CN103529210A - 一种用于检测样品中重金属离子锌离子含量的酶联免疫试剂盒 - Google Patents
一种用于检测样品中重金属离子锌离子含量的酶联免疫试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种检测重金属离子锌离子含量的酶联免疫试剂盒，被有包被原的酶标板，酶标记物，锌离子螯合物特异性抗体，锌离子螯合物标准品溶液，底物显色液，终止液，浓缩洗涤液，浓缩复溶液。本发明还提供一种应用上述酶联免疫试剂盒检测锌离子螯合物的方法，它包括步骤：首先进行样品前处理，然后用试剂盒进行检测，最后分析检测结果。本发明提供的是检测食品、饲料、饮料、土壤、动物组织等样品中锌离子残留量的酶联免疫试剂盒及检测方法操作简便、费用低廉、灵敏度高、能够现场监控且适合大量样本筛查。
Description
技术领域：
本发明涉及一种用于检测重金属离子锌离子的单克隆抗体及酶联免疫试剂盒。
背景技术：
土壤和农产品中的重金属与人类健康密切相关。重金属污染主要指生物毒性显著地汞、铬、镉、铅以及类金属砷，还包括具有毒性的重金属铜、钴、镍、锡等污染物。随着城市的扩大和大规模工业的发展，大量重金属进入环境后，即使浓度很低，也可能造成危害，通过饮用水，或者通过生物富集以及食物链等方式最终威胁人体健康。重金属污染不同于其他类型污染，具有隐蔽性、长期性和不可逆转性等特点。
在当代人类使用的金属中，按金属用量计，锌(Zn)是仅次于铁、铝、铜之后的第四大用量的重金属。锌是维持机体正常生长发育，新陈代谢的重要物质，它参与蛋白质合成，促进细胞分裂、生长和再生。锌参与体内200多种酶的合成和活化，是动物生长发育及维持正常生理机能所必须的微量元素，但环境污染和饲料、药物添加剂的滥用，造成畜禽产品重金属残留不同程度超标。摄入过量的锌会导致机体代谢紊乱；过量的锌是一种作用迅速的中枢神经毒素，通过对神经细胞的直接损害及对体内各种物质的拮抗而影响脑功能；高锌还可明显抑制红细胞的免疫功能，造成雏鸡肝、脾的结构和功能受损；许多实验和流行病学调查已经证实，如果锌在体内含量过高，将会抑制噬细胞的活性和杀菌力，降低人体免疫功能，使抵抗力减弱，对疾病易性增加。日粮锌添加1300mg／kg以上时，会导致雏鸭患白肌病，肌胃、小肠平滑肌、骨骼肌和心肌受损，作物中蓄积的重金属离子通过食物链的生物放大作用进入人畜体内，引起多种疾病甚至癌症，而且危害还可以遗传到下一代，威胁人畜健康。
同时，水和土壤的锌(Zn)污染已经引起环境科学工作者的广泛关注，锌主要来源于采矿、电镀和冶炼行业污染物的排放。土壤中Zn超过200mg／kg时可能对植物生长造成危害，过量Zn可以直接导致植物发生Zn污染中毒，也可以间接影响植物对于重要营养元素Fe的吸收，进而致使植物因Fe缺失而失绿、生长障碍、甚至死亡。在重金属污染的预防和治理中，重金属污染物的监测和识别至关重要。
因此，痕量重金属的定量分析在食品和环境检测等方面都是非常重要的。传统的重金属离子检测法如无火焰原子吸收光谱法、火焰原子吸收光谱法、电感耦合等离子体质谱法、伏安法和离子色谱法，以及电热原子化原子吸收光谱法等，检测必须在具备大型分析仪器的重点实验室内进行，无法用于现场检测，且受到费用高、处理量有限和检测时间长等限制，都不利于在生产中推广应用，难以适应环境及市场产品的现场抽查及产品进出口快速通关的要求；免疫学检测方法具有快速、廉价、灵敏和特异性强的优点，可同时完成高通量样品的检测，建立免疫分析法检测锌离子是生产及经济发展的需要。
因此，锌离子污染已对人类健康构成了严重威胁，建立快速、简便、敏感、特异、经济、筛检量大的离子锌离子免疫检测技术，对于减少环境污染、提高食品质量、保障食品安全具有重要意义。
发明内容：
