CN102080067A - 一种检测呕吐毒素的方法及其专用试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测呕吐毒素的方法及其专用试剂盒。本发明提供了保藏编号为CGMCC No.3396的杂交瘤细胞株8C-2H-3A-6F-2B。本发明还提供了一种单克隆抗体，是由保藏编号为CGMCC No.3396的杂交瘤细胞株8C-2H-3A-6F-2B分泌产生的。本发明提供的试剂盒包括所述单克隆抗体。本发明中将呕吐毒素进行结构改造，加入间隔臂，突出呕吐毒素特征基团，并合成了人工抗原。用所述人工抗原免疫动物，获取到了一个杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株分泌得到的单克隆抗体特异性很高。本发明的试剂盒，操作简便易行，造价低廉，具有特异性高、灵敏度高、精确度高等特点，能够现场监控且适合大量样本筛查，将在呕吐毒素的检测中发挥重要作用。

Description

一种检测呕吐毒素的方法及其专用试剂盒

技术领域

本发明涉及一种检测呕吐毒素的方法及其专用试剂盒。

背景技术

呕吐毒素化学名称为脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol，DON)其化学结构如式(II)所示：

式(II)。

呕吐毒素属于单端孢霉烯族化合物，主要由禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)和黄色镰刀菌(Fusarium culmorum.)产生，因其能引起动物呕吐，故又称呕吐毒素(Vomitoxin)。单端孢霉烯族毒素共有150多种，是一类强有力的免疫抑制剂，所引起的典型症状是采食量降低，所以这类毒素又叫饲料拒食毒素。DON是其中最重要的一种毒素。

呕吐毒素多分布于小麦、大麦、玉米等谷物籽实中，具有很强的细胞毒性，对原核细胞、真核细胞、植物细胞、肿瘤细胞等均具有明显的毒性作用。另外，呕吐毒素还可以作用于骨髓造血干细胞引起细胞毒性作用。因此，该毒素对人和动物的健康都带来了很大的危险。

目前测定呕吐毒素的主要方法有薄层层析法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)。随着人们对食品质量和健康水平要求的提高，发展并推广简便、快速、灵敏、适用于样品实地检测的方法势在必行。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测呕吐毒素的方法及其专用试剂盒。

本发明提供了分泌呕吐毒素单抗的杂交瘤细胞株，即为保藏编号为CGMCCNo.3396的呕吐毒素单克隆抗体杂交瘤细胞株(8C-2H-3A-6F-2B)。该细胞株已于2009年11月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.3396。

本发明还保护一种单克隆抗体，是由保藏编号为CGMCC No.3396的呕吐毒素单克隆抗体杂交瘤细胞株(8C-2H-3A-6F-2B)分泌产生的。

本发明同时保护一种检测呕吐毒素的酶联免疫试剂盒，包括所述单克隆抗体。

所述试剂盒可为如下1)至4)中的任意一种：

1)所述试剂盒包括包被有包被原的酶标板、一抗和酶标二抗；所述包被原为式(I)所示的化合物和载体蛋白偶联得到的偶联物；所述一抗为所述单克隆抗体；

2)所述试剂盒包括包被有包被原的酶标板和酶标半抗原；所述包被原为所述单克隆抗体；所述酶标半抗原中的半抗原为式(I)所示的化合物；

3)所述试剂盒包括包被有包被原的酶标板和酶标一抗；所述包被原为式(I)所示的化合物和载体蛋白偶联得到的偶联物；所述酶标一抗中的一抗为所述单克隆抗体；

4)所述试剂盒包括包被有包被原的酶标板、一抗和酶标半抗原；所述包被原为二抗；所述一抗为所述单克隆抗体；所述酶标半抗原中的半抗原为式(I)所示的化合物；

式(I)。

1)所述的试剂盒的检测原理为：当在微孔条上预包被呕吐毒素抗原(DON-琥珀酸酐-载体蛋白)时，加入样本溶液或标准品溶液后，再加入呕吐毒素特异性抗体溶液，样本中残留的呕吐毒素或呕吐毒素标准品与酶标板上包被的呕吐毒素抗原竞争呕吐毒素特异性抗体，加入酶标记的二抗进行放大作用，用显色液显色，样本吸光值与样本中呕吐毒素的含量成负相关，与标准曲线比较即可得出样本中呕吐毒素的含量。

