采用步骤1的溶液配制不同甲苯条件下的MC-LR标准溶液，作为待测水样：梯度如下(μg/L)：0，0.006，0.02，0.0656，0.22，0.729，2.43，8.1，27，90，300，1000。共96个待测水样。每个样品采用2个平行，测定不同甲苯浓度条件下MC-LR间接竞争ELISA标准曲线。
(二)结果分析
添加专用缓冲液1的甲苯对MC-LR免疫检测的影响结果如图25及26所示，尽管在抗体缓冲液中已经加入惰性蛋白即1％ BSA，但当甲苯浓度超过1mg/L时，免疫反应仍然受到明显的影响，即最大吸光度随着甲苯浓度的升高而降低；IC50值随着甲苯浓度的升高而升高，但幅度都不是很大，IC50值最高可达10μg/L。综上所述，本研究提出的甲苯边界条件为0-1mg/L。
九、消除水中农药给免疫检测带来的影响
采用竞争ELISA方法检测待测水样中的微囊藻毒素-LR。实验只设抗体溶液2处理。除了待测水样外，实验方法和实验材料同步骤一。
(一)待测水样的配制：
1.用纯水配制0.3倍梯度稀释的2，4-D(北京化学试剂公司)溶液如下(单位：mg/L)：2000、600、180、54、16.2、4.86、1.46、0。
2.MC-LR的贮备液浓度为100mg/L，采用步骤1的溶液配制不同2，4-D浓度条件下的MC-LR标准溶液，作为待测水样：梯度如下(μg/L)：0，0.006，0.02，0.0656，0.22，0.729，2.43，8.1，27，90，300，1000。共96个待测水样。每个样品采用2个平行，测定不同2，4-D浓度条件下MC-LR间接竞争ELISA标准曲线。
(二)结果分析
添加专用缓冲液1的不同2，4-D浓度对免疫检测的影响如图27及图28所示。可以看出，2，4-D的影响不是很明显，当2，4-D浓度超过100mg/L时，IC50值有缓慢增加的趋势，而最大吸光度没有明显的变化，研究得出2，4-D的边界条件为0-100mg/L。
本发明针对环境样品中各种基质条件所适合的边界如下：pH：3-10；硬度：0-112；腐殖酸：0-300mg/L；重金属离子：以CuSO4·5H2O作为研究对象，浓度范围0-1000mg/L；综合污染指标：以CODcr为指标，浓度范围0-200mg/L；叶绿素a：0-1000mg/L；有机溶剂：以甲醇为例，体积百分比范围0-20％；有毒有机污染物：以甲苯为例，边界为0-1mg/L；农药：以2，4-D为例浓度范围0-100mg/L。
实施例3、利用专用缓冲溶液2提高环境样品免疫检测抗基质效应
所用的专用缓冲液2是在0.05mol/L、pH为7.0的PBS(配置方法：KCl 1.0g；KH2PO4 1.4g；Na2HPO4·12H2O 13g；双蒸水加至1000mL)中，加入下述a)、b)和c)的物质：a)NaCl，使其终浓度为10g/L；a)牛血清白蛋白，使其终浓度为2g/L；c)乙二胺四乙酸二钠，使其终浓度为2g/L。
采用竞争ELISA方法检测待测水样中的微囊藻毒素-LR。除了专用缓冲溶液替换为专用缓冲溶液2外，实验方法和实验材料同实施例2的步骤一、二和三。
一、消除水中酸碱度给免疫检测带来的影响
添加普通缓冲液的实验结果同实施例2的步骤一。
添加专用缓冲溶液2的实验结果如图29所示，结果表明该方法是有效的。各标准曲线一致性良好，最大吸光度A0和IC50值都没有明显变化，说明pH值的影响已经消除。结果表明，采用专用缓冲液2作为抗体稀释液，能消除样品中的酸或碱(pH＝4-10)带来的干扰。
二、消除水中硬度给免疫检测带来的影响
添加普通缓冲液的实验结果同实施例2的步骤二。
添加专用缓冲溶液2的实验结果如图30所示。结果表明，此时硬度对免疫检测的影响明显地被消除。当硬度为112时，各标准曲线的一致性良好，最大吸光度和半抑制浓度都没有明显的变化。
三、消除水中腐殖质酸给免疫检测带来的影响
添加普通缓冲液的实验结果同实施例2的步骤二。
添加专用缓冲溶液2的实验结果如图31所示。结果表明，BSA能有效地抑制腐殖酸带来的影响。但当腐殖酸浓度为300mg/L时，IC50有较大变化
实施例4、利用专用缓冲溶液3提高环境样品免疫检测抗基质效应
所用的专用缓冲液3是在0.12mol/L、pH为8.0的PBS(配置方法：KCl 2.4g；KH2PO4 2.5g；Na2HPO4·12H2O 38g；双蒸水加至1000mL。)中，加入下述a)、b)和c)的物质：a)NaCl，使其终浓度为100g/L；a)牛血清白蛋白，使其终浓度为20g/L；c)乙二胺四乙酸二钠，使其终浓度为20g/L。
采用竞争ELISA方法检测待测水样中的微囊藻毒素-LR。除了专用缓冲溶液替换为专用缓冲溶液2外，实验方法和实验材料同实施例2的步骤一、二和三。
一、消除水中酸碱度给免疫检测带来的影响
添加普通缓冲液的实验结果同实施例2的步骤一。
添加专用缓冲溶液2的实验结果如图32所示，结果表明，该方法是有效的。各标准曲线一致性良好，最大吸光度A0和IC50值都没有明显变化，说明pH值的影响已经消除。结果表明，采用专用缓冲液2作为抗体稀释液，能消除样品中的酸或碱(pH＝4-9)带来的干扰。
二、消除水中硬度给免疫检测带来的影响
添加普通缓冲液的实验结果同实施例2的步骤二。
添加专用缓冲溶液2的实验结果如图33所示。结果表明，此时硬度对免疫检测的影响明显地被消除。当水中的硬度为112时，各标准曲线的一致性良好，最大吸光度和半抑制浓度都没有明显的变化。