本发明的目的：针对现有检测技术的不足和缺陷，制备出抗锌离子螯合物的高亲和力、特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，以此为基础提供一种用于检测锌离子含量的酶联免疫试剂盒，能够快速、简便、敏感、特异的检测食品、茶叶、饲料、饮料、土壤、水、动物组织等样品中的锌离子的含量。
所述的检测锌离子的酶联免疫试剂盒，包括96孔或48孔酶标板、最佳工作浓度的Zn2+mAb或pAb、最佳工作浓度的RaMIgG-HRP或GaMIgG-HRP、底物显色剂A、底物显色剂B、Zn2+-DTPA-OVA或Zn2+-DTPA-BSA包被并封闭好的酶标板、终止液，Zn2+螯合物配置的标准品稀释液1～9，洗液(PBST)。
所述的检测锌离子的酶联免疫试剂盒，用眼观或酶标仪获取结果，并根据结果绘制标准曲线，添加回归方程式，根据回归方程式分析计算所检测样品中的锌离子含量，对锌离子进行痕量分析。
所述的检测锌离子的酶联免疫试剂盒，所用的锌离子标准品为锌离子与EDTA的螯合物，螯合物中锌离子含量采用石墨炉原子吸收光谱法检测获得螯合物半抗原中Zn的含量。
所述单克隆抗体或多克隆抗体的制备方法为：
A1、双功能螫合剂的选择：对氨基苯基-二乙三胺五乙酸(P-NH2-Bn-DTPA)，双功能螯合剂1-(4-异硫氰根苯基)-乙二胺四乙酸(ITCBE)，2-(4-异硫氰根苯基-1，4，7，10-四氮环十二烷四盐酸盐(P-SCN-Bn-DOTA)，然后在碱性或酸性环境下，将离子锌离子螯合在双功能螯合剂上；
A2、Zn2+-DTPA-载体蛋白人工抗原的合成：分别称取鸡卵清白蛋白(OVA)，牛血清白蛋白(BSA)和血蓝蛋白(KLH)20mg溶于1mL浓度为10mmoL／L，pH9.0的N-2-羟乙基哌嗪-N-乙磺酸缓冲液(HBS)中形成KLH、BSA、OVA溶液。称取10mg金属鳌合剂对氨基苯基-二乙三胺五乙酸(P-NH2-Bn-DTPA)溶于1mL二甲基亚飒(DMSO)中形成金属鳌合剂溶液；分别取100uL金属鳌合剂溶液轻轻搅拌下逐滴滴加到0.5mLKLH和BSA溶液中，用10mol／LKOH调节pH至9.0，室温下反应24h。制备出锌离子人工抗原Zn2+-DTPA-OVA，Zn2+-DTPA-BSA，Zn2+-DTPA-KLH，-20℃保存备用。
A3、锌离子单克隆抗体和多克隆抗体的获得：用Zn2+-DTPA-BSA，Zn2+-DTPA-KLH免疫6周雌性BALB／C小鼠5只，剂量为25μg/0.2mL／只，背部皮下分点注射。采用细胞融合技术制备抗锌离子螯合物的单克隆抗体。无菌条件下取免疫鼠脾脏细胞，在聚乙二醇PEG-1500作用下与NS0骨髓瘤细胞进行融合；用间接ELISA法测定细胞上清抗体效价，用阻断ELISA法测定上清抗体抑制率，进行阳性孔筛选，用经GF-AAS检测获得Zn2+-鳌合剂做锌离子标准液，选择强阳性、抑制率高、细胞生长旺盛的孔进行亚克隆和扩大培养、通过鉴定，获得一株杂交瘤细胞株；之后采用体内诱生腹水法制备Zn2+mAb；
多抗制备：用Zn2+-DTPA-BSA，Zn2+-DTPA-KLH人工抗原免疫新西兰大白兔，免疫剂量为50μg～100μg／次，背部皮下分多点注射或足底注射；首免用弗氏完全佐剂乳化；加强免疫用弗氏不完全佐剂乳化，连续免疫5次，每次间隔8周，最后一次免疫后10～15天，以ELISA法测其定效价达到105以上时，采血并分离收集高免血清。以饱和硫酸铵盐析法提取IgG抗体，-20℃冻存备用。
本发明的检测锌离子酶联免疫试剂盒具有下列各项优点：
①特异性强，敏感性高。该检测锌离子酶联免疫试剂盒以高亲和力的单克隆抗体(mAb)或多克隆抗体(pAb)为基础制备而成。酶联免疫试剂盒采用的是非均相间接竞争模式，其基本原理是样品中的Zn2+与过量鳌合剂鳌合成可溶性的Zn2+-鳌合剂复合物后，将其与已包被于酶标板上的包被抗原Zn2+-鳌合剂-载体蛋白复合物共同竞争Zn2+mAb上有限的结合位点，反应达到平衡后洗脱多余的Zn2+-鳌合剂和Zn2+mAb，然后与酶标二抗反应，用酶及其底物显色系统显示抗原抗体的结合情况，进而定量检测Zn2+在样品中的含量。该试剂盒最低检测限为0.248μg／L，检测范围为3.774～442.39μg／L，与其它金属离子交叉反应较小。
