CN101914154A - 一种Hg2+抗原和相应单克隆抗体及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种Hg2+抗原和相应单克隆抗体，同时还提供了该抗原及单克隆抗体的制备方法，将Hg2+与螯合剂Aminobenzyl-EDTA螯合，通过戊二醛与血蓝蛋白(KLH)偶联，超滤，得到Hg2+完全免疫抗原；用其免疫BALB/c小鼠，取该小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合，筛选出Hg2+的特异性单克隆抗体。该抗体可用于检测Hg2+的ELISA试剂盒、试纸条的开发，具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明公开一种Hg2+抗原和相应单克隆抗体，同时还提供了该抗原及单克隆抗体的制备方法，属于免疫学方法检测技术领域。
背景技术
在现代工业和日常生活中，汞的用途非常广泛，现在世界上约有80多种工业生产需要用汞作为原料。汞以“工业三废”的形式进入自然环境，不仅对自然环境造成了严重的污染，而且影响了农产品的质量，并可通过食物链及生物富集作用，最后进入人体内部。鉴于汞元素对身体极大的危害性，世界卫生组织将汞列为首要考虑的环境污染物。世界各国都十分重视环境和农产品汞污染的控制和监测。CAC规定了矿泉水中与食用盐中的汞的限量标准分别为0.001mg/kg和0.1mg/kg；欧盟对某些鱼类及其产品制定汞的限量标准为1mg/kg和0.5mg/kg；我国也制定了相应的食品卫生标准：粮食(成品粮)≤0.02mg/kg；薯类(土豆、白薯)、蔬菜、水果≤0.01mg/kg；肉、蛋(去壳)≤0.05mg/kg；牛乳≤0.01mg/kg。目前测定汞的方法主要有分光光度法、原子吸收法、原子荧光法、ICP-AES、ICP-MS。这些方法需要昂贵的分析仪器，无法用于现场检测，难以适应环境及农畜产品的现场抽查及产品进出口快速通关的要求。
为了克服以上检测方法的缺点，国内外都开展了重金属快速免疫检测技术的研究。与其它检测系统相比，免疫检测方法具有快速、廉价、简便、灵敏、特异和便携等优点，可以满足环境和农产品现场检测的需要，对提高我国环境和农产品重金属污染的控制和监测水平以及保障农产品质量安全和消费者的健康具有重要意义。
基于金属螯合物抗体的免疫检测方法为重金属检测提供了一种新的策略。建立重金属快速免疫学检测方法的关键在于重金属特异性单克隆抗体的制备，而重金属特异性单克隆抗体制备的关键在于重金属完全抗原的制备。重金属离子的分子量小，自身不能作为完全抗原诱导机体产生免疫反应。但是，重金属离子与螯合剂反应后所形成的重金属-螯合剂复合物是低分子量的半抗原，此半抗原与大分子的载体蛋白如钥孔血蓝蛋白、牛血清白蛋白、卵清蛋白等偶联形成的载体蛋白-螯合剂-重金属复合物便可作为一种完全抗原诱导小鼠发生免疫反应。因此选用结构较复杂的大分子双功能螯合剂，先与重金属离子螯合形成螯合剂-重金属复合物，再与载体蛋白偶联，即可得到完全抗原：载体蛋白-螯合剂-重金属。
目前尚无用双功能螯合剂Aminobenzyl-EDTA制备Hg2+完全免疫抗原及相应特异性单克隆抗体的报道。
发明内容
本发明提供了一种Hg2+完全免疫抗原，可用于制备重金属Hg2+的单克隆抗体。
本发明还提供了Hg2+抗原的相应单克隆抗体，对Hg2+具有特异性。
本发明进一步公开了Hg2+抗原和相应单克隆抗体的制备方法，该方法制备的抗原、单克隆抗体稳定性好、实用性强。
本发明公开的Hg2+完全免疫抗原，其特征在于：
完全免疫抗原紫外吸收峰值为225nm～300nm，Hg含量达57.15μg/mg，紫外扫描结果见图1。
上述Hg2+完全免疫抗原的制备方法，包括以下步骤：
称取2.6mg螯合剂Aminobenzyl-EDTA溶于0.22-0.28ml10mg/ml、pH6.0-7.0的Hg(NO3)2溶液中，37℃搅拌反应1小时，然后加入pH6.0-7.0、1％戊二醛溶液1ml，37℃搅拌反应0.5小时；将上述反应后的混合液逐滴加入到2ml浓度为5mg/ml的KLH溶液中，边加边搅拌；调节pH值为6.0-7.0，37℃搅拌反应18小时，选用截留分子量为30000dal的超滤离心管、7500g超滤6次，洗涤液为0.1M、pH6.0-7.0的Hepes缓冲液，每次离心15min；超滤完毕后，补加0.1M、pH6.0-7.0的Hepes溶液，使KLH终浓度为1mg/ml，制备出完全免疫抗原。
本发明公开的Hg2+抗原的单克隆抗体对Hg2+具有特异性。
上述Hg2+抗原的单克隆抗体的制备方法，其特征在于：用以上步骤得到的完全免疫抗原免疫BALB/c小鼠，选择对BSA-Aminobenzyl-EDTA-Hg血清效价高、对BSA-Aminobenzyl-EDTA血清效价低的小鼠加强免疫，将其脾细胞与骨髓瘤细胞融合；采用间接ELISA法筛选杂交瘤细胞株，只保留对BSA-Aminobenzyl-EDTA-Hg反应为强阳性、对BSA-Aminobenzyl-EDTA反应为阴性、对其它金属离子无交叉反应的细胞株。
在上述Hg2+抗原的单克隆抗体的制备方法中，采用的免疫方法为：
首免：取100μl 1mg/ml的Hg2+完全免疫抗原，加入10μl 1mg/ml、pH6.0-7.0的Hg(NO3)2溶液振荡2分钟，然后加入弗氏完全佐剂110μl，乳化，供1只小鼠1次腹腔注射免疫；
二免及以后免疫：取100μl 1mg/ml的Hg2+完全免疫抗原，加入10μl 1mg/ml、pH6.0-7.0的Hg(NO3)2溶液振荡2分钟，然后加入弗氏不完全佐剂110μl，乳化，供1只小鼠1次腹腔注射免疫，每两周免疫一次。
本发明的积极效果在于：制备的抗原及相应单克隆抗体可以制成重金属Hg2+快速检测试剂盒、胶体金免疫层析试纸或传感器，为重金属汞免疫检测技术的研究解决了一个技术难题。该方法制备的抗原稳定性好、实用性强，为进出口检验检疫部门、食品卫生部门、水产养殖检测部门、环保部门等部门提供新的方便、实用、简易、快速检测工具，具有良好的经济价值、社会效益和广阔的市场前景。
附图说明：
图1为KLH-Aminobenzyl-EDTA-Hg、KLH的紫外光谱检测结果图。
图2为BSA-Aminobenzyl-EDTA-Hg、BSA-Aminobenzyl-EDTA、BSA的紫外光谱检测结果图。
具体实施方式
实施例1
1.免疫抗原KLH-Aminobenzyl-EDTA-Hg的制备及检测
(1)免疫抗原KLH-Aminobenzyl-EDTA-Hg的制备
称取2.6mg螯合剂Aminobenzyl-EDTA溶于0.241ml 10mg/ml、pH6.5的Hg(NO3)2溶液中，37℃搅拌反应1小时，然后加入pH6.5、1％戊二醛溶液1ml，37℃搅拌反应0.5小时。将上述反应后的混合液逐滴加入到2ml浓度为5mg/ml的KLH溶液中，边加边搅拌。调节pH值为6.5，37℃搅拌反应18小时，选用截留分子量为30000dal的超滤离心管，7500g超滤6次，洗涤液为0.1M、pH6.5的Hepes溶液，每次离心15min。超滤完毕后，补加0.1M、pH6.5的Hepes溶液，使KLH终浓度为1mg/ml。免疫抗原制备完毕，分装，-20℃保存。
(2)免疫抗原KLH-Aminobenzyl-EDTA-Hg的检测
①完全免疫抗原KLH-Aminobenzyl-EDTA-Hg的紫外分光光度法检测
对完全抗原进行190～500nm全波长扫描，结果表明完全抗原的紫外吸收峰与载体蛋白KLH相比发生漂移，峰值与载体蛋白相比发生改变，据此证实完全免疫抗原KLH-Aminobenzyl-EDTA-Hg的合成成功。检测结果见图1。
②完全免疫抗原KLH-Aminobenzyl-EDTA-Hg中Hg含量测定
用石墨炉原子吸收分光光度法检测完全免疫抗原KLH-Aminobenzyl-EDTA-Hg中的Hg含量，结果表明完全免疫抗原中Hg含量达57.15μg/mg，此结果进一步表明完全免疫抗原的合成成功。
2.检测抗原BSA-Aminobenzyl-EDTA-Hg的制备及检测
(1)检测抗原BSA-Aminobenzyl-EDTA-Hg的制备
称取5.9mg螯合剂Aminobenzyl-EDTA溶于0.548ml 10mg/ml、pH6.5的Hg(NO3)2溶液中，37℃搅拌反应0.5小时，调节pH为6.5。然后加入pH6.5、1％戊二醛溶液2ml，37℃搅拌反应0.5小时。最后，将上述反应后的混合液逐滴加入到2ml浓度为5mg/ml的BSA溶液中，边加边搅拌，调节pH值为6.5，37℃搅拌反应18小时。将抗原转移至截留分子量为30000dal超滤管中，7500g离心15min，用0.1M、pH6.5的Hepes溶液洗涤，如此反复进行超滤6次，再将抗原以用0.1M、pH6.5的Hepes稀释成1mg/ml，得检测抗原BSA-Aminobenzyl-EDTA-Hg，分装，于-20℃保存。
(2)检测抗原BSA-Aminobenzyl-EDTA-Hg的检测
①检测抗原BSA-Aminobenzyl-EDTA-Hg的紫外分光光度法检测
对完全抗原进行190～500nm全波长扫描，结果表明完全抗原的紫外吸收峰相比载体蛋白发生漂移，峰值与载体蛋白BSA相比发生改变，据此证实检测抗原BSA-Aminobenzyl-EDTA-Hg的合成成功。检测结果见图2。
②检测抗原BSA-Aminobenzyl-EDTA-Hg中Hg含量测定
用石墨炉原子吸收分光光度法检测检测抗原BSA-Aminobenzyl-EDTA-Hg中的Hg含量，结果表明检测抗原中Hg含量达33.2μg/mg，此结果进一步表明检测抗原BSA-Aminobenzyl-EDTA-Hg的合成成功。
3.对照检测抗原BSA-Aminobenzyl-EDTA的制备及检测
(1)对照检测抗原BSA-Aminobenzyl-EDTA的制备
称取5.9mg螯合剂Aminobenzyl-EDTA溶于0.6ml 0.1M、pH6.5的Hepes溶液中，37℃搅拌0.5小时，然后加入pH6.5、1％戊二醛溶液2ml，37℃搅拌反应0.5小时。最后，将上述反应后的混合液逐滴加入到2ml浓度为5mg/ml的BSA溶液中，边加边搅拌，调节pH值为6.5，37℃搅拌反应18小时。将反应液转移至截留分子量为30000dal超滤管中，7500g离心15min，用0.1M、pH6.5的Hepes溶液洗涤，如此反复进行超滤6次，再用0.1M、pH6.5的Hepes稀释成1mg/ml，得对照检测抗原BSA-Aminobenzyl-EDTA，分装，于-20℃保存。
(2)对照检测抗原BSA-Aminobenzyl-EDTA的紫外分光光度法扫描
用紫外分光光度法对对照检测抗原BSA-Aminobenzyl-EDTA进行190～500nm的全波长扫描，结果表明对照检测抗原的紫外吸收峰与载体蛋白BSA相比发生漂移，峰值与载体蛋白相比发生改变，据此证实检测抗原BSA-Aminobenzyl-EDTA的合成成功。检测结果见图2。
4.小鼠免疫
选用8周龄BABL/c小鼠进行免疫。
首免：取100μl 1mg/ml KLH-Aminobenzyl-EDTA-Hg，加入10μl 1mg/ml、pH6.5的Hg(NO3)2溶液振荡2分钟，然后加入完全弗氏佐剂110μl，乳化，供1只小鼠1次腹腔注射免疫。
二免及以后免疫：取100μl 1mg/ml KLH-Aminobenzyl-EDTA-Hg，加入10μl 1mg/ml、pH6.5的Hg(NO3)2溶液振荡2分钟，然后加入弗氏不完全佐剂110μl，乳化，供1只小鼠1次腹腔注射免疫。每两周免疫一次。
5.小鼠血清效价的测定
(1)间接ELISA法测定血清效价
4免疫后小鼠断尾采血，用间接ELISA法检测血清效价。用0.1M、pH6.5的Hepes溶液将检测抗原BSA-Aminobenzyl-EDTA-Hg、对照检测抗原BSA-Aminobenzyl-EDTA作100倍稀释，按每孔100μl分别包被酶标板，37℃温育1小时，倒出孔内液体，用洗涤液(含0.05％吐温20的PBS液)洗涤3次。加封闭液(1％牛血清蛋白液)150μl/孔，37℃温育1小时，倒出孔内液体，洗涤3次。待检血清样品4000倍稀释后，再做倍比稀释，按100μl/孔加入，37℃温育1小时，洗涤3次。将酶标二抗(羊抗鼠)以1∶5000倍稀释按100μl/孔加入，37℃温育1小时，洗涤3次。加入TMB底物溶液100μl/孔，37℃避光静置10分钟，加终止液(2M H2SO4)50μl/孔，用酶标仪测定450nm处OD值。把待检血清OD值大于或等于阴性对照OD值2.1倍时的最高血清稀释倍数作为血清效价。四免疫后所有小鼠血清针对BSA-Aminobenzyl-EDTA-Hg的效价为1∶16000以上，针对BSA-Aminobenzyl-EDTA的OD值为BSA-Aminobenzyl-EDTA-Hg的1/4以下。