2)所述的试剂盒的检测原理为：当在微孔条上预包被呕吐毒素特异性抗体时，加入样本溶液或标准品溶液后，再加入酶标记的呕吐毒素半抗原(DON-琥珀酸酐)溶液，样本中残留的呕吐毒素或呕吐毒素标准品与呕吐毒素半抗原竞争包被在酶标板上的呕吐毒素特异性抗体，用显色液显色，样本吸光值与呕吐毒素的含量成负相关，与标准曲线比较即可得出样本中呕吐毒素的含量。

3)所述的试剂盒的检测原理为：当在微孔条上预包被呕吐毒素抗原(DON-琥珀酸酐-载体蛋白)时，加入样本溶液或标准品溶液后，再加入酶标记的呕吐毒素特异性抗体溶液，样本中的呕吐毒素或呕吐毒素标准品与酶标板上包被的呕吐毒素抗原竞争呕吐毒素特异性抗体，用显色液显色，样本吸光值与样本中呕吐毒素的含量成负相关，与标准曲线比较即可得出样本中呕吐毒素的含量。

4)所述的试剂盒的检测原理为：当在微孔条上预包被二抗时，加入呕吐毒素特异性抗体孵育后，加入样本溶液或标准品溶液，再加入酶标记的呕吐毒素半抗原(DON-琥珀酸酐)溶液，样本中的呕吐毒素或呕吐毒素标准品与呕吐毒素半抗原竞争呕吐毒素特异性抗体，用显色液显色，样本吸光度值与样本中呕吐毒素的含量成负相关，与标准曲线比较即可得出样本中呕吐毒素的含量。

所述的载体蛋白可为牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、鼠血清蛋白(MSA)、甲状腺蛋白(BCG)、兔血清白蛋白(RSA)、血蓝蛋白(KLH)或卵清白蛋白(OVA)，其中优选BSA、KLH。

所述二抗可为羊抗鼠二抗或羊抗兔二抗。

所述试剂盒还可包括呕吐毒素标准品溶液、底物显色液、终止液、浓缩洗涤液、样品浓缩液等组分。

所述呕吐毒素标准品溶液，可以是一定浓度范围内的多种浓度的标准溶液，其浓度可以在0-5000μg/L之间。

所述浓缩洗涤液可采用任何本领域常用的浓缩洗涤液，优选为磷酸盐缓冲液，例如含有吐温和叠氮钠的磷酸盐缓冲液。所述浓缩洗涤液具体可为：将0.8-1.2mL吐温20和0.5g叠氮钠加入100mL pH7.4 0.01M磷酸盐缓冲液得到的溶液。

所述样品浓缩液即为试剂盒应用中的样品稀释液的母液，样品浓缩液稀释后(如稀释至20倍体积)即为样品稀释液。所述样品稀释液优选为磷酸盐缓冲液，例如0.04mol/L pH7.2-7.5的磷酸盐缓冲液，还可以是本领域常用的其它样品稀释液。所述样品浓缩液具体可为0.8mol/L(20×0.04mol/L)pH7.2-7.5的磷酸盐缓冲液。