②简便、快速、时效性强。使用该检测锌离子酶联免疫试剂盒，无需其它试剂和仪器，可现场操作，只要按照该试剂盒说明书上操作步骤进行检测，60分钟内即可判定检测结果，并根据结果可计算样品中锌离子含量。
③结果显示直观、形象、准确。酶联免疫试剂盒固相上的酶量与标本中受检物质的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。显色液和底物不同显示不同颜色，本试剂盒底物为过氧化脲，显色剂为四甲基联苯胺(TMB)，终止液为2mol／L的硫酸溶液，故显示蓝色，终止后显色为黄色，肉眼可见。与所提供的标准检测液比较，显色越深则待测物中锌离子含量越低或不含，显色越淡或不显色者说明样品中含有待检物，且含量越高，如有酶标仪可进行度数，度数后根据稀释比例进行计算可得出锌离子的含量。
④适用范围广，节省费用，便于推广。使用酶联免疫试剂盒，比用仪器分析的费用大幅下降。另外，酶联免疫试剂盒的适用范围广，可满足不同层次人员需要，包括专业检验，海关检疫，卫生检疫，质量监测，加工企业和养殖场户等，便于推广应用，具有广阔的市场前景和明显的经济、社会效益。
附图说明：
图1为检测锌离子酶联免疫试剂盒的标准曲线图
具体实施方式：
一种用于检测锌离子酶联免疫试剂盒，它包括检测酶标板、用于检测的试剂，其中试剂包括样品稀释液，样品提取液。重金属离子免疫检测的关键在于重金属特异性单克隆抗体的制备，重金属特异性单克隆抗体制备的关键又在于重金属免疫原。由于重金属离子带有电荷，能与动物体内生物分子发生强烈的不可逆的反应，导致动物中毒。因此，可利用特异性的双功能螯合剂螯合重金属离子，形成能被动物免疫系统识别的金属-螯合剂的复合物，但这些重金属-螯合剂复合物是分子量低于1kD的半抗原，免疫原性低，不足以引起免疫反应，还需将之与载体蛋白偶联，才能形成完整的免疫原。要制成锌离子酶联免疫试剂盒，首先需要对重金属离子锌离子与双功能螯合剂进行螯合反应，制备锌离子螯合物偶联载体蛋白，用于制备相应的检测抗体。
本发明还包括食品、饲料、饮料、土壤、动物组织等样品预处理方法。饲料、动物组织土壤等固体样品，研磨捣碎后称取1.0g样品，加入10mL HEPES缓冲液，搅拌30min，3000r／min离心5min，在上清液中加入30mg EDTA，并用N aOH溶液调pH至6.0，室温反应过夜；市场购买的饮料、自来水等液体样品，取10mL样品，加入30mg EDTA，用NaOH溶液调pH至6.0，室温反应过夜，反应后待检。
本发明的检测锌离子酶联免疫试剂盒，样品处理简单，适合于大量样品的快速检测和筛选，具有高特异性、高灵敏度、高精确率等特点，最低检测限为0.248μg／L，检测范围为3.774～442.39μg/L。
以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。
实施例1、锌离子螯合物、多克隆、单克隆抗体的制备
1.1锌离子螯合物的合成与鉴定
称取100mg纯度为99.99％的氯化锌溶于100μL纯度为优级的浓硝酸，待充分溶解加超纯水使终体积为1mL，形成浓度为733.7mmoL／L锌溶液。称取10mg EDTA溶于10mM HBS缓冲液配制成浓度为34.2mmoL／L EDTA溶液。将两者混匀后，用NaOH调节pH值为6.0，室温摇床反应24小时，即形成Zn2+-EDTA鳌合物溶液。
将100μg／mL的Zn2+标准储备液用2％的硝酸稀释成0μg／mL、0.25μg／mL、0.5μg／mL、1μg／mL、2μg／mL、4μg／mL的浓度梯度，仪器软件自动绘制标准曲线，并得出线性回归方程；样品溶液50倍稀释，用226nm波长在最佳优化实验条件下进行测定，仪器软件自动分析结果。计算出所螯合物种的锌离子含量。
1.2锌离子人工抗原的合成与鉴定
分别称取20mg KLH和BSA溶于1mL浓度为10mmoL／L，pH9.0的N-2-羟乙基哌嗪-N-乙磺酸缓冲液(HBS)中形成KLH、BSA溶液。
称取10mg金属鳌合剂对氨基苯基-二乙三胺五乙酸(P-NH2-Bn-DTPA)溶于1mL二甲基亚飒(DMSO)中形成金属鳌合剂溶液；分别取160uL金属鳌合剂溶液轻轻搅拌下逐滴滴加到1mLKLH和BSA溶液中，用10mol／L NaOH调节pH至9.0，室温下反应24h。反应产物用30Kd的超滤管纯化，超滤管内加入反应产物超滤，超滤管内先用10mmoL／L，pH9.0HBS冲洗3次，再用10mmoL／L，pH7.4的HBS缓冲液洗2次，除去其中未反应的小分子金属鳌合剂。
取16μL浓度为733.7mmoL／L锌溶液滴加到已反应过的载体蛋白溶液中，用用NaOH调节pH值至9.0，室温摇床反应24小时，然后移入透析袋中透析5天。所得产物即分别为纯化的锌离子鳌合后的人工抗原；Zn2+-DTPA-BSA，Zn2+-DTPA-KLH。用蛋白核酸分析仪在280nm波长下测定人工抗原中的蛋白浓度。
同法制得包被抗原Zn2+-DTPA--OVA。
1.3锌离子单克隆抗体(Zn2+mAb)和多克隆抗体(Zn2+pAb)的获得
用Zn2+-DTPA-BSA，Zn2+-DTPA-KLH分别免疫6周雌性BALB／C小鼠5只，剂量为20μg/0.2mL／只，背部皮下分点注射。采用细胞融合技术，在PEG-1500作用下与NS0骨髓瘤细胞进行融合；用间接ELISA和阻断ELISA进行阳性孔筛选，筛选后进行有限稀释克隆化，扩大培养、冻存并鉴定，获得杂交瘤细胞株。采用体内诱生腹水法制备Zn2+mAb。用蛋白核酸分析仪在280nm波长下测定所获抗体的IgG含量。计算该单抗亲和力常数。
多抗制备：用Zn2+-DTPA-BSA，Zn2+-DTPA-KLH分别免疫新西兰白兔，免疫剂量为50μg～100μg／次，背部皮下分多点注射。首免，加等量弗氏完全佐剂(FCA)乳化；加强免疫，加等量弗氏不完全佐剂(FIA)乳化，连续免疫5次，每次间隔8周，最后一次免疫后10～15天，以间接ELISA法测其定效价达到1：105以上时，采血并分离收集高免血清以饱和硫酸铵盐析法提取IgG抗体，-20℃冻存备用。
实施例2、锌离子检测酶联免疫试剂盒的制备
2.1酶联免疫试剂盒检测反应原理
免疫学检测即是根据抗原、抗体反应的原理，利用已知的抗原检测未知的抗体或利用已知的抗体检测未知的抗原。酶联免疫试剂盒选用合适浓度的包被抗原包被酶标板，将待测己处理后的样品按要求取用和提供的多克隆或单克隆抗体结合反应，未完全结合的抗体与酶标板上的位点结合，通过辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠或兔抗鼠二抗结合反应，通过显色体现显色，观察结果，或用酶标仪渎度数，根据结果计算待测物的含量。结果的判断同所提供的阴性、阳性对照比较，如显色深浅同阴性对照完全相同，则视为阴性，即为不含待测物；如显色较弱，或是不显色则为阳性或弱阳性，即为含有待测物。如空白对照显色，或阴性对照不显色则视为无效。
2.2锌离子检测酶联免疫试剂盒的制备
(1)待标锌离子mAb或pAb的工作浓度将待标离子锌离子mAb或pAb溶液10000rpm离心30min，除去杂质。采用方阵法筛选确定离子锌离子mAb或pAb的工作浓度。用不同浓度的包被抗原包被，测出包被原最佳包被浓度和最佳抗体浓度。本试剂盒最佳包被浓度即用Zn2+-DTPA-BSA包被，蛋白质浓度为0.05mg／mL；锌离子mAb的工作浓度为1：3.2×105；锌离子pAb的工作浓度为1：5.2×105。