三、消除水中腐殖质酸给免疫检测带来的影响
添加普通缓冲液的实验结果同实施例2的步骤二。
添加专用缓冲溶液2的实验结果如图34所示。结果表明，BSA能有效地抑制腐殖酸带来的影响。即使当腐殖酸浓度为1000mg/L时，IC50变化很小。
Claims (9)
1、一种缓冲溶液，是在浓度为0.05-0.12mol/L、pH为7.0-8.0的磷酸盐缓冲液中，加入下述a)、b)和c)的物质：
a)NaCl，使其终浓度为10-100g/L；
b)惰性蛋白或明胶，使其终浓度为2-20g/L；所述惰性蛋白是不与免疫反应体系发生反应的蛋白；
c)乙二胺四乙酸二钠，使其终浓度为2-20g/L。
2、根据权利要求1所述的缓冲溶液，其特征在于：所述磷酸盐缓冲液包括KH2PO4、Na2HPO4·12H2O和KCl。
3、根据权利要求1所述的缓冲溶液，其特征在于：所述NaCl的浓度为50g/L。
4、根据权利要求1所述的缓冲溶液，其特征在于：所述惰性蛋白或明胶的浓度为10g/L。
5、根据权利要求1所述的缓冲溶液，其特征在于：所述乙二胺四乙酸二钠的浓度为5g/L。
6、根据权利要求1所述的缓冲溶液，其特征在于：所述惰性蛋白为牛血清白蛋白、鸡蛋白蛋白或兔血清白蛋白。
7、权利要求1至6中任一权利要求所述的缓冲溶液在环境样品免疫检测中的应用。
8、一种提高环境样品免疫检测抗基质效应的方法，是在环境样品免疫检测中，将权利要求1至6中任一权利要求所述的缓冲溶液作为缓冲体系，进行环境样品的免疫检测。
9、根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述基质效应由环境样品的酸碱度和/或水中硬度和/或腐殖质酸和/或重金属和/或有毒有机污染物和/或农药和/或叶绿素引起。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNB2007101192102A CN100465642C (zh) | 2007-07-18 | 2007-07-18 | 提高环境样品免疫检测抗基质效应的方法及其专用缓冲溶液 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNB2007101192102A CN100465642C (zh) | 2007-07-18 | 2007-07-18 | 提高环境样品免疫检测抗基质效应的方法及其专用缓冲溶液 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101093223A CN101093223A (zh) | 2007-12-26 |
| CN100465642C true CN100465642C (zh) | 2009-03-04 |
Family
ID=38991586
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CNB2007101192102A Active CN100465642C (zh) | 2007-07-18 | 2007-07-18 | 提高环境样品免疫检测抗基质效应的方法及其专用缓冲溶液 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN100465642C (zh) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103352028A (zh) * | 2013-06-03 | 2013-10-16 | 云南省环境监测中心站 | 杂交瘤细胞株ynemc3及其产生的单克隆抗体和应用 |
| CN110981963B (zh) * | 2019-09-23 | 2021-09-03 | 山东绿都生物科技有限公司 | 一种用于替代抗鼠兔二抗的单克隆抗体的制备方法 |
| CN113533712B (zh) * | 2021-07-21 | 2023-06-02 | 中国海洋大学 | 用于消除蔬菜酶联免疫检测基质效应的简便快速前处理方法 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4919889A (en) * | 1988-09-15 | 1990-04-24 | Aspen Diagnostics Corporation | Sample collection and transport fluid composition |
| US6534279B1 (en) * | 1998-07-09 | 2003-03-18 | Immunotech | Reagent and method for the permeabilization and identification of erythrocytes |
| CN1449821A (zh) * | 2003-05-16 | 2003-10-22 | 长春长生基因药业股份有限公司 | 稳定的重组人α干扰素液体制剂及生产工艺 |
| CN1715920A (zh) * | 2004-06-30 | 2006-01-04 | 中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所 | 血清或血浆样品稀释液及其应用 |