所述酶标记复合物(酶标记的呕吐毒素半抗原、酶标记的呕吐毒素特异性抗体、酶标记的二抗)的标记酶可为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶，其中优选辣根过氧化物酶。可采用现有技术中的多种方法将辣根过氧化物酶与二抗进行偶联，如戊二醛法，过碘酸钠法等。具体可采用如下方法将二抗与辣根过氧化物酶(HRP)进行偶联：①将辣根过氧化物酶溶解于蒸馏水中；②加入NaIO₄溶液，室温搅拌反应；③用醋酸盐缓冲液于4℃透析过夜，除去多余的NaIO₄，同时使自身偶联的酶还原；④加入磷酸盐缓冲液和含有IgG(羊抗鼠二抗)的磷酸盐缓冲液，室温搅拌反应；⑤加入NaBH₄水溶液，在4℃反应4h，以还原Schiff碱；⑥纯化保存。该改良的过碘酸钠法省时、降低了辣根过氧化物酶(HRP)与二抗的浓度比率，节省了原材料。当标记酶为辣根过氧化物酶时：底物显色液由显色液A液和显色液B液组成；显色液A液优选为过氧化氢或过氧化脲溶液；显色液B液优选为邻苯二胺或四甲基联苯胺溶液；终止液为硫酸或盐酸溶液，优选为硫酸溶液，其浓度例如为1～2mol/L。当标记酶为碱性磷酸酯酶时：显色液优选为对硝基苯磷酸酯缓冲液；终止液优选为氢氧化钠溶液，其浓度例如为1～2mol/L，更特别的例如为2mol/L。显色液和终止液也可以是本领域常用的其它显色液和终止液。

可采用如下方法用包被原包被酶标板：用包被缓冲液将包被原稀释，并加入各孔中，37℃左右温育(或4℃左右过夜)，倾去包被缓冲液，用洗涤液洗涤，拍干，然后在每孔中加入封闭液，温育，倾去孔内液体拍干，干燥后用铝膜真空密封保存。例如，用包被缓冲液将包被原稀释为0.5-5.0μg/mL，每孔加入100μL，37℃温育2h，倾去包被缓冲液，用洗涤液洗涤2次，每次30s，拍干，然后在每孔中加入150-200μL封闭液，37℃温育1-2h，倾去孔内液体，拍干，干燥后用铝膜真空密封保存。

以上包被酶标板的方法中：所用的包被缓冲液优选为碳酸盐缓冲液，例如pH9.6、0.01-0.1mol/L的碳酸钠缓冲液。所用的封闭液优选为磷酸盐缓冲液，例如如下溶液：将0.5mL马血清、0.1g叠氮化钠和3g酪蛋白加入100mL 0.02M pH7.2磷酸盐缓冲液中得到的溶液；包被缓冲液和封闭液也可以是本领域常用的其它包被缓冲液和封闭液。

本发明还保护一种检测样品中呕吐毒素的方法，包括如下步骤：

1)将待测样品进行前处理，得到待测样本溶液；

2)用以上任一所述试剂盒对所述待测样本溶液进行检测；

所述前处理的方法为下述a)、b)、c)中的任意一种：

a)所述待测样品为谷物或饲料；取待测样品溶于10％(体积百分含量)甲醇水溶液中，超声波振荡，过滤并收集滤液，即为待测样本溶液；

b)所述待测样品为啤酒；将待测样本搅拌，除去过量气体，静置得到上清液，即为待测样本溶液；

c)所述待测样品为麦芽汁；直接作为待测样本溶液。

呕吐毒素是只有免疫反应性，没有免疫原性，不能诱发机体产生免疫应答，必须与大分子载体蛋白偶联后才具有免疫原性。本发明中将呕吐毒素进行结构改造，加入间隔臂，突出呕吐毒素特征基团，并通过活性酯法合成了人工抗原。用所述人工抗原免疫动物，获取到了一个杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株分泌得到的单克隆抗体特异性很高。本发明还提供了基于不同ELISA原理的四种试剂盒，可以定性或定量检测谷物、饲料、啤酒和麦芽汁中呕吐毒素的含量，样品前处理过程简单，能同时检测大批样品。本发明的试剂盒，操作简便易行，造价低廉，具有特异性高、灵敏度高、精确度高等特点，能够现场监控且适合大量样本筛查，将在呕吐毒素的检测中发挥重要作用。

附图说明

图1为呕吐毒素的检测标准曲线图。

图2为呕吐毒素抗原(DON-琥珀酸酐-BSA)的紫外吸收光谱图。

图3为呕吐毒素抗原(DON-琥珀酸酐-OVA)的紫外吸收光谱图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

DON标准样品购自Sigma Aldrich公司，CAS-No.51481-10-8.；1-丁基硼酸：购自北京恒业中远化工有限公司，产品编号：65946；Balb/c小鼠：北京实验动物研究中心；SP2/0骨髓瘤细胞：上海玉博生物科技有限公司；新西兰大白兔：购自北京实验动物研究中心。

实施例1、试剂盒组分的制备

产率＝转化为产物所消耗掉的主反应物量/主反应物消耗总量×100％。

一、抗原的制备

1、半抗原(DON-琥珀酸酐)的制备

将呕吐毒素溶于吡啶中，加入1-丁基硼酸先将DON分子结构中7和15位上的两个羟基先封闭起来，再将3位上的羟基与琥珀酸酐反应，从而在DON分子上构建一个含有羧基的间隔臂，得到呕吐毒素半抗原。具体步骤如下：称取呕吐毒素(DON)标准样品2mg，溶于200uL吡啶中，加入20.8mg 1-丁基硼酸，混合物在室温下搅拌20h，然后在搅拌的情况下加入1.7mol/L琥珀酸酐吡啶溶液400uL，反应管密闭，混合物在沸水浴中搅拌反应3h，然后将溶剂吡啶在100℃用氮气吹干。用5mL乙酸乙酯萃取三次，减压浓缩得到式I所示化合物(半抗原)。

式(I)。

2、抗原(DON-琥珀酸酐-载体蛋白)的制备

呕吐毒素半抗原与N，N’-二环己基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺混合，在温度为20℃-30℃的条件下，反应12-18h后，加入载体蛋白后，在温度为4℃-25℃的条件下，反应12-20h，得到的抗原。

(1)DON-琥珀酸酐-BSA的制备

称取3mg N，N’-二环己基碳二亚胺(DCC)、1.5mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和式I所示化合物共溶于1mL N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，搅拌混匀，在温度为25℃的条件下，反应12小时，得到溶液I；称取牛血清白蛋白(BSA)20mg溶解于3mL碳酸溶液中，在磁力搅拌下，逐滴加入到溶液I中，4℃继续搅拌12h(载体蛋白与式I所示化合物的摩尔数比为8∶1)；待反应完毕，将反应液装入透析袋，在4℃用0.01M PBS溶液透析72h，换水6次，得到DON-琥珀酸酐-BSA；分装于安培瓶中，-20℃保存。

抗原的产率为56.3％。

(2)DON-琥珀酸酐-OVA的制备

制备方法同步骤(1)，用卵清白蛋白(OVA)代替BSA。

用其它载体蛋白与DON-琥珀酸酐偶联，同样可以制备得到抗原，在制备过程中，用其它载体蛋白代替BSA即可。

(3)抗原(DON-琥珀酸酐-载体蛋白)的鉴定

呕吐毒素半抗原、BSA和两种结合物，三者分别配制成一定浓度的溶液，然后用紫外分光光度计进行全波长扫描，得到它们的紫外吸收光谱图。图2为呕吐毒素抗原(DON-琥珀酸酐-BSA)的紫外吸收光谱图。图3为呕吐毒素抗原(DON-琥珀酸酐-OVA)的紫外吸收光谱图。

根据公式K＝A/CL分别计算出MAD、BSA、OVA的摩尔消光系数。在载体蛋白和呕吐毒素的最大波长处检测偶联物的光吸收值，按公式计算两种物质在偶联物中的摩尔浓度比，即偶联比。将偶联物稀释到适当倍数后，测定280nm和260nm的分光光度值，按公式计算蛋白的浓度即偶联物的浓度：