(2)锌离子检测酶联免疫试剂盒标准品的制备称取10mgEDTA溶于10mM HBS缓冲液配制成浓度为34.2mmoL／L EDTA溶液，将Zn2+标准储备液稀释成0ng／mL、3.906ng／mL、7.812ng／mL、15.625ng／mL、31.25ng／mL、62.5ng／mL、125ng／mL、250ng／mL、500ng／mL、1000ng／mL的浓度梯度，用NaOH调节pH值为6.0，室温摇床反应24小时，即形成Zn2+-EDTA鳌合物溶液。将100μg／mL的Zn2+标准储备液用2％的硝酸稀释成0μg／mL、0.25μg／mL、0.5μg／mL、1μg／mL、2μg／mL、4μg／mL的浓度梯度，仪器软件自动绘制标准曲线，并得出线性回归方程；样品溶液50倍稀释，用226nm波长在最佳优化实验条件下进行测定，仪器软件自动分析结果。
(3)锌离子检测酶联免疫试剂盒的组装锌离子残留与含量的酶联免疫试剂盒，标准配置包括C1号液(最佳工作浓度的Zn2+mAb)，C2号液(最佳工作浓度的RaMIgG-HRP)，C3号液(底物显色剂A)，C4号液(底物显色剂B)，Zn2+-DTPA-BSA包被并封闭好的8×12(96孔)或酶8×12(48孔)酶标板，C5号液(终止液)，Zn2+标准品稀释液1～9，洗液(PBST)。洗液为0.01mol／L、pH7.4的磷酸盐缓冲液含0.05％Tween-20(PBST)，底物显色剂A为过氧化脲，底物显色剂B为四甲基联苯胺(TMB)，终止液为2mol／L的硫酸溶液。见表1。
表1锌离子酶联免疫试剂盒的标准配置
(4)锌离子酶联免疫试剂盒操作步骤
A1、样品前处理方法：用0.1mol／L EDTA溶液处理样品，离心取上清液用于检测。
A2、检测步骤：
第一步，除第一排最后两孔分别为阴性对照和空白对照外，每孔加入50μL工作浓度的Cl号液Zn2+mAb，同时加入等体积Zn2+-EDTA鳌合物标准液，其他孔根据检测要求加入50μL已处理的待检样品和等体积工作浓度的Cl号液Zn2+mAb，混匀后37℃温育15min，反应后用PBST洗板；
第二步，每孔加入50μL工作浓度的RaRIgG-HRP，37℃温育25min，PBST洗板；
第三步，每孔加入100μL的酶底物A、B混合液显色，室温反应5min，每孔加入100μL终止液，用酶标仪读A450值，记录结果。
如检测样品的显色未在标准品的显色范围内，可根据情况加倍稀释后重新检测，计算结果时乘以稀释倍数。
A3、分析检测结果：将第一排的标准液显色的OD值进行数据处理，得出回归方程式，然后将待测物的OD值放入标准曲线的回归方程式中进行计算，乘以稀释倍数后得出待测样品中锌离子的含量。
(5)锌离子酶联免疫试剂盒标准曲线阻断ELISA测定单克隆抗体对不同浓度Zn标准品的抑制率，以抑制率B／B0％(B是Zn2+不同标准浓度的A450值，B0是Zn2+0μg／L的标准浓度的A450值)为纵坐标，以不同标准品浓度的对数值为横坐标，在半对数坐标纸上绘制标准曲线，推导回归方程，进行回归分析。线性的回归方程为y＝-33.827x+99.512，R2＝0.9891，IC50为29.08μg／L。标准曲线见附图1。
实施例3、锌离子酶联免疫试剂盒的性能
3.1灵敏性测定按照阻断ELISA最低检测限为B／B0％＝120％的方法，根据曲线回归方程计算出试剂盒的灵敏度，确定检测限。测定结果，检测限为0.248μg／L。根据阻断ELISA所得结果中B／B0％=10％～90％为检测范围，根据曲线回归方程计算出试剂盒的检测范围为3.774～442.39μg／L。
3.2准确性测定将Zn2+标准品以终浓度分别为5、10、20、40μg／L添加到土壤、自来水和猪肉中，设6个重复，以回收率和变异系数(CV)确定其准确度。结果见表2。土壤的回收率在84.15％～87.6％，平均85.36％，变异系数(CV)在6.05％～13.09％；自来水的回收率在76.7％～88.3％，平均81.43％，CV在10.76％～12.87％；猪肉的回收率在80.2％～85.4％，平均82.76％，CV在12.59％～15.94％。平均CV小于15％，表明试剂盒具有较高准确度。见表2。
表2锌离子酶联免疫试剂盒添加回收试验(n＝6)
3.3特异性测定采用交叉反应试验，选择汞、铅、镉、铜、铬、钴、铁等金属离子与EDTA的螯合物、EDTA、ITCBE、DOTA、DTPA为抑制物，用阻断ELISA测定各抑制物的IC50，以Zn2+mAb对Zn2+的IC50和对其它各竞争物的IC50的百分率为其交叉反应率(CR％)。见表3。
表3Zn2+-EDTA mAb与其它金属螯合物的交叉反应
| 化合物 | IC50(μg/L) | 交叉反应率(％) |
| Zn2+-EDTA | 29.08μg／L | 100 |
| EDTA | 692.1 | 23.8 |
| DTPA | 135 | 32.7 |
| ITCBE | 950.9 | <0.1 |
| DOTA | 1×103 | <0.1 |
| Co2+-EDTA | >3×103 | <0.1 |
| Hg2+-EDTA | >3×103 | <0.1 |
| Pb2+-EDTA | >3×103 | <0.1 |
| Fe2+-EDTA | >3×103 | <0.1 |
| Cd2+-EDTA | >3×103 | <0.1 |
| Mo2+-EDTA | >3×103 | <0.1 |
| Cr3+-EDTA | >3×103 | <0.1 |
| Cu2+-EDTA | >3×103 | <0.1 |
3.4稳定性：取同一批次的试剂盒保存于4℃，测定保存6个月中各月份的A450值、IC50、R2变化情况，确定其稳定性。见表4。
表4试剂盒的保存期
| 保存天数(d) | IC50(μg／L) | R2 | 最大吸光值 |
| 1 | 29.08μg／L | 0.9891 | 1.012 |
| 30 | 30.67 | 0.9795 | 1.056 |
| 60 | 31.57 | 0.9672 | 0.9648 |
| 90 | 31.82 | 0.9596 | 0.9598 |
| 120 | 32.94 | 0.9584 | 0.9817 |
| 150 | 32.84 | 0.9637 | 0.8947 |
| 180 | 30.91 | 0.9784 | 0.8758 |
实施例4、锌离子酶联免疫试剂盒的应用
4.1固体样品的提取(饲料、动物组织、土壤等)
取组织(鸡肉、兔肉、饲料等)均质物1.0g，研磨捣碎后加入过量的已稀释的EDTA溶液混匀，用NaOH调节pH值为6.0，室温摇床反应24小时，即形成Zn2+-EDTA鳌合物溶液。
液体样品的提取不需研磨可直接加入EDTA溶液混匀进行螯合，用于检测。
4.2检测操作方法
第一步，除第一排最后两孔分别为阴性对照和空白对照外，每孔加入50μL工作浓度的Cl号液Zn2+mAb，同时加入等体积不同浓度的锌离子标准液，其他孔根据检测要求加入50μL已处理的待检样品和等体积工作浓度的Cl号液Zn2+mAb，混匀后37℃温育15min，反应后用PBST洗板；
第二步，每孔加入50μL工作浓度的RaRIgG-HRP，37℃温育25min，PBST洗板；
第三步，每孔加入100μL的酶底物A、B混合液显色，室温反应5min，每孔加入100μL终止液，用酶标仪读A450值，记录结果。
将获得的第一排的锌离子标准液的OD值按照公式，绘出标准曲线图，并添加的回归方程，待检物的OD值按照回归方程进行计算，乘以取样时的稀释倍数得出待测样品中锌离子的含量。如果没有酶标仪进行度数的，可根据肉眼观察判断结果，判断方法是观察待测物的显色深浅与试剂盒提供的锌离子标准液的显色进行比较，相近颜色的锌离子标准液的浓度可大概判定为该待测物的锌离子含量，结果乘以取样时的稀释倍数即为该待检样中的锌离子的含量。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。