(2)检测抗原最佳包被浓度的测定(方阵间接ELISA法)
用包被缓冲液将检测抗原BSA-Aminobenzyl-EDTA-Hg作系列倍比稀释即作1∶100…～…1∶6400倍稀释包被于酶标板1～7列孔内；将抗血清用PBS缓冲液(0.01MpH7.4)作系列倍比稀释即作1∶1000…～…1∶32000倍稀释加于包被有检测抗原的酶标板A～F行孔内，按照间接ELISA进行操作，酶标仪测定450nm波长处各孔OD值。OD值最接近1.0时的抗原浓度即为最佳抗原包被浓度。经试验，确定检测抗原BSA-Aminobenzyl-EDTA-Hg的最佳包被浓度为800倍稀释。
6.细胞融合、筛选及克隆方案
(1)饲养细胞的制备
融合前1-2天，取2只小鼠摘眼球放血，颈部脱臼处死，75％酒精浸泡消毒10分钟，然后将小鼠固定于超净工作台的鼠板上。打开腹部皮肤，充分暴露腹膜。用5ml注射器取5ml 1640培养液注入小鼠腹腔，注射器不取出，用镊子夹住酒精棉球按摩两侧腹部1分钟，然后吸出培养液，置于50mL离心管中，同法进行三次。将离心管中的液体1000rpm离心10分钟，弃上清。用50ml HAT培养液悬浮细胞，按100μl/孔滴加到5块96孔细胞培养板中，37℃，5％CO2中培养，备用。
(2)Sp2/0骨髓瘤细胞的准备
融合前36-48小时将处于对数生长期的骨髓瘤细胞扩大培养。融合前用弯头吸管将细胞从细胞培养瓶壁上吹下，收集于50ml离心管中，1000rpm离心10分钟，弃上清。再加入20ml 1640培养液，重新混匀，1000rpm离心10分钟，弃上清，加10ml 1640培养液，混匀。取细胞悬液0.1ml，再加入0.1ml台盼兰，混匀，滴加到细胞计数板上显微镜下计数，备用。
(3)脾细胞的准备
选择血清针对BSA-Aminobenzyl-EDTA-Hg效价高而针对BSA-Aminobenzyl-EDTA效价低的BABL/c小鼠于融合前3天加强免疫1次。免疫时取100μl 1mg/ml KLH-Aminobenzyl-EDTA-Hg，加入10μl 10mg/ml、pH6.5的Hg(NO3)2溶液振荡2分钟，供1只小鼠1次腹腔注射免疫。融合前取小鼠摘眼球放血，颈部脱臼处死，75％酒精浸泡消毒10分钟，然后将小鼠固定于超净工作台的鼠板上，无菌操作打开腹腔，取出脾脏，于含10ml 1640培养液的平皿中洗涤两次，去掉周围的脂肪组织与结缔组织，置于含10ml 1640培养液的平皿中。取200目网筛放于平皿中，加1640培养液至浸没网筛，将脾脏置于网筛上培养液中，用L型玻璃棒轻轻挤压脾脏，使脾细胞完全进入培养液中。将脾细胞液吸入50ml离心管中，1000rpm离心10分钟，弃上清，再加10ml 1640培养液，混匀。细胞计数(同上)，备用。
(4)细胞融合
取脾细胞(108个左右)与Sp2/0(107个左右)骨髓瘤细胞充分混匀于50ml离心管中，1000rpm离心8分钟，弃上清。用手轻击离心管底，使细胞沉淀松散混匀，然后置于37℃水中预热。同时，用1ml吸管吸取1ml 50％PEG在1分钟内均匀加入离心管中，边加边混匀，使细胞与PEG充分接触，静置30秒，再在5分钟内加入20-30ml1640培养液，37℃静置10分钟。800rpm离心8分钟，弃上清，用50ml HAT培养液悬浮细胞，分别加入预先已经准备好饲养细胞的5块96孔细胞培养板中，100μl/孔，37℃，5％CO2中培养，7-10天后用HT培养液换出一半HAT培养液，14天后可以用HT培养液培养。
(5)阳性细胞株的筛选和克隆
经常观察杂交瘤细胞生长情况，待细胞长到孔底面积的1/10以上时吸出上清检测效价。采用已建立的间接ELISA法(同上)，检测抗原为BSA-Aminobenzyl-EDTA-Hg，对照检测抗原为BSA-Aminobenzyl-EDTA，作800倍稀释包被于酶标板，封闭液为1％牛血清蛋白液，免疫小鼠血清为阳性对照，Sp2/0细胞培养上清液为阴性对照，对阳性克隆进行初步筛选。目的杂交瘤细胞的标准为：对BSA-Aminobenzyl-EDTA-Hg的反应为强阳性，对BSA-Aminobenzyl-EDTA的反应为阴性。筛选出的阳性杂交瘤细胞采用有限稀释法进行克隆。克隆前1-2天按前述方法制备饲养细胞。将需克隆的阳性杂交瘤细胞按前述方法用1％台盼兰染色，计数板计数，根据计数结果将细胞稀释至10个/ml，分别加入已经制备好饲养细胞的5块96孔细胞培养板中，100μl/孔，37℃，5％CO2中培养，仔细观察各孔细胞的生长情况。取单克隆细胞株的培养上清液进行抗体检测，选取阳性的细胞株继续扩大培养并进行下一次克隆，连续3次克隆，直到阳性率达100％，备用。
(6)上清液特异性分析
按照间接竞争ELISA法检测抗Hg单克隆抗体与其他金属离子间的交叉反应。检测抗原BSA-Aminobenzyl-EDTA-Hg作800倍稀释包被于酶标板，螯合剂Aminobenzyl-EDTA分别与浓度系列稀释为10-7mM、10-6mM、10-5mM、10-4mM、10-3mM、10-2mM、10-1mM、1mM的Cd2+、Pb2+、Ag+、Cu2+、Fe2+、Zn2+、Mg2+、Mn2+、Cr2+、In3+、Ni2+、Co2+置37℃反应1h，然后再与待检上清置37℃反应1h；将混合液加于酶标板37℃恒温孵育1h，洗涤；加酶标二抗37℃恒温孵育1h，洗涤；显色，酶标仪测定各孔OD450值。分别构建抑制标准曲线，并计算各自的IC50，按以下公式计算交叉反应率(CR)：CR＝IC50(Hg2+)/IC50(其它金属离子)×100％。
只保留上清液与其他各种金属的交叉反应率低于0.2％的细胞株，进行扩大培养、冻存，备用。
经过上述筛选，得到2株针对Hg2+的特异性细胞株。
7.单克隆抗体腹水的制备和纯化方案
取6只BABL/c小鼠，腹腔注射灭菌液体石蜡0.5ml/只，1-2周后接种杂交瘤细胞(1-2×106/ml)0.5ml/只，7-12天后当小鼠腹部明显增大时用注射器收集腹水，4℃下10000rpm离心10分钟，去油脂和沉淀后，取上清液，20℃保存备用。腹水的纯化采用饱和硫酸铵法，具体步骤为：取腹水样品10ml，加12ml PBS(0.02M，pH7.0)，在冰浴中缓慢加入饱和硫酸铵溶液20ml，边加边搅匀，搅拌10分钟，4℃过夜。4℃，12000rpm离心10分钟，弃上清，沉淀用12ml PBS溶解，同上加入饱和硫酸铵溶液8ml，搅拌30分钟，置4℃24小时。4℃，12000rpm离心10分钟，弃上清，沉淀用13.4ml PBS溶解，同上加入饱和硫酸铵溶液6.6ml，搅拌10分钟，4℃静置1小时。4℃12000rpm离心10分钟，弃上清，沉淀用少量PBS溶解，装入透析袋中，4℃透析72小时，第一天每4小时换透析液一次，以后每8小时换透析液一次。透析结束后，加等体积甘油，-20℃保存。
8.单克隆抗体亚类的鉴定
以包被原BSA-Aminobenzyl-EDTA-Hg包被酶标板，100μl/孔，4℃过夜，倒出孔内液体，洗涤液(含0.05％吐温20的PBS液)洗涤3次，再加入杂交瘤细胞培养上清，100μl/孔，室温孵育1小时，洗涤3次，然后分别加入抗体亚类分型检测试剂，100μl/孔，室温孵育0.5小时，洗涤3次，加HRP标记的马抗羊IgG(1∶5000倍稀释)，室温孵育0.5小时，洗涤3次，加新鲜配制的底物溶液，100μl/孔，避光反应10-15分钟，加终止液(2M H2SO4)50μl/孔终止反应，酶标仪检测相应吸光值。当OD值大于或等于阴性对照OD值2.1倍时为阳性。通过鉴定所有单克隆抗体均为IgG。
9.单克隆抗体对的亲和性
(1)通过夹心ELISA法利用已知浓度羊抗鼠IgG及小鼠IgG标准品测定纯化后的腹水中抗体浓度，即以小鼠IgG标准品系列稀释浓度及其OD值建立标准曲线，然后根据待测腹水OD值计算得出腹水中抗体浓度。
(2)包被系列稀释的抗原BSA-Aminobenzyl-EDTA-Hg(1mg/ml)(0.5mg/ml、0.25mg/ml、0.125mg/ml)于酶标板，加入系列稀释且已知抗体浓度的腹水，按间接ELISA法操作，测定反应系统的OD450值，然后以抗体的不同浓度为横坐标，相应OD值为纵坐标建立三条测定曲线，以各曲线最大平缓处OD450值为100％，查出其OD450值为50％时的抗体浓度。然后按公式Ka＝(n-1)/2(n[Ab′]t-[Ab]t)计算亲和常数，公式中[Ab′]t表示抗原浓度为[Ag’]t时OD450＝1/2OD450max对应的抗体浓度，n为抗原[Ag’]t与[Ag]t间的稀释倍数。
结果表明本实施例所得细胞株分泌的抗体对BSA-Aminobenzyl-EDTA-Hg结合力较强。
10.单克隆抗体特异性分析
同上(上清液与其它金属之间交又反应的测定)。结果表明所得单克隆抗体与其他金属的交叉反应率均低于0.2％。
实施例2
1.免疫抗原KLH-Aminobenzyl-EDTA-Hg的制备
称取2.6mg螯合剂Aminobenzyl-EDTA溶于0.28ml 10mg/ml、pH7.0的Hg(NO3)2溶液中，37℃搅拌反应1小时，然后加入pH7.0、1％戊二醛溶液1ml，37℃搅拌反应0.5小时。将上述反应后的混合液逐滴加入到2ml浓度为5mg/ml的KLH溶液中，边加边搅拌。调节pH值为7.0，37℃搅拌反应18小时，选用截留分子量为30000dal的超滤离心管，7500g超滤6次，洗涤液为0.1M、pH7.0的Hepes溶液，每次离心15min。超滤完毕后，补加0.1M、pH7.0的Hepes溶液，使KLH终浓度为1mg/ml。免疫抗原制备完毕，分装，-20℃保存。
2.检测抗原BSA-Aminobenzyl-EDTA-Hg的制备
称取5.9mg螯合剂Aminobenzyl-EDTA溶于0.548ml 10mg/ml、pH7.0的Hg(NO3)2溶液中，37℃搅拌反应0.5小时，调节pH为7.0。然后加入pH7.0、1％戊二醛溶液2ml，37℃搅拌反应0.5小时。最后，将上述反应后的混合液逐滴加入到2ml浓度为5mg/ml的BSA溶液中，边加边搅拌，调节pH值为7.0，37℃搅拌反应18小时。将抗原转移至截留分子量为30000dal超滤管中，7500g离心15min，用0.1M、pH7.0的Hepes溶液洗涤，如此反复进行超滤6次，再将抗原以用0.1M、pH7.0的Hepes稀释成1mg/ml，得检测抗原BSA-Aminobenzyl-EDTA-Hg，分装，于-20℃保存。
3.对照检测抗原BSA-Aminobenzyl-EDTA的制备
称取5.9mg螯合剂Aminobenzyl-EDTA溶于0.6ml 0.1M、pH7.0的Hepes溶液中，37℃搅拌0.5小时，然后加入pH7.0、1％戊二醛溶液2ml，37℃搅拌反应0.5小时。最后，将上述反应后的混合液逐滴加入到2ml浓度为5mg/ml的BSA溶液中，边加边搅拌，调节pH值为7.0，37℃搅拌反应18小时。将反应液转移至截留分子量为30000dal超滤管中，7500g离心15min，用0.1M、pH7.0的Hepes溶液洗涤，如此反复进行超滤6次，再用0.1M、pH7.0的Hepes稀释成1mg/ml，得对照检测抗原BSA-Aminobenzyl-EDTA，分装，于-20℃保存。
4.小鼠免疫
选用6只8周龄BABL/c小鼠进行免疫。
首免：取100μl 1mg/ml KLH-Aminobenzyl-EDTA-Hg，加入10μl 1mg/ml、pH7.0的Hg(NO3)2溶液振荡2分钟，然后加入完全弗氏佐剂110μl，乳化，供1只小鼠1次腹腔注射免疫。
二免及以后免疫：取100μl 1mg/ml KLH-Aminobenzyl-EDTA-Hg，加入10μl 1mg/ml、pH7.0的Hg(NO3)2溶液振荡2分钟，然后加入弗氏不完全佐剂110μl，乳化，供1只小鼠1次腹腔注射免疫。每两周免疫一次。
5.小鼠血清效价的测定
(1)间接ELISA法测定血清效价
4免疫后小鼠断尾采血，用间接ELISA法检测血清效价。用0.1M、pH7.0的Hepes溶液将检测抗原BSA-Aminobenzyl-EDTA-Hg、对照检测抗原BSA-Aminobenzyl-EDTA作100倍稀释，按每孔100μl分别包被酶标板，37℃温育1小时，倒出孔内液体，用洗涤液(含0.05％吐温20的PBS液)洗涤3次。加封闭液(1％牛血清蛋白液)150μl/孔，37℃温育1小时，倒出孔内液体，洗涤3次。待检血清样品4000倍稀释后，再做倍比稀释，按100μl/孔加入，37℃温育1小时，洗涤3次。将酶标二抗(羊抗鼠)以1∶5000倍稀释按100μl/孔加入，37℃温育1小时，洗涤3次。加入TMB底物溶液100μl/孔，37℃避光静置10分钟，加终止液(2M H2SO4)50μl/孔，用酶标仪测定450nm处OD值。把待检血清OD值大于或等于阴性对照OD值2.1倍时的最高血清稀释倍数作为血清效价。四免疫后所有小鼠血清针对BSA-Aminobenzyl-EDTA-Hg的效价为1∶16000以上，针对BSA-Aminobenzyl-EDTA的OD值为BSA-Aminobenzyl-EDTA-Hg的1/4以下。
(2)检测抗原最佳包被浓度的测定(方阵间接ELISA法)
用包被缓冲液将检测抗原BSA-Aminobenzyl-EDTA-Hg作系列倍比稀释即作1∶100…～…1∶6400倍稀释包被于酶标板1～7列孔内；将抗血清用PBS缓冲液(0.01MpH7.4)作系列倍比稀释即作1∶1000…～…1∶32000倍稀释加于包被有检测抗原的酶标板A～F行孔内，按照间接ELISA进行操作，酶标仪测定450nm波长处各孔OD值。OD值最接近1.0时的抗原浓度即为最佳抗原包被浓度。经试验，确定检测抗原BSA-Aminobenzyl-EDTA-Hg的最佳包被浓度为800倍稀释。
6.细胞融合、筛选及克隆方案
(1)饲养细胞的制备
融合前1-2天，取2只小鼠摘眼球放血，颈部脱臼处死，75％酒精浸泡消毒10分钟，然后将小鼠固定于超净工作台的鼠板上。打开腹部皮肤，充分暴露腹膜。用5ml注射器取5ml 1640培养液注入小鼠腹腔，注射器不取出，用镊子夹住酒精棉球按摩两侧腹部1分钟，然后吸出培养液，置于50mL离心管中，同法进行三次。将离心管中的液体1000rpm离心10分钟，弃上清。用50ml HAT培养液悬浮细胞，按100μl/孔滴加到5块96孔细胞培养板中，37℃，5％CO2中培养，备用。
(2)Sp2/0骨髓瘤细胞的准备
融合前36-48小时将处于对数生长期的骨髓瘤细胞扩大培养。融合前用弯头吸管将细胞从细胞培养瓶壁上吹下，收集于50ml离心管中，1000rpm离心10分钟，弃上清。再加入20ml 1640培养液，重新混匀，1000rpm离心10分钟，弃上清，加10ml 1640培养液，混匀。取细胞悬液0.1ml，再加入0.1ml台盼兰，混匀，滴加到细胞计数板上显微镜下计数，备用。
(3)脾细胞的准备
选择血清针对BSA-Aminobenzyl-EDTA-Hg效价高而针对BSA-Aminobenzyl-EDTA效价低的BABL/c小鼠于融合前3天加强免疫1次。免疫时取100μl 1mg/ml KLH-Aminobenzyl-EDTA-Hg，加入10μl 10mg/ml、pH7.0的Hg(NO3)2溶液振荡2分钟，供1只小鼠1次腹腔注射免疫。融合前取小鼠摘眼球放血，颈部脱臼处死，75％酒精浸泡消毒10分钟，然后将小鼠固定于超净工作台的鼠板上，无菌操作打开腹腔，取出脾脏，于含10ml 1640培养液的平皿中洗涤两次，去掉周围的脂肪组织与结缔组织，置于含10ml 1640培养液的平皿中。取200目网筛放于平皿中，加1640培养液至浸没网筛，将脾脏置于网筛上培养液中，用L型玻璃棒轻轻挤压脾脏，使脾细胞完全进入培养液中。将脾细胞液吸入50ml离心管中，1000rpm离心10分钟，弃上清，再加10ml 1640培养液，混匀。细胞计数(同上)，备用。
(4)细胞融合
取脾细胞(108个左右)与Sp2/0(107个左右)骨髓瘤细胞充分混匀于50ml离心管中，1000rpm离心8分钟，弃上清。用手轻击离心管底，使细胞沉淀松散混匀，然后置于37℃水中预热。同时，用1ml吸管吸取1ml 50％PEG在1分钟内均匀加入离心管中，边加边混匀，使细胞与PEG充分接触，静置30秒，再在5分钟内加入20-30ml1640培养液，37℃静置10分钟。800rpm离心8分钟，弃上清，用50ml HAT培养液悬浮细胞，分别加入预先已经准备好饲养细胞的5块96孔细胞培养板中，100μl/孔，37℃，5％CO2中培养，7-10天后用HT培养液换出一半HAT培养液，14天后可以用HT培养液培养。
(5)阳性细胞株的筛选和克隆
经常观察杂交瘤细胞生长情况，待细胞长到孔底面积的1/10以上时吸出上清检测效价。采用已建立的间接ELISA法(同上)，检测抗原为BSA-Aminobenzyl-EDTA-Hg，对照检测抗原为BSA-Aminobenzyl-EDTA，作800倍稀释包被于酶标板，封闭液为1％牛血清蛋白液，免疫小鼠血清为阳性对照，Sp2/0细胞培养上清液为阴性对照，对阳性克隆进行初步筛选。目的杂交瘤细胞的标准为：对BSA-Aminobenzyl-EDTA-Hg的反应为强阳性，对BSA-Aminobenzyl-EDTA的反应为阴性。筛选出的阳性杂交瘤细胞采用有限稀释法进行克隆。克隆前1-2天按前述方法制备饲养细胞。将需克隆的阳性杂交瘤细胞按前述方法用1％台盼兰染色，计数板计数，根据计数结果将细胞稀释至10个/ml，分别加入已经制备好饲养细胞的5块96孔细胞培养板中，100μl/孔，37℃，5％CO2中培养，仔细观察各孔细胞的生长情况。取单克隆细胞株的培养上清液进行抗体检测，选取阳性的细胞株继续扩大培养并进行下一次克隆，连续3次克隆，直到阳性率达100％，备用。
(6)上清液特异性分析
按照间接竞争ELISA法检测抗Hg单克隆抗体与其他金属离子间的交叉反应。检测抗原BSA-Aminobenzyl-EDTA-Hg作800倍稀释包被于酶标板，螯合剂Aminobenzyl-EDTA分别与浓度系列稀释为10-7mM、10-6mM、10-5mM、10-4mM、10-3mM、10-2mM、10-1mM、1mM的Cd2+、Pb2+、Ag+、Cu2+、Fe2+、Zn2+、Mg2+、Mn2+、Cr2+、In3+、Ni2+、Co2+置37℃反应1h，然后再与待检上清置37℃反应1h；将混合液加于酶标板37℃恒温孵育1h，洗涤；加酶标二抗37℃恒温孵育1h，洗涤；显色，酶标仪测定各孔OD450值。分别构建抑制标准曲线，并计算各自的IC50，按以下公式计算交叉反应率(CR)：CR＝IC50(Hg2+)/IC50(其它金属离子)×100％。
只保留上清液与其他各种金属的交叉反应率低于0.2％的细胞株，进行扩大培养、冻存，备用。
经过上述筛选，得到1株针对Hg2+的特异性细胞株。
7.单克隆抗体腹水的制备和纯化方案
取6只BABL/c小鼠，腹腔注射灭菌液体石蜡0.5ml/只，1-2周后接种杂交瘤细胞(1-2×106/ml)0.5ml/只，7-12天后当小鼠腹部明显增大时用注射器收集腹水，4℃下10000rpm离心10分钟，去油脂和沉淀后，取上清液，20℃保存备用。腹水的纯化采用饱和硫酸铵法，具体步骤为：取腹水样品10ml，加12ml PBS(0.02M，pH7.0)，在冰浴中缓慢加入饱和硫酸铵溶液20ml，边加边搅匀，搅拌10分钟，4℃过夜。4℃，12000rpm离心10分钟，弃上清，沉淀用12ml PBS溶解，同上加入饱和硫酸铵溶液8ml，搅拌30分钟，置4℃24小时。4℃，12000rpm离心10分钟，弃上清，沉淀用13.4ml PBS溶解，同上加入饱和硫酸铵溶液6.6ml，搅拌10分钟，4℃静置1小时。4℃12000rpm离心10分钟，弃上清，沉淀用少量PBS溶解，装入透析袋中，4℃透析72小时，第一天每4小时换透析液一次，以后每8小时换透析液一次。透析结束后，加等体积甘油，-20℃保存。
8.单克隆抗体亚类的鉴定
以包被原BSA-Aminobenzyl-EDTA-Hg包被酶标板，100μl/孔，4℃过夜，倒出孔内液体，洗涤液(含0.05％吐温20的PBS液)洗涤3次，再加入杂交瘤细胞培养上清，100μl/孔，室温孵育1小时，洗涤3次，然后分别加入抗体亚类分型检测试剂，100μl/孔，室温孵育0.5小时，洗涤3次，加HRP标记的马抗羊IgG(1∶5000倍稀释)，室温孵育0.5小时，洗涤3次，加新鲜配制的底物溶液，100μl/孔，避光反应10-15分钟，加终止液(2M H2SO4)50μl/孔终止反应，酶标仪检测相应吸光值。当OD值大于