蛋白质(mg/ml)＝1.45×OD280-0.74×OD260。

经测定：呕吐毒素半抗原与BSA的偶联比为1∶13，偶联物的浓度为5.2mg/ml。

呕吐毒素半抗原与OVA的偶联比为1∶11，偶联物的浓度为4.5mg/ml。

二、特异性抗体的制备

(一)单克隆抗体的制备

1、动物免疫

将步骤一制备的DON-琥珀酸酐-BSA作为免疫原注入到Balb/c小鼠体内，免疫剂量为75μg/只，使其产生多克隆抗体。

2、细胞融合和克隆化

取步骤1的小鼠的脾细胞，按5∶1比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到稳定分泌单克隆抗体的呕吐毒素单克隆抗体杂交瘤细胞株(8C-2H-3A-6F-2B)，该细胞株已于2009年11月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.3396。

3、细胞冻存和复苏

将杂交瘤细胞株8C-2H-3A-6F-2B用冻存液制成1×10⁶个/mL的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。

4、单克隆抗体的制备与纯化

(1)增量培养法：将杂交瘤细胞株8C-2H-3A-6F-2B置于细胞培养基中，在37℃条件下进行培养，用辛酸-饱和硫酸铵法将得到的培养液进行纯化，得到单克隆抗体，-20℃保存。所述细胞培养基是将20mL小牛血清和0.2g碳酸氢钠加入100mLRPMI-1640培养基中得到的；所述细胞培养基的pH为7.4。

抗体效价的测定：通过棋盘法测定抗体的效价为4.9×10⁶，其中包被抗原为DON-琥珀酸酐-OVA。

(2)上述单克隆抗体还可以采取以下方法制备：将Balb/c小鼠腹腔注入灭菌石蜡油0.4mL/只，7天后腹腔注射杂交瘤细胞株3E-5H-2A-6B-8F(5×10⁵个/只)，7天后采集腹水。用辛酸-饱和硫酸铵法进行纯化，纯化后的腹水-20℃保存。

当抗原为其他载体蛋白与DON-琥珀酸酐的偶联物时，单克隆抗体的制备方法同上。

(二)多克隆抗体的制备

采用新西兰大白兔作为免疫动物，采用步骤一制备的DON-琥珀酸酐-BSA作为免疫原，免疫剂量为1.5mg/kg；首免时将免疫原与等量的弗氏完全佐剂混合制成乳化剂，颈背部皮下多点注射，间隔3～4周取相同剂量免疫原加等量弗氏不完全佐剂混合乳化，加强免疫一次，共免疫5次，最后一次不加佐剂；最后一次免疫10天后采血，测定血清抗体效价，心脏采血，用硫酸铵分级沉淀得到纯化的多克隆抗体。

当抗原为其他载体蛋白与DON-琥珀酸酐的偶联物时，多克隆抗体的制备方法同上。

三、二抗的制备

以山羊作为免疫动物，以步骤二的(一)的4的(1)制备的单克隆抗体为免疫原对无病原体山羊进行免疫，得到羊抗鼠二抗。以山羊作为免疫动物，以步骤二的(二)制备的多克隆抗体为免疫原对无病原体山羊进行免疫，得到羊抗兔二抗。

用其它动物制备二抗时，用特异性抗体(单克隆抗体或多克隆抗体)免疫动物即可。

四、酶标复合物的制备

1、酶标记羊抗鼠二抗的制备

采用改良的碘酸钠法将步骤三制备的羊抗鼠二抗与辣根过氧化物酶(HRP)进行偶联，具体方法如下：

①将8mg辣根过氧化物酶溶解于2mL蒸馏水中。

②加入现配制的100mmol/L NaIO₄溶液0.4mL，室温搅拌反应20min。

③用1mmol/L醋酸盐缓冲液于4℃透析过夜，除去多余的NaIO₄，同时使自身偶联的酶还原。

④加入磷酸盐缓冲液(pH8.6、0.5mol/L)40μL和含有IgG(羊抗鼠二抗)16mg的磷酸盐缓冲液(pH 8.6、5mol/L)2.0mL，室温搅拌反应4h。

