CN101486767A - 抗汞螯合物单克隆抗体及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种抗汞螯合物单克隆抗体。所述单克隆抗体对汞螯合物具有特异性，所述的汞螯合物为汞－1－(4－异硫氨酸苄基)－乙二胺四乙酸－牛血清白蛋白偶联物和汞－乙二胺四乙酸。本发明的单克隆抗体滴度高、特异性强。本发明还提供一种抗汞螯合物单克隆抗体的制备方法与应用。
Description
技术领域
本发明涉及重金属免疫检测技术领域，特别涉及一种抗汞螯合物单克隆抗体及其制备方法与应用。
背景技术
重金属污染给生态环境和人类健康带来严重的危害，特别是汞，因其复杂性和毒性，引起了广泛关注，汞及其化合物所造成的污染问题日益严重，并通过多种途径对人体呼吸系统、皮肤、中枢神经系统、肾脏和眼睛等造成严重伤害。早在20世纪50年代日本熊本水俣病爆发之后，汞的污染问题就引起了人们的关注。近年来，随着城市化进程的不断加快和工业化水平的迅速提升，由于生产、生活所致的示及其化合物污染日趋严重并再度成为全球热点问题之一。因此，有关汞的排放、迁移、沉降以及控制研究已成为环境污染防治的新兴领域之一。联合国粮农组织和世界卫生组织已1963年规定了食品中汞的最大允许浓度为0.05mg/Kg(鲜重)，美国为0.5mg/Kg，我国食品卫生标准规定的极限值为0.02mg/Kg。
传统的重金属检测方法多采用化学仪器检测，例如原子吸收光谱分析(atomic absorption spectroscopy，AAS)、电感耦合等离子发射光谱(inductivelycoupledplasma atomic emission spectroscopy，ICP-AES)等，这些方法需要对大量的样品进行预处理，并且检测过程必须在集中大型分析仪器的室内进行，无法用于现场检测，具有费用高、处理量有限、检测时间长等缺陷。
因此，需要发明一种新的抗汞螯合物单克隆抗体及其制备方法与应用以解决上述问题。
发明内容
本发明的主要目的之一在于基于现有技术的不足而提供一种滴度高、特异性强的抗汞螯合物单克隆抗体。
本发明的另一个目的在于提供一种制备滴度高、特异性强的抗汞螯合物单克隆抗体的方法。
本发明的另一个目的是提供一种检测速度快、费用低廉、灵敏度高和选择性强的检测汞离子浓度的检测方法。
本发明提供一种单克隆抗体，所述单克隆抗体对汞螯合物具有特异性，所述的汞螯合物为汞-1-(4-异硫氨酸苄基)-乙二胺四乙酸-牛血清白蛋白偶联物和汞-乙二胺四乙酸。
作为本发明单克隆抗体的优选实施方式，所述的单克隆抗体与汞-1-(4-异硫氨酸苄基)-乙二胺四乙酸-牛血清白蛋白偶联物的反应的OD450值为2.4651-2.4691，与1-(4-异硫氨酸苄基)-乙二胺四乙酸-牛血清白蛋白反应的OD450值为0.056-0.0057，与BSA反应的OD450值为0-0.005；对汞-乙二胺四乙酸的交叉反应性为100％，对铅-乙二胺四乙酸、锌-乙二胺四乙酸、镉-乙二胺四乙酸、镁-乙二胺四乙酸、铜-乙二胺四乙酸、乙二胺四乙酸的交叉反应性均<10％。
本发明的单克隆抗体滴度高、特异性强，能特异性识别汞-1-(4-异硫氨酸苄基)-乙二胺四乙酸-牛血清白蛋白偶联物和汞-乙二胺四乙酸。
本发明还提供一种制备抗汞螯合物单克隆抗体的方法，所述方法包括下述步骤：
(1)制备免疫抗原汞-1-(4-异硫氨酸苄基)-乙二胺四乙酸-钥孔戚血蓝素和包被抗原汞-1-(4-异硫氨酸苄基)-乙二胺四乙酸-牛血清白蛋白；
(2)将步骤(1)制备的免疫抗原免疫小鼠；
(3)将免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合并培养；
(4)采用竞争抑制法和包被抗原筛选阳性克隆的杂交瘤细胞；
(5)鉴定上述步骤得到的杂交瘤细胞所分泌的单克隆抗体。
由于汞离子毒性较强而不能直接用作免疫原，所以制备抗汞离子的单克隆抗体难以制备。本发明制备抗汞螯合物单克隆抗体的方法利用特异性的双功能螯合剂螯合汞离子，成为能被动物免疫系统识别的汞-螯合剂复合物，再将之与载体蛋白偶联，形成完整的免疫抗原。将免疫抗原用于制备单克隆抗体，得到滴度高、特异性强的抗汞螯合物单克隆抗体。