Claims (9)
1.一种用于检测食品、饮料、茶叶、土壤、动物组织等样品中的锌离子残留与含量的酶联免疫试剂盒。
2.根据权利要求1所述锌离子酶联免疫试剂盒，其特征在于：包括包被Zn2+-DOTA-BSA或Zn2+-DOTA-OVA并封闭好的96孔或48孔酶标板，以Zn2+-DOTA-BSA或Zn2+-DOTA-OVA为抗原制备的铜离子多克隆或单克隆抗体Zn2++mAb或pAb，酶标二抗为兔抗鼠或羊抗鼠抗体标记辣根过氧化物酶RaMIgG-HRP或GaMIgG-HRP，Zn2+螯合物配置的标准品稀释液，洗液为0.01mol／L、pH7.4的磷酸盐缓冲液含0.05％Tween-20(PBST)，底物显色剂A为过氧化脲，底物显色剂B为四甲基联苯胺(TMB)，终止液为2mol／L的硫酸溶液。
3.根据权利要求1、2所述的锌离子酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述的酶联免疫试剂盒由以下步骤制备：
(1)包被：酶标板上用Zn2+-DTPA-BSA包被；
(2)封闭；采用浓度为0.05％的猪血清进行封闭；
(3)单克隆抗体的制备：用Zn2+-DOTA-KLH和Zn2+-DOTA-BSA分别免疫6周龄雌性BALB／C小鼠。采用细胞融合技术无菌取脾脏制备脾细胞，在聚乙二醇-1500作用下与NS0骨髓瘤细胞进行融合；用间接ELISA法和阻断ELISA法进行阳性孔筛选，选择强阳性、抑制率高、细胞生长旺盛的孔进行有限稀释克隆化，扩大培养、冻存并鉴定，获得一株杂交瘤细胞株；之后采用体内诱生腹水法制备抗锌离子螯合物的mAb；
(4)EDTA反应液的配制：称取10mg EDTA溶于10mM HBS缓冲液配制成浓度为34.2mmoL／L EDTA溶液；
(5)Zn2+标准溶液的配制：称取100mg氯化锌溶于100μL浓硝酸，待充分溶解加超纯水使终体积为1mL，形成锌溶液，与EDTA溶液混匀后，用NaOH调节pH值，室温反应24小时，即形成Zn2+-EDTA鳌合物溶液。
(6)二抗的配制：酶标二抗RaMIgG-HRP或GaMIgG-HRP按照1：1000的工作浓度用洗液稀释分装；
(7)底物、显色液与洗液的配制：底物、显色液与洗液分装配制；
(8)终止液为2mol／L的硫酸溶液。
4.根据权利要求3所述锌离子酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述的检测抗原Zn2+-DOTA-Proten，其制备步骤：
(1)称取100mg氯化锌溶于浓硝酸，溶解后加超纯水使终体积为1mL，形成锌溶液；
(2)称取10mg EDTA溶于10mM HBS缓冲液配制成EDTA溶液；
(3)将(1)，(2)混匀后，用NaOH调节pH值，反应24小时，形成Zn2+-EDTA鳌合物溶液；
(3)分别称取20mg载体蛋白溶于1mL浓度为10mmoL／L HBS中形成蛋白溶液；
(4)称取10mg DTPA溶于1mL二甲基亚砜(DMSO)中形成金属鳌合剂溶液；
(5)分别取160uL DTPA加到1mL蛋白溶液中，NaOH调节pH值，室温反应24h，形成蛋白螯合剂；
(6)取16μL锌溶液到蛋白螯合剂溶液中，室温反应24小时，纯化后得锌离子鳌合物人工抗原，Zn2+-DTPA-Proten。
5.根据权利要求1、2所述锌离子残留与含量的酶联免疫试剂盒，其特征在于：其检测操作包括以下步骤：
(1)样品前处理方法：用0.1mol／L EDTA螯合物溶液处理待检样品，离心取上清液用于检测。
(2)加样步骤：
第一步，除第一排最后两孔分别为阴性对照和空白对照外，每孔加入50μL工作浓度的C1号液Zn2+mAb，同时加入等体积Zn2+-EDTA鳌合物标准液，其他孔根据检测要求加入50μL已处理的待检样品和等体积工作浓度的C1号液Zn2+mAb，混匀后37℃温育15min，反应后用PBST洗板；
第二步，每孔加入50μL工作浓度的RaRIgG-HRP／GaMIgG-HRP，37℃温育25min，PBST洗板；
第三步，每孔加入100μL的酶底物A、B混合液显色，室温反应5min，每孔加入100μL终止液，用酶标仪读A450值，记录结果。
(3)分析检测结果：将第一排的标准液显色的OD值进行数据处理，得出回归方程式，然后将待测物的OD值放入标准曲线的回归方程式中进行计算，乘以稀释倍数后得出待测样品中锌离子的含量。
6.根据权利4所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述载体蛋白包括鸡卵清白蛋白(OVA)，牛血清白蛋白(BSA)，血蓝蛋白(KLH)。
7.根据权利要求1-4所述锌离子酶联免疫试剂盒，其特征在于：酶标板上用Zn2+-DTPA-BSA包被，包被蛋白质浓度为0.05mg／mL；锌离子mAb的工作浓度为1：3.2×105。
8.根据权利要求1～5所述锌离子酶联免疫试剂盒，其特征在于：样品处理简单，适合于大量样品的快速检测和筛选，具有高特异性、高灵敏度、高精确率等特点，IC50为29.08μg/L，最低检测限为0.248μg／L，检测范围为3.774～442.39μg／L。
9.根据权利要求1～8所述锌离子酶联免疫试剂盒，准确性测定通过对土壤、自来水和猪肉的添加回收，以回收率和变异系数(CV)确定其准确度。土壤的回收率平均为85.36％；自来水的回收率平均为81.43％；猪肉的回收率平均为82.76％。平均CV小于15％，锌离子酶联免疫试剂盒具有较高准确度。
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| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| DD01 | Delivery of document by public notice |
Addressee: Jiang Jinqing Document name: Notification of Acceptance of Request for Reexamination Addressee: Jiang Jinqing Document name: Written decision of reexamination |
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| CB03 | Change of inventor or designer information | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Jiang Jinqing Inventor after: Wang Lei Inventor after: Zhang Haitang Inventor after: Wang Ziliang Inventor after: Fan Guoying Inventor after: Wang Shungang Inventor before: Zhang Haitang Inventor before: Wang Aiping Inventor before: Wang Ziliang Inventor before: Fan Guoying Inventor before: Jiang Jinqing Inventor before: Wang Shungang |
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Granted publication date: 20170714 |