CN105061553A - 一种豆状囊尾蚴囊液蛋白的分离纯化和免疫原性检测的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种豆状囊尾蚴囊液蛋白的分离纯化和免疫原性检测的方法，包括超滤离心管的预处理、囊液蛋白的处理、离心处理、收集大分子量目的蛋白和小分子量目的蛋白，并对纯化的分子量大小不同的囊液蛋白进行抗原性检测等步骤。本发明操作简单，时程短，效率高，作用超滤膜更加灵敏准确，获取的纯化蛋白浓度更高更纯，蛋白回收量大，并能获得抗原性强的纯化蛋白。本法是比较理想的分离纯化囊液蛋白及检测纯化蛋白免疫原性的新方法。

Description

一种豆状囊尾蚴囊液蛋白的分离纯化和免疫原性检测的方法

技术领域

本发明涉及囊液蛋白分离和免疫领域，具体涉及一种豆状囊尾蚴囊液蛋白的分离纯化和免疫原性检测的方法。

背景技术

兔豆状囊尾蚴病(Cysticercosispisiformisinrabbit)是由豆状囊尾蚴寄生于家兔等啮齿类动物的肝脏、大网膜、肠系膜和腹腔内引起的一种常见多发病。本病呈世界性分布，我国发生更为严重。据报道，从东北部的黑龙江、辽宁，到西北部的青海和新疆，从西南的四川、重庆和贵州，到东南部的福建和华南的广西，再到华中的河南，华东的浙江和山东等省，均有本病的发生，发病病率从5％到100％不等，平均感染率达到40％左右，死亡率在4％-20％之间。家兔感染豆状囊尾蚴后，临床上的主要表现为被毛松散、消化不良、腹胀、消瘦、生长发育迟缓，影响皮毛质量和肉品质量，幼兔感染后常可引起大批死亡。因此，本病给养兔业造成重大的经济损失。

目前，我国还没有可供诊断兔豆状囊尾蚴病的血清学方法。这可能与豆状囊尾蚴的抗原成份多、结构复杂、特异性差、且非特异变化明显有关。在总结前人研究的基础上，本研究发现豆状囊尾蚴的囊液蛋白，作为一种分泌性抗原，具有良好的抗原性，通过对囊液蛋白的分离和纯化，可作为免疫抗原或制备抗血清，在临床上对豆状囊尾蚴病进行诊断。

发明内容

为了从豆状囊尾蚴的囊液中筛选出抗原性好，反应原性强的囊液蛋白，本发明提供了一种豆状囊尾蚴囊液蛋白的分离纯化和免疫原性检测的方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种豆状囊尾蚴囊液蛋白的分离纯化方法，包括如下步骤：

S1、取100kDa的超滤管、50kDa的超滤离心管各两个，分别用超纯水润洗干净后，倒满超纯水，置于4℃冰箱内，预冷5-10min；

S2、取1200μL全囊液蛋白与等体积的超纯水混合均匀后，得2400μL样品；

S3、提前开启离心机降温至4℃，将预处理好的两个100kDa的超滤离心管取出，弃去管内超纯水，各自加入1200μL样品，离心处理30-35min；

S4、离心后，取出超滤离心管，吸取500μL超纯水吹20-30，将位于超滤管内管里的大于100kDa的蛋白收集于干净的小离心管内，-80℃保存备用，并将位于超滤管的外管内的小于100kDa的蛋白直接收集于干净的10mL离心管内；

S5、提前开启离心机降温至4℃，将预处理好的两个50kDa的超滤离心管取出，弃去管内超纯水，分别加入等量的步骤S4收集的小于100kDa的蛋白，离心处理30-35min后，用500μL超纯水30-40次吹打50-100kDa的样品，收集于小离心管内，-80℃保存备用，并将小于50kDa的蛋白直接收集于10mL离心管内，-80℃保存备用。

本发明还提供了一种豆状囊尾蚴囊液蛋白抗原性检测方法，采用PVC-Dot-ELISA检测方法筛选纯化蛋白的抗原性，分别以切胶回收的纯化蛋白和经过超滤离心管分离的纯化蛋白作为包被原进行包板，一抗为全囊液蛋白免疫小鼠所制备的抗血清，二抗为辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗鼠IgG，具体包括如下步骤：

S1、按10μg/mL(用PBS稀释)的浓度包被96孔PVC板，每孔50μL，每种纯化蛋白各自包被一行(12孔)，4℃过夜，PBST洗涤3次，每次间隔5min；

S2、用含5％脱脂奶粉的PBST封闭液封闭，每孔200μL，37℃，封闭2h，PBST洗涤3次，每次间隔5min；

S3、分别加入一抗，每行留四个孔，三个空为阴性对照，一个空为空白对照，第一空按照1∶100开始，依次进行倍比稀释到1∶12800，37℃，反应30min，PBST洗涤3次，每次间隔5min；

S4、加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗，稀释比例按1∶5000，每孔50μL，37℃，反应30min，PBST洗涤3次，每次间隔5min；

S5、加底物显色液，每孔50μL，反应5min；

S6、加终止液，每孔50μL，立即读数；

S7、用酶标仪在450nm下测量96孔PVC反应板各孔的OD值，并保存。

本发明具有以下有益效果：

操作简单，时程短，效率高，而且超滤管分离法比常规的SDS-PAGE分离法更加灵敏准确，获取的纯化蛋白浓度更高更纯，蛋白回收量大，而且抗原性较强，是比较理想的分离纯化囊液蛋白和获得抗原性好的囊液蛋白的新方法。

具体实施方式

为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

用超滤管对豆状囊尾蚴囊液蛋白进行分离的方法

S1、取100kDa的超滤管、50kDa的超滤离心管各两个，分别用超纯水润洗干净后，倒满超纯水，置于4℃冰箱内，预冷5-10min；

S2、取1200μL全囊液蛋白与等体积的超纯水混合均匀后，得2400μL样品；

S3、提前开启离心机降温至4℃，将预处理好的两个100kDa的超滤离心管取出，弃去管内超纯水，各自加入1200μL样品，离心处理30-35min；

S4、离心后，取出超滤离心管，吸取500μL超纯水吹打20-30次，将位于超滤管内管里的大于100kDa的蛋白收集于干净的小离心管内，-80℃保存备用，并将位于超滤管的外管内的小于100kDa的蛋白直接收集于干净的10mL离心管内；

S5、提前开启离心机降温至4℃，将预处理好的两个50kDa的超滤离心管取出，弃去管内超纯水，分别加入等量的步骤S4收集的小于100kDa的蛋白，离心处理30-35min后，用500μL超纯水30-40次吹打50-100kDa的样品，收集于小离心管内，-80℃保存备用，并将小于50kDa的蛋白直接收集于10mL离心管内，-80℃保存备用。

结果

用超滤离心管分离纯化的蛋白有三种：一是分子量大于100kDa的蛋白；二是分子量在50-100kDa之间的蛋白；三是分子量小于50kDa的蛋白，将分离纯化后的三种蛋白分别用序号1.2.3.表示，用超微量蛋白核酸分析仪进行了浓度测定，结果见表1。

表1纯化蛋白浓度

从表1可以看出，与未纯化的囊液蛋白相比，分离纯化后的蛋白浓度明显降低。分子量在50-100kDa之间的蛋白最多，其次为分子量大于100kDa的蛋白，而分子量小于50kDa的蛋白最少。

实施例2

用PVC-Dot-ELISA方法检测纯化之囊液蛋白的抗原性

采用PVC-Dot-ELISA检测方法筛选本具体实施所纯化蛋白的抗原性。将经过超滤离心管分离的不同分子量的纯化蛋白作为包被原进行包板，一抗为全囊液蛋白免疫小鼠所制备的抗血清，二抗为辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗鼠IgG。

基本的操作步骤为：

S1、按10μg/mL(用PBS稀释)的浓度包被96孔PVC板，每孔50μL，每种纯化蛋白各自包被一行(12孔)，4℃过夜，PBST洗涤3次，每次间隔5min；

S2、用含5％脱脂奶粉的PBST封闭液封闭，每孔200μL，37℃，封闭2h，PBST洗涤3次，每次间隔5min；

S3、分别加入一抗，每行留四个孔，三个空为阴性对照，一个空为空白对照，第一空按照1∶100开始，依次进行倍比稀释到1∶12800，37℃，反应30min，PBST洗涤3次，每次间隔5min；

S4、加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗，稀释比例按1∶5000，每孔50μL，37℃，反应30min，PBST洗涤3次，每次间隔5min；

S5、加底物显色液，每孔50μL，反应5min；

S6、加终止液，每孔50μL，立即读数；

S7、用酶标仪在450nm下测量96孔PVC反应板各孔的OD值，并保存。

结果

通过PVC-Dot-ELISA检测方法对分离纯化的三种蛋白进行抗原性检测，结果见表2。

袁2用PVC-Dot-ELISA方法检测纯化蛋白的抗原性

从该表可以看出，当纯化蛋白1和2作为包被原进行反应时，可以有效地检测出一抗的效价，而当纯化蛋白3作为包被原时，OD值与阴性孔接近，无法检测出一抗，纯化蛋白1和2的OD值读数很接近，且都比3要更灵敏。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (2)

1.一种豆状囊尾蚴囊液蛋白的分离纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、取100kDa的超滤管、50kDa的超滤离心管各两个，分别用超纯水润洗干净后，倒满超纯水，置于4℃冰箱内，预冷5-10min；

S2、取1200μL全囊液蛋白与等体积的超纯水混合均匀后，得2400μL样品；

S3、提前开启离心机降温至4℃，将预处理好的两个100kDa的超滤离心管取出，弃去管内超纯水，各自加入1200μL样品，离心处理30-35min；

S4、离心后，取出超滤离心管，吸取500μL超纯水吹20-30，将位于超滤管内管里的大于100kDa的蛋白收集于干净的小离心管内，-80℃保存备用，并将位于超滤管的外管内的小于100kDa的蛋白直接收集于干净的10mL离心管内；

S5、提前开启离心机降温至4℃，将预处理好的两个50kDa的超滤离心管取出，弃去管内超纯水，分别加入等量的步骤S4收集的小于100kDa的蛋白，离心处理30-35min后，用500μL超纯水30-40次吹打50-100kDa的样品，收集于小离心管内，-80℃保存备用，并将小于50kDa的蛋白直接收集于10mL离心管内，-80℃保存备用。

2.一种豆状囊尾蚴囊液蛋白抗原性检测方法，其特征在于，采用PVC-Dot-ELISA检测方法筛选纯化蛋白的抗原性，将经过超滤离心管分离的纯化蛋白作为包被原进行包板，一抗为全囊液蛋白免疫小鼠所制备的抗血清，二抗为辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗鼠lgG，具体包括如下步骤：

S1、按10μg/mL(用PBS稀释)的浓度包被96孔PVC板，每孔50μL，每种纯化蛋白各自包被一行(12孔)，4℃过夜，PBST洗涤3次，每次间隔5min；

S2、用含5％脱脂奶粉的PBST封闭液封闭，每孔200μL，37℃，封闭2h，PBST洗涤3次，每次间隔5min；

S3、分别加入一抗，每行留四个孔，三个空为阴性对照，一个空为空白对照，第一空按照1∶100开始，依次进行倍比稀释到1∶12800，37℃，反应30min，PBST洗涤3次，每次间隔5min；

S4、加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗，稀释比例按1∶5000，每孔50μL，37℃，反应30min，PBST洗涤3次，每次间隔5min；

S5、加底物显色液，每孔50μL，反应5min；

S6、加终止液，每孔50μL，立即读数；

S7、用酶标仪在450nm下测量96孔PVC反应板各孔的0D值，并保存。