作为本发明制备抗汞螯合物单克隆抗体的方法的优选实施方式，所述步骤(1)包括下述步骤：
A、将牛血清白蛋白、钥孔戚血蓝素分别溶于pH9.5的磷酸盐缓冲液，浓度为4～6mg/mL；
B、将10mg螯合剂溶于0.1mol/L，pH9.5的磷酸钠缓冲溶液，浓度为18-22mg/mL，所述螯合剂为1-(4-异硫氨酸苄基)-乙二胺四乙酸；
C、按照1:1的摩尔比，将螯合剂和Hg2+溶液混合，用氨水调节pH至7.0-8.0，在20-30℃下搅拌反应12-36小时，合成半抗原；
D、取步骤C得到的2-4mg半抗原分别与等质量的步骤A得到的牛血清白蛋白和钥孔戚血蓝素混合，分别用氨水调pH至8.5-9.5，在20-30℃下搅拌反应12-36小时，分别合成包被抗原汞-1-(4-异硫氨酸苄基)-乙二胺四乙酸-牛血清白蛋白和免疫抗原汞-1-(4-异硫氨酸苄基)-乙二胺四乙酸-钥孔戚血蓝素。
抗原的制备中，控制各种溶液的浓度配比是关键，合适的方法可以达到提高偶联率的作用。
作为本发明优选实施方式，制备抗汞螯合物单克隆抗体的方法所述步骤(3)中，将免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞以5～12:1混合，1分钟内加入50％聚乙二醇融合，然后在120秒之内缓慢加入培养液，静置10分钟，离心，采用常规方法培养。作为本发明进一步的优选实施方式，所述免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞以12:1混合。
在本发明抗汞螯合物单克隆抗体的制备方法中，细胞融合的操作也是一个关键点。发明人还意外发现，当采用免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞以12:1混合时，其融合率有大的提高。
本发明还提供了一种检测汞离子浓度的方法，其包括如下步骤：
(1)以抗汞螯合物单克隆抗体与抗原反应后在450nm的OD值为纵坐标Y，以汞离子的浓度为横坐标X，建立检测的标准曲线，线性方程为：y＝-0.0118x+0.7981，线性相关系数R2＝0.9941；
(2)将待测样品螯合螯合剂，所述螯合剂为1-(4-异硫氨酸苄基)-乙二胺四乙酸；
(3)将抗汞螯合物单克隆抗体与检测样品反应，测定反应液在450nm的OD值；
(4)将步骤(3)得到的OD值代入步骤(1)的方程式中，得到检测样品的汞离子浓度。
汞离子能与蛋白质发生强烈的不可逆反应，导致蛋白质变性，因此，利用单克隆抗体无法直接识别并检测样品中的汞离子。本发明先利用螯合剂将汞离子螯合，形成能被特异性单克隆抗体识别的汞螯合物，建立汞离子螯合物免疫学检测方法。该方法检测速度快、费用低廉、灵敏度高并且选择性强。本发明检测汞离子浓度的方法不仅能为食品安全检测，还能为我国农产品等的出入境检测、环境监测提供有效的技术手段和检测方法。
附图说明
图1为本发明实施例2中牛血清白蛋白、半抗原Hg-ITCBE及偶联物的紫外扫描图；
图2为本发明实施例2中钥孔戚血蓝索、半抗原Hg-ITCBE及偶联物的紫外扫描图；
图3为本发明实施例2中利用Hg-ITCBE-BSA、ITCBE-BSA包被的一次阳性克隆的筛选结果；
图4为本发明实施例2中阳性细胞株3C9G12的竞争抑制结合曲线；
具体实施方式
为使本发明更加容易理解，下面将进一步阐述本发明的具体实施例。
Hg2+标准溶液[Hg(NO3)2]，购于中国国家标准物质研究中心；1-(4-异硫氰酸苄基)乙二胺四乙酸[1-(4-isothiocyatiobetmyl)-elhylenediamine-N，N，N’，N’-tetraacetic acid，ITCBE]，购于上海同仁化学研究所；羟乙基哌嗪乙磺酸(hydroxyethylpi perazine ethanesufonic acid，Hepes)，牛血清白蛋白(bovine serumabumin，BSA)，钥孔戚血蓝素(keyhole limpet hemocyanin，KLH)均为Sigma产品。
实施例1
(1)将BSA(牛血清白蛋白)、KLH(钥孔戚血蓝素)分别溶于pH9.5的PBS(磷酸盐缓冲液)，浓度均为4mg/mL；
(2)将10mg螯合剂ITCBE溶于0.1mol/L，pH9.5的磷酸纳缓冲溶液，浓度为18mg/mL；
(3)半抗原Hg-ITCBE的合成：将1000μL 1mg/mLHg2+标准溶液添加至2000μL 4.6mM螯合剂溶液中，用氨水调节pH至7.0，在20℃下，搅拌反应12h；
(4)免疫原Hg-ITCBE-KLH的合成：取2mg半抗原，再加入2mg KLH，并用氨水调节pH至8.5，在20℃搅拌反应12h。
(5)包被抗原Hg-ITCBE-BSA的合成：取2mg半抗原，再加入2mg BSA，并用氨水调节pH至8.5，在20℃搅拌反应12h。
(6)免疫原及抗原的纯化：偶联反应后，在4℃下使用centeicon-30超滤离心管离心除去未反应的小分子物质。Centeicon-30超滤离心管在使用前，用100mmol/L EDTA和pH7.4的HEPES各清洗3次。顺式离心6次，离心力4500g，每次离心I0min，每次添加0.1molI/L pH 9.0HEPES的体积依次为2mL：反转离心3次，离心力为800g，每次离心2min，每次添加0.1mol/L，pH 7.4HEPES的体积依次为200μL。
(7)免疫原及抗原的鉴定：将纯化后的免疫原及抗原稀释100倍，用BCA法测浓度。对于BSA及其相应的抗原，用0.1mol/L，pH 7.4HEPES稀释1mg/mL，对于KLH及其相应的抗原，用0.1mol/L，pH 7.4HEPES稀释0.5mg/mL，将合成后的半抗原稀释20倍，在220-310nm的波长下分别对Hg-ITCBE、载体蛋白以及偶联物进行扫描，以定性证明抗原合成是否成功：用0.1mol/L、pH8.5 NaHCO3溶液将偶联物稀释80倍，用三硝基苯磺酸法(TS)检测偶联物和载体蛋白中氨基含量，通过对比，以制定Hg-ITCBE(ITCBE)与载体蛋白的偶联比：用0.1mol/L，pH 7.4 HEPES将偶联物稀释200倍，用石墨炉原子分光吸收法检测偶联物中Hg2+的含量。
(8)动物免疫：选择6-8周龄，30g左右的BALB/c小鼠8只，首免用0.9％氯化铀注射液稀释Hg-ITCBE-KLH至1mg/mL，与等体积的完全福氏佐剂混匀，50μg Hg-ITCBE-KLH/鼠。3周后，用Hg-ITCBE-KLH加等体积的不完全福氏佐剂混匀，50μg Hg-ITCBE-KLH/鼠。再过3周，用0.9％氯化铀注射液等体积混匀，50μg Hg-ITCBE-KLH/鼠。第四次，用0.9％氯化铀注射液等体积混匀，50μg Hg-ITCBE-KLH/鼠。
单抗制备过程：无菌取BALB/c鼠脾细胞与SP20骨髓瘤细胞，以5:1混合，1分钟内加入50％PEG融合，90秒内加入30ml1640培养液静置10分钟，离心，离心沉淀物加入含HAT和小鼠腹腔巨噬细胞的1640培养液，96孔培养，Hg-ITCBE-BSA、ITCBE-BSA包被酶标板，初步筛选阳性克隆，然后利用各种金属螯合物对阳性克隆孔进一步筛选，移植降植烷处理的BAB/c鼠制备抗体、鉴定。
采用二步筛选法：对细胞融合和阳性克隆的筛选，包被Hg-ICBE-BSA、ITCBE-BSA、BSA对细胞培养上清液进行检测，筛选出对Hg-ITCBE-BSA呈强阳性反应，对ITCBE-BSA、BSA呈阴性反应的阳性孔：然后用EDTA、Hg-EDTA、Pb-EDTA、Zn-EDTA、Mn-EDTA、Fe-EDTA、Cd-EDTA等金属螯合物竞争抑制Hg-ITCBE-BSA与阳性孔上清液所含抗体的结合反应，对阳性孔进一步鉴定，筛选出Hg-EDTA能造成强烈抑制作用，EDTA、Pb-EDTA、Zn-EDTA等金属擎合物无抑制作用的阳性孔，及时转种并进行克隆化，
(9)腹水的制备与纯化
取8周的BALB/c小鼠，用液体石蜡腹腔注射0.5ml/只，7天后腹腔接种用无血清培养基稀释的处于对数生长期的杂交瘤细胞，每只小鼠注射细胞数为1×106个，间隔4天后，每天观察小鼠腹水产生情况，待小鼠腹部膨大，精神变差，濒死不动时，用16号针头无菌采集腹水。将腹水离心，上清液即为汞螯合物单克隆抗体，ELISA测定效价为1:20000，分装，-70℃冻存备用。用硫酸铵沉淀法加蛋白质M亲和层析柱纯化。
实施例2
(1)将BSA、KLH分别溶于pH 9.5的PBS，浓度均为5mg/mL。
(2)将10mg螯合剂ITCBE溶于0.1mol/L，pH9.5的磷酸纳缓冲溶液，浓度为20mg/mL。
(3)半抗原Hg-ITCBE的合成：将1000μL 1mg/LHg2+标准溶液添加至2000μL 4.6mM螯合剂溶液中，用氨水调节pH至7.5，在25℃下，搅拌反应24h。
(4)免疫原Hg-ITCBE-KLH的合成：取3mg半抗原，再加入3mgKLH，并用氨水调节pH至9.0，在25℃搅拌反应24h。
(5)包被抗原Hg-ITCBE-BSA的合成：取3mg半抗原，再加入3mg BSA，并用氨水调节pH至9.0，在25℃搅拌反应24h。
(6)免疫原及抗原的纯化：偶联反应后，在4℃下使用Centeicon-30超滤离心管离心除去未反应的小分子物质。Centeicon-30超滤离心管在使用前，用100mmol/L。EDTA和pH7.4的HEPES各清洗3次。顺式离心6次，离心力4500g，每次离心10min，每次添加0.1mol，pH 9.0HPES的体积依次为2m；反转离心3次，离心力为800g，每次离心2min，每次添加0.1mol/L，pH7.4HEPES的体积依次为200μL。
(7)免疫原及抗原的鉴定：将纯化后的免疫原及抗原稀释100倍，用BCA法测浓度。对于BSA及其相应的抗原，用0.1mol/L，pH 7.4HEPES稀释1mg/mL，对于KLH及其相应的抗原，用0.1mol/L，pH 7.4HEPES稀释0.5mg/mL，将合成后的半抗原稀释20倍，在220-310nm的波长下分别对Hg-ITCBE、载体蛋白以及偶联物进行扫描，以定性证明抗原合成是否成功：用0.1mol/L、pH8.5 NaHCO3溶液将偶联物稀释80倍，用三硝基苯磺酸法(TS)检测偶联物和载体蛋白中氨基含量，通过对比，以制定Hg-ITCBE(ITCBE)与载体蛋白的偶联比：用0.1mol/L，pH 7.4HEPES将偶联物稀释200倍，用石墨炉原子分光吸收法检测偶联物中Hg2+的含量，
(8)动物免疫：选择6-8周龄，30g左右的BALB/c小鼠8只，首免用0.9％氯化铀注射液稀释Hg-ITCBE-KLH至1mg/mL，与等体积的完全福氏佐剂混匀，50μg Hg-ITCBE-KLH/鼠。3周后，用Hg-ITCBE-KLH加等体积的不完全福氏佐剂混匀，50μg Hg-ITCBE-KLH/鼠。再过3周，用0.9％氯化铀注射液等体积混匀，50μg Hg-ITCBE-KLH/鼠。第四次，用0.9％氯化铀注射液等体积混匀，50μg Hg-ITCBE-KLH/鼠。
单抗制备过程：无菌取BALB/c鼠脾细胞与SP20骨髓瘤细胞，以10:1混合，1分钟内加入50％PEG融合，120秒内加入30ml 1640培养液静置10分钟，离心，离心沉淀物加入含HAT和小鼠腹腔巨噬细胞的1640培养液，96孔培养，Hg-ITCBE-BSA、ITCBE-BSA包被酶标板，初步筛选阳性克隆，然后利用各种金属螯合物对阳性克隆孔进一步筛选，移植降植烷处理的BAB/c鼠制备抗体、鉴定。
采用二步筛选法：对细胞融合和阳性克隆的筛选，包被Hg-ICBE-BSA、ITCBE-BSA、BSA对细胞培养上清液进行检测，筛选出对Hg-ITCBE-BSA呈强阳性反应，对ITCBE-BSA、BSA呈阴性反应的阳性孔：然后用EDTA、Hg-EDTA、Pb-EDTA、Zn-EDTA、Mn-EDTA、Fe-EDTA、Cd-EDTA等金属螯合物竞争抑制Hg-ITCBE-BSA与阳性孔上清液所含抗体的结合反应，对阳性孔进一步鉴定，筛选出Hg-EDTA能造成强烈抑制作用，EDTA、Pb-EDTA、Zn-EDTA等金属擎合物无抑制作用的阳性孔，及时转种并进行克隆化，
(9)腹水的制备与纯化
取8周的BALB/c小鼠，用液体石蜡腹腔注射0.5ml/只，7天后腹腔接种用无血清培养基稀释的处于对数生长期的杂交瘤细胞，每只小鼠注射细胞数为2 X 106个，间隔4天后，每天观察小鼠腹水产生情况，待小鼠腹部膨大，精神变差，濒死不动时，用16号针头无菌采集腹水。将腹水离心，上清液即为汞螯合物单克隆抗体，ELISA测定效价为1:20000，分装，-70℃冻存备用。用硫酸铵沉淀法加蛋白质M亲和层析柱纯化。
图1为实施例中牛BSA、Hg-ITCBE及Hg-ITCBE-BSA的紫外扫描图。如图1所示，BSA的最大吸收波长为235nm和280nm，Hg-ITCBE的紫外吸收在波长240n～280n范围内属于高吸收值区域，与BSA相比，Hg-ITCBE-BSA最大吸收波长和吸收值均发生变化，在波长240n-280n范围内的吸收值增大，紫外吸收特征具有BSA和半抗原Hg-ITCBE的吸收特征，定性证明抗原Hg-ITCBE-BSA合成成功。
图2为实施例2中KLH、Hg-ITCBE及Hg-ITCBE-KLH的紫外扫描图。如图2所示，KLH的最大吸收波长为235nm和280nm，Hg-ITCBE的紫外吸收在波长240nm～280nm范围内属于高吸收值区域，与KLH相比，Hg-ITCBE-KLH在最大吸收波长280nm处的吸收值增大，在波长240nm-280nm范围内的吸收值增大，紫外吸收特征具有KLH和半抗原Hg-ITCBE的吸收特征，定性证明抗原Hg-ITCBE-KLH合成成功。
图3为实施例2中利用Hg-ITCBE-BSA、ITCBE-BSA包被的二次阳性克隆的筛选结果。如图3所示，阳性克隆孔中的抗体经过间接ELISA检测，能识别抗原Hg-ITCBE-BSA，反应的OD值高，呈现强阳性，几乎无法识别ITCBE-BSA，反应的OD值很低，接近于0，呈现阴性，经过排除筛选法的鉴定，证明二次阳性克隆孔中的抗体是汞螯合物特异性的。
图4为为实施例2中阳性细胞株3C9G12的竞争抑制结合曲线。如图4所示，不同的金属螯合物或EDTA对细胞株3C9G12中的抗体识别抗原Hg-ITCBE-BSA的抑制作用不同，只有Hg-EDTA能与Hg-ITCBE-BSA竞争结合3C9G12中的抗体，而EDTA、Pb-EDTA、Cd-EDTA、Zn-EDTA对Hg-ITCBE-BSA识别3C9G12中的抗体无抑制作用或抑制作用很低，这进一步说明该孔中的抗体是汞螯合物特异性的。
实施例3
(1)将BSA、KLH分别溶于pH 9.5的PBS，浓度均为6mg/mL。
(2)将10mg螯合剂ITCBE溶于0.1mol/L，pH9.5的磷酸纳缓冲溶液，浓度为20mg/mL。
(3)半抗原Hg-ITCBE的合成：将1000μL 1mg/LHg2+标准溶液添加至2000μL4.6mM螯合剂溶液中，用氨水调节pH至7.5，在25℃下，搅拌反应36h。
(4)免疫原Hg-ITCBE-KLH的合成：取3mg半抗原，再加入3mgKLH，并用氨水调节pH至9.0，在25℃搅拌反应36h。
(5)包被抗原Hg-ITCBE-BSA的合成：取3mg半抗原，再加入3mg BSA，并用氨水调节pH至9.0，在25℃搅拌反应36h。
(6)免疫原及抗原的纯化：偶联反应后，在4℃下使用centeicon-30超滤离心管离心除去未反应的小分子物质。Centeicon-30超滤离心管在使用前，用100mmol/L。EDTA和pH7.4的HEPES各清洗3次。顺式离心6次，离心力4500g，每次离心10min，每次添加0.1mol，pH 9.0HPES的体积依次为2m；反转离心3次，离心力为800g，每次离心2min，每次添加0.1mol/L，pH 7.4HEPES的体积依次为200μL。
(7)免疫原及抗原的鉴定：将纯化后的免疫原及抗原稀释100倍，用BCA法测浓度。对于BSA及其相应的抗原，用0.1mol/L，pH7.4 HEPES稀释1mg/mL，对于KLH及其相应的抗原，用0.1mol/L，pH 7.4HEPES稀释0.5mg/mL，将合成后的半抗原稀释20倍，在220-310nm的波长下分别对Hg-ITCBE、载体蛋白以及偶联物进行扫描，以定性证明抗原合成是否成功：用0.1mol/L、pH8.5NaHCO3溶液将偶联物稀释80倍，用三硝基苯磺酸法(TS)检测偶联物和载体蛋白中氨基含量，通过对比，以制定Hg-ITCBE(ITCBE)与载体蛋白的偶联比；用0.1mol/L，pH 7.4HEPES将偶联物稀释200倍，用石墨炉原子分光吸收法检测偶联物中Hg2+的含量。
(8)动物免疫：选择6-8周龄，30g左右的BALB/c小鼠8只，首免用0.9％氯化铀注射液稀释Hg-ITCBE-KLH至1mg/mL，与等体积的完全福氏佐剂混匀，50μg Hg-ITCBE-KLH/鼠。3周后，用Hg-ITCBE-KLH加等体积的不完全福氏佐剂混匀，50μg Hg-ITCBE-KLH/鼠。再过3周，用0.9％氯化铀注射液等体积混匀，50μg Hg-ITCBE-KLH/鼠。第四次，用0.9％氯化铀注射液等体积混匀，50μg Hg-ITCBE-KLH/鼠，
单抗制备过程：无菌取BALB/c鼠脾细胞与SP20骨髓瘤细胞，以12:1混合，1分钟内加入50％PEG融合，120秒内加入30ml1640培养液静置10分钟，离心，离心沉淀物加入含HAT和小鼠腹腔巨噬细胞的1640培养液，96孔培养，Hg-ITCBE-BSA、ITCBE-BSA包被酶标板，初步筛选阳性克隆，然后利用各种金属黯合物对阳性克隆孔进一步筛选，移植降植烷处理的BAB/c鼠制备抗体、鉴定。在本发明抗汞螯合物单克隆抗体的制备方法中，细胞融合的操作也是一个关键点。发明人还意外发现，当采用免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞以12:1混合时，其融合率提高了约15％。
采用二步筛选法：对细胞融合和阳性克隆的筛选，包被Hg-ICBE-BSA、ITCBE-BSA、BSA对细胞培养上清液进行检测，筛选出对Hg-ITCBE-BSA呈强阳性反应，对ITCBE-BSA、BSA呈阴性反应的阳性孔：然后用EDTA、Hg-EDTA、Pb-EDTA、Zn-EDTA、Mn-EDTA、Fe-EDTA、Cd-EDTA等金属螯合物竞争抑制Hg-ITCBE-BSA与阳性孔上清液所含抗体的结合反应，对阳性孔进一步鉴定，筛选出Hg-EDTA能造成强烈抑制作用，EDTA、Pb-EDTA、Zn-EDTA等金属螯合物无抑制作用的阳性孔，及时转种并进行克隆化，
(9)腹水的制备与纯化
取8周的BALB/c小鼠，用液体石蜡腹腔注射0.5ml/只，7天后腹腔接种用无血清培养基稀释的处于对数生长期的杂交瘤细胞，每只小鼠注射细胞数为5X 106个，间隔4天后，每天观察小鼠腹水产生情况，待小鼠腹部膨大，精神变差，濒死不动时，用16号针头无菌采集腹水。将腹水离心，上清液即为汞螯合物单克隆抗体，ELISA测定效价为1:5000，分装，-70℃冻存备用。用硫酸铵沉淀法加蛋白质M亲和层析柱纯化。
实施例4
偶联物鉴定：所得的偶联物进行紫外扫描分析见图1，与载体蛋白KLH(BSA)相比，Hg-ITCBE-KLH、Hg-ITCBE-BSA的紫外吸收光谱均携带了半抗原Hg-EDTA的紫外吸收特征，证明偶联成功。
实施例5
单抗针对汞整合物决定簇的鉴定：部分强阳性孔上清1:4稀释，用Hg-ITCBE-BSA、ITCBE-BSA分别包被酶标板进行ELISA检测，其中Hg-ITCBE-BSA偶联物的OD450值远远超过ITCBE-BSA的OD450值，并且ITCBE-BSA、BSA的OD450非常低，几乎为0。说明该克隆的产生的抗体是针对汞螯合物决定簇的，特异性强。该克隆命名为3C9G12。
表1：用Hg-ITCBE-BSA、ITCBE-BSA、BSA对部分强阳性克隆分泌抗体进行ELISA筛选的结果
实施例6
单克隆抗体特异性鉴定：梯度稀释Hg-EDTA、Pb-EDTA、Zn-EDTA、Cd-EDTA、Mn-EDTA、Cu-EDTA、EDTA；包被抗原Hg-ITCBE-BSA，100μL/孔，4℃吸附过夜：洗板3次，加入100μL 1％BSA封闭，37℃温育1h，洗板3次：加入100μL金属整合物<或EDTA)稀释液和100μL单克隆抗体稀释液(1：4000)，37℃ 2h，洗板3次：加入1:2000稀释的酶标二抗<羊抗鼠IgG-H)，370温育45min，洗板3次，加底物反应，30min后终止反应，检测OD450。分别作抑制曲线，根据拟合曲线计算半数抑制率，然后计算金属螯合物的交叉反应率<交叉反应性＝产生50％抑制时Hg-EDTA的浓度/产生50％抑制时的其它金属接合物的浓度)，见表2。
3C9G12细胞株产生的抗体除了Hg-EDTA外，对几种结构相似的Pb-EDTA、Zn-EDTA、Cd-EDTA、岛位-EDTA、Cu-EDTA或螯合剂EDTA基本无交叉反应性，见图4。
表2 与各种金属螯合物的交叉反应性
实施例7
检测标准曲线的建立：用EDTA溶液将1mg/mL汞离子的标准溶液稀释100μg/L、80μg/L、60μg/L、40μg/L、20μg/L、10μg/L、5μg/L，摇匀，在常温下反应24h，制得Hg-EDTA螯合物标准熔液。包被抗原Hg-ITCBE-BSA(1mg/L)，100μL/孔，4DC吸附过夜：洗板3次，加入100μL 1％BSA封闭，37℃温育1h，洗板3次：加入100μL金属螯合物(EDTA)稀释液和100μL单克隆抗体稀释液(1:2000)，37℃温育2h，洗板3次；加入1:2000稀释的酶标二抗<羊抗鼠IgG-HRP)，37℃温育45m，洗板3次，加底物反应，30min后终止反应，检测OD450。
以OD450的OD值为纵坐标(Y)，汞离子的浓度<μg/L)为横坐标(X)，建立检测的标准曲线，线性方程为：y＝-0.0118x+0.7981，R2＝0.9941。
取湖水为样品，离心，取上清液体，添加用100mM EDTA溶液稀释100倍，添加汞离子标准溶液，使Hg2+浓度为20μg/L，制备得待检测样品溶液，包被抗原Hg-ITCBE-BSA(1mg/mL)，100μL/孔，4℃吸附过夜：洗板3次，加入100μL 1％BSA封闭，37℃温育1h，洗板3次：加入100μL金属整合物(EDTA)稀释液和100μL单克隆抗体稀释液(1:2000)，37℃温育2h，洗板3次：加入1:2000稀释的酶标二抗<羊抗鼠IgG-HRP)，37℃温育45mn，洗板3次，加底物反应，30min后终止反应，检测OD450为0.4567，1-0.4567＝0.5433，将0.5433代入线性方程Y＝-0.0118X+0.7981，得到废水中汞离子的浓度为21.59±1.35μg/L，回收率达到108.0±6.75％，准确度高，可以用于实际样品检测。
利用国标GB/5009.15-2003石墨炉原子分光吸收法检测，检测结果较为准确，但检测时间较长，需要48小时，并且需要消耗大量的样品，而本发明中所述的方法检测时间较短，在包被ELISA板已经完成的条件下，只需4～6小时即可获得检测结果，并且成本比石墨炉原子分光吸收法要低，所用仪器简单，无需大型设备。
本发明为建立快速检测环境及农畜产品体内残留Hg2+提供了关键技术。与现有技术相比，具有如下优点和有益效果：
1、利用本发明中的抗体和检测技术对农畜产品中的汞残留进行检测，只需4～6个小时即可得出检测结果，检测速度快，由于抗体的效价高，稀释10000倍以上仍可用于实际检测，检测成本低：
2、利用本发明中的抗体和检测技术对农畜产品中的汞残留进行检测，将检测结果与国标方法比较，检测结果准确，很少受其他金属离子的干扰，假阳性低，检测下限可低至0.4μg/L，灵敏度高，选择性强：
3、利用本发明中的抗体和检测技术对农畜产品中的汞残留进行检测，只需一台酶标仪即可检测，简单易携，并可用于现场检测。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (7)
1.一种单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体对汞螯合物具有特异性，所述的汞螯合物为汞-1-(4-异硫氨酸苄基)-乙二胺四乙酸-牛血清白蛋白偶联物和汞-乙二胺四乙酸。
2.如权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述的单克隆抗体与汞-1-(4-异硫氨酸苄基)-乙二胺四乙酸-牛血清白蛋白偶联物的反应的OD450值为2.4651-2.4691，与1-(4-异硫氨酸苄基)-乙二胺四乙酸-牛血清白蛋白反应的OD450值为0.056-0.0057，与牛血清白蛋白反应的OD450值为0-0.005；对汞-乙二胺四乙酸的交叉反应性为100％，对铅-乙二胺四乙酸、锌-乙二胺四乙酸、镉-乙二胺四乙酸、镁-乙二胺四乙酸、铜-乙二胺四乙酸、乙二胺四乙酸的交叉反应性均<10％。
3、一种制备抗汞螯合物单克隆抗体的方法，其特征在于，所述方法包括下述步骤：
(1)制备免疫抗原汞-1-(4-异硫氨酸苄基)-乙二胺四乙酸-钥孔戚血蓝素和包被抗原汞-1-(4-异硫氨酸苄基)-乙二胺四乙酸-牛血清白蛋白；
(2)将步骤(1)制备的免疫抗原免疫小鼠；
(3)将免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合并培养；
(4)采用竞争抑制法和包被抗原筛选阳性克隆的杂交瘤细胞；
(5)鉴定上述步骤得到的杂交瘤细胞所分泌的单克隆抗体。
4、如权利要求3所述抗汞螯合物单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)包括下述步骤：
A、将牛血清白蛋白、钥孔戚血蓝素分别溶于pH9.5的磷酸盐缓冲液，浓度为4～6mg/mL；
B、将10mg螯合剂溶于0.1mol/L，pH9.5的磷酸钠缓冲溶液，浓度为18-22mg/mL，所述螯合剂为1-(4-异硫氨酸苄基)-乙二胺四乙酸；
C、按照1:1的摩尔比，将螯合剂和Hg2+溶液混合，用氨水调节pH至7.0-8.0，在20-30℃下搅拌反应12-36小时，合成半抗原；
D、取步骤C得到的2-4mg半抗原分别与等质量的步骤A得到的牛血清白蛋白和钥孔戚血蓝素混合，分别用氨水调pH至8.5-9.5，在20-30℃下搅拌反应12-36小时，分别合成包被原汞-1-(4-异硫氨酸苄基)-乙二胺四乙酸-牛血清白蛋白和免疫抗原汞-1-(4-异硫氨酸苄基)-乙二胺四乙酸-钥孔戚血蓝素。
5、根据权利要求2或3所述抗汞螯合物单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，将免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞以5～12:1混合，1分钟内加入50％聚乙二醇融合，然后在120秒之内缓慢加入培养液，静置10分钟，离心，采用常规方法培养。
6、根据权利要求5所述抗汞螯合物单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞以12:1混合。
7、一种检测汞离子浓度的方法，其特征在于，其包括如下步骤：
(1)以抗汞螯合物单克隆抗体与抗原反应后在450nm的OD值为纵坐标Y，以汞离子的浓度为横坐标X，建立检测的标准曲线，线性方程为：y＝-0.0118x+0.7981，线性相关系数R2＝0.9941；
(2)将待测样品螯合螯合剂，所述螯合剂为1-(4-异硫氨酸苄基)-乙二胺四乙酸；
(3)将抗汞螯合物单克隆抗体与检测样品反应，测定反应液在450nm的OD值；
(4)将步骤(3)得到的OD值代入步骤(1)的方程式中，得到检测样品的汞离子浓度。
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