⑤加入现配制的NaBH₄水溶液(1mol/L)0.1mL，在4℃反应4h，以还原Schiff碱。

⑥纯化保存。

改良的碘酸钠法省时，且降低辣根过氧化物酶(HRP)与二抗的浓度比率，节省了原材料。

用其它二抗制备酶标二抗的方法参见酶标羊抗鼠二抗的制备方法。

五、酶标板的包被

包被缓冲液为pH9.6、0.01～0.1mol/L的碳酸钠缓冲液；封闭液为将0.5mL马血清、0.1g叠氮化钠和3g酪蛋白加入100mL pH7.2 0.02M磷酸盐缓冲液中得到的溶液。

用包被缓冲液将步骤一制备的DON-琥珀酸酐-OVA稀释成0.5-10.0μg/mL，每孔加入100μL，37℃温育2h(或4℃过夜)，倾去包被缓冲液，用样品稀释液(将样品浓缩液20倍稀释)洗涤2次，每次30s，拍干，然后在每孔中加入200μL封闭液，37℃温育2h，倾去孔内液体，拍干，干燥后用铝膜真空密封保存。即为包被有包被原(DON-琥珀酸酐-OVA)的酶标板。

包被有其它包被原的酶标板的制备方法同上，用其它包被原(如其他载体蛋白与DON-琥珀酸酐的偶联物、步骤二制备的特异性抗体或步骤三制备的二抗)代替DON-琥珀酸酐-OVA即可。

实施例2、检测呕吐毒素的酶联免疫试剂盒的制备、应用和性能鉴定

一、试剂盒的组成

1、呕吐毒素标准品溶液

呕吐毒素标准品溶液6瓶，浓度分别为0μg/L、0.5μg/L、2μg/L、8μg/L、32μg/L和128μg/L。

2、底物显色液

底物显色液由A液和B液组成，底物显色液A液为2％过氧化脲溶液，底物显色液B液为1％四甲基联苯胺溶液(TMB)。

3、终止液

终止液为2mol/L硫酸。

4、浓缩洗涤液

浓缩洗涤液为将1.0mL吐温20和0.5g叠氮钠加入100mL pH7.4 0.01M磷酸盐缓冲液得到的溶液。

5、样品浓缩液

样品浓缩液为0.8mol/L(20×0.04mol/L)pH7.3的磷酸盐缓冲液。

6、包被有包被原的酶标板

实施例1制备的包被有DON-琥珀酸酐-OVA的酶标板。

7、酶标二抗

实施例1制备的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗。

8、一抗

实施例1的步骤二的(一)的4的(1)制备的单克隆抗体。

二、应用试剂盒进行检测的方法

1、样品前处理

(1)谷物和饲料

准确称取5g粉碎均匀的样品于三角瓶中，加入25ml 10％(体积百分含量)甲醇水溶液，超声波振荡5min。以定性滤纸快速过滤，取1毫升滤液加入3毫升的样品稀释液(将样品浓缩液20倍稀释)，充分混匀，取50微升用于检测。

(2)啤酒、麦芽汁

取一定量的啤酒样品，搅拌，除去过量的气体，静置后进行检测；

麦芽汁样品直接进行检测。

2、用试剂盒对样品进行检测

向包被有包被原的酶标板微孔中加入呕吐毒素标准品溶液或样本溶液50μL，再加入一抗50μL，用盖板膜封板，37℃恒温箱中反应30min，倒出孔中液体，每孔加入250μL浓缩洗涤液，30s后倒出孔中液体，如此重复操作共洗板5次，用吸水纸拍干。加入酶标二抗100μL，37℃恒温箱中反应30min，倒出孔中液体，重复洗涤步骤，每孔加入底物显色液A液，底物显色液B液，轻轻振荡混匀，37℃恒温箱避光显色15min，每孔加入2mol/L终止液50μL，轻轻振荡混匀，用酶标仪，测定每孔吸光度值。

3、检测结果分析

用得的每个浓度的标准品溶液的吸光度平均值(B)除以第一个标准品溶液(0标准)的吸光度值(B₀)再乘以100％，得到百分吸光度值(百分吸光度值(％)＝(B/B₀)×100％)。以呕吐毒素标准品浓度(μg/L)为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线图(见图1)。用同样的办法计算样品溶液的百分吸光度值，相对应每一个样品的浓度，则可从标准曲线上读出样本中呕吐毒素的含量。

检测结果的分析也可以采用回归方程法，计算出样品溶液浓度。检测结果的分析还可以利用计算机专业软件，此法更便于大量样品的快速分析，整个检测过程只需较短时间，1.5h内即可以完成。

三、试剂盒的性能鉴定

1、标准品精密度试验

分别从三个不同的时间段制备的酶标板中各抽出一批酶标板，每批各抽取10个试剂盒，每板各抽出20个微孔，测定20μg/L标准品溶液的吸光度值，计算变异系数，结果见表1。变异系数的计算方法：变异系数(CV)＝测定结果的标准差与其平均值的百分比。

表1标准品精密度试验结果(CV％)

通过上述试验结果可以得出，每批试剂盒各测定10次标准品变异系数在5.8％-14.7％之间，符合精密度小于或等于20％的规定。

2、样本精密度和准确度试验

a.样品精密度试验：

向不含呕吐毒素的样品(小麦或啤酒)中添加呕吐毒素标准品，使呕吐毒素在小麦中的浓度为20μg/kg，在啤酒中的浓度为5.0μg/kg；每个样品设置5个重复。分别取三个不同批次的试剂盒各三个，分别计算变异系数。试验结果分别见表2和表3。

板内变异系数的计算方法：板内变异系数＝同一次测定的同一块板内某样本(一般为中等水平)重复测定次数所得结果的变异系数。

批内变异系数的计算方法：批内变异系数＝同一次测定中各平行样本的变异系数。

批间变异系数的计算方法：批间变异系数＝同一样本在不同批次测定结果的变异系数，取其平均值。

表2小麦的精密度试验结果(呕吐毒素的添加浓度20μg/kg)

表3啤酒样品精密度试验(呕吐毒素的添加浓度5.0μg/kg)

结果表明，本试剂盒对以上5种添加样品，板内变异系数小于10％，批内变异系数小于15％，批间变异系数小于20％，满足试剂盒精密度的规定。

b.样本回收率试验

向不含呕吐毒素的样品(小麦或啤酒)中添加呕吐毒素标准品，得到如下四种样品：呕吐毒素在小麦中的浓度为20μg/kg；呕吐毒素在小麦中的浓度为40μg/kg；呕吐毒素在啤酒中的浓度为5.0μg/kg；呕吐毒素在啤酒中的浓度为10.0μg/kg；每个样品设置5个重复。分别取三个不同批次的试剂盒各三个，分别计算回收率。试验结果分别见表4。回收率＝实测值/添加值。

表4试剂盒的样本回收率测定

从表中可看出，小麦样品的添加回收率在83.3％-104.9％之间；啤酒样品的添加回收率为87.0％-102.8％，符合准确度的测定标准。

3、交叉反应率试验

选择与呕吐毒素类似结构的化合物，测定交叉反应率。通过各种标准曲线分别得到其50％抑制浓度。用下式计算试剂盒对其它类似物的交叉反应率。

结果见表5。

表5试剂盒的特异性

名称	购买途径	交叉反应率(％)
			呕吐毒素	Sigma Aldrich公司产品目录号：32943.	100.0
3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇	Sigma Aldrich公司CAS号：50722-38-8	＞100.0
			15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇	Sigma Aldrich公司CAS号：88337-96-6	15.0
雪腐镰刀菌烯醇	北京锐鑫农科贸有限公司	3.0
			镰刀菌烯酮X	Sigma Aldrich公司CAS号：23255-69-8	＜1.0
T-2毒素	Sigma Aldrich公司产品目录号：33947	＜1.0

4、试剂盒的保存期

试剂盒保存条件为2-8℃，经过12个月的测定，试剂盒的最大吸光度值(零标准)、50％抑制浓度、呕吐毒素添加实际测定值均在正常范围之内。考虑到运输和使用过程中，会有非正常保存条件出现，将试剂盒在37℃保存的条件下放置8天，进行加速老化实验，结果表明该试剂盒的各项指标完全符合要求。考虑到试剂盒冷冻情况发生，将试剂盒放入-20℃冰箱冷冻8天，测定结果也表明试剂盒各项指标完全正常。从以上结果可得出试剂盒可以在2-8℃至少可以保存12个月以上。

5、试剂盒的最低检测限

本试剂盒对小麦等谷物样品的最低检测限为15ppb，对啤酒样品的最低检测限为2.5ppb。

Claims (10)

1.保藏编号为CGMCC No.3396的呕吐毒素单克隆抗体杂交瘤细胞株。

2.一种单克隆抗体，是由保藏编号为CGMCC No.3396的呕吐毒素单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌产生的。

3.一种检测呕吐毒素的酶联免疫试剂盒，包括权利要求2所述单克隆抗体。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒为如下1)至4)中的任意一种：

1)所述试剂盒包括包被有包被原的酶标板、一抗和酶标二抗；所述包被原为式(I)所示的化合物和载体蛋白偶联得到的偶联物；所述一抗为所述单克隆抗体；

2)所述试剂盒包括包被有包被原的酶标板和酶标半抗原；所述包被原为所述单克隆抗体；所述酶标半抗原中的半抗原为式(I)所示的化合物；

3)所述试剂盒包括包被有包被原的酶标板和酶标一抗；所述包被原为式(I)所示的化合物和载体蛋白偶联得到的偶联物；所述酶标一抗中的一抗为所述单克隆抗体；

4)所述试剂盒包括包被有包被原的酶标板、一抗和酶标半抗原；所述包被原为二抗；所述一抗为所述单克隆抗体；所述酶标半抗原中的半抗原为式(I)所示的化合物；

式(I)。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述载体蛋白为鼠血清蛋白、甲状腺蛋白、牛血清白蛋白、兔血清白蛋白、人血清白蛋白、卵清蛋白或血蓝蛋白；所述的二抗为羊抗鼠二抗或羊抗兔二抗。

6.如权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于：1)中所述的酶标二抗、2)或4)中所述的酶标半抗原、3)中所述的酶标一抗中，所用的标记酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶。

7.如权利要求3至6中任一所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括呕吐毒素标准品溶液、底物显色液、终止液、浓缩洗涤液和样品浓缩液；

所述呕吐毒素标准品溶液浓度为0-5000μg/L；

所述浓缩洗涤液为磷酸盐缓冲液；所述浓缩洗涤液优选为将0.8-1.2mL吐温20和0.5g叠氮钠加入100mL pH7.4 0.01M磷酸盐缓冲液得到的溶液；

所述样品浓缩液为0.8mol/L pH7.2-7.5的磷酸盐缓冲液。

8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：所述标记酶为辣根过氧化物酶；所述底物显色液由显色液A液和显色液B液组成；显色液A液为过氧化氢溶液或过氧化脲溶液；显色液B液为邻苯二胺溶液或四甲基联苯胺溶液；所述终止液为硫酸溶液或盐酸溶液。

9.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：所述标记酶为碱性磷酸酯酶；所述底物显色液为对硝基苯磷酸酯缓冲液；所述终止液为氢氧化钠溶液。

10.一种检测样品中呕吐毒素的方法，包括如下步骤：

1)将待测样品进行前处理，得到待测样本溶液；

2)用权利要求3-9中任一所述试剂盒对所述待测样本溶液进行检测；

所述前处理的方法为下述a)、b)、c)中的任意一种：

a)所述待测样品为谷物或饲料；取待测样品溶于10％(体积百分含量)甲醇水溶液中，超声波振荡，过滤并收集滤液，即为待测样本溶液；

b)所述待测样品为啤酒；将待测样本搅拌，除去过量气体，静置得到上清液，即为待测样本溶液；

c)所述待测样品为麦芽汁；直接作为待测样本溶液。

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