| CN1740793A (zh) * | 2004-08-25 | 2006-03-01 | 北京健平九星生物医药科技有限公司 | 一种酶联检测试剂盒及制备方法 |
-
2007
- 2007-07-18 CN CNB2007101192102A patent/CN100465642C/zh active Active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4919889A (en) * | 1988-09-15 | 1990-04-24 | Aspen Diagnostics Corporation | Sample collection and transport fluid composition |
| US6534279B1 (en) * | 1998-07-09 | 2003-03-18 | Immunotech | Reagent and method for the permeabilization and identification of erythrocytes |
| CN1449821A (zh) * | 2003-05-16 | 2003-10-22 | 长春长生基因药业股份有限公司 | 稳定的重组人α干扰素液体制剂及生产工艺 |
| CN1715920A (zh) * | 2004-06-30 | 2006-01-04 | 中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所 | 血清或血浆样品稀释液及其应用 |
| CN1740793A (zh) * | 2004-08-25 | 2006-03-01 | 北京健平九星生物医药科技有限公司 | 一种酶联检测试剂盒及制备方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN101093223A (zh) | 2007-12-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN100567324C (zh) | 一种微囊藻毒素单克隆抗体及其制备方法与应用 | |
| CN102128920B (zh) | 一种快速检测重金属铅离子的免疫学方法与试剂盒 | |
| CN102675463B (zh) | 一种多菌灵单克隆抗体及其制备方法与应用 | |
| CN102680676B (zh) | 髓过氧化物酶(myeloperoxidase MPO)测定试剂盒(胶乳增强免疫比浊法) | |
| CN108776219B (zh) | 一种快速检测细交链格孢酮酸的免疫层析试纸条 | |
| CN100465644C (zh) | 微囊藻毒素酶联免疫检测试剂盒 | |
| Zhang et al. | Extract-free immunochromatographic assay for on-site tests of aflatoxin M1 in milk | |
| CN101139398A (zh) | 重金属汞单克隆抗体的制备方法 | |
| CN102426239A (zh) | 一种快速检测铅离子的胶体金层析试纸条 | |
| CN100465642C (zh) | 提高环境样品免疫检测抗基质效应的方法及其专用缓冲溶液 | |
| CN104849251A (zh) | 一种快速检测地沟油的时间分辨荧光免疫方法及试剂盒 | |
| CN106282126A (zh) | 一株抗重金属镉的单克隆抗体杂交瘤细胞株yh2及其应用 | |
| CN100465645C (zh) | 一种微囊藻毒素酶联免疫检测试剂盒 | |
| CN102478578A (zh) | 一种检测玉米赤霉烯酮的化学发光试剂盒及其制备方法 | |
| CN102080067A (zh) | 一种检测呕吐毒素的方法及其专用试剂盒 | |
| CN105087498B (zh) | 一株苯噻氰单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用 | |
| CN111912986B (zh) | 一种广谱型微囊藻毒素酶联免疫检测试剂盒 | |
| CN102020714A (zh) | 一种联合检测相思子毒素和蓖麻毒素的胶体金试纸及专用单克隆抗体 | |
| CN102879571A (zh) | 一种快速检测铜离子的胶体金增敏层析试纸条 | |
| CN104764880A (zh) | 一种甲拌磷残留的酶联免疫检测方法 | |
| CN101921730B (zh) | 一种莱克多巴胺的单克隆抗体、其制备方法及应用 | |
| CN103472228B (zh) | 孔雀石绿残留一步式化学发光酶免疫分析检测法及试剂盒 | |
| CN101806796A (zh) | 呋喃唑酮代谢物检测试剂盒及检测方法 | |
| CN101995460A (zh) | 莱克多巴胺残留的时间分辨免疫分析检测试剂盒及其检测方法 | |
| CN101955537B (zh) | 一种莱克多巴胺抗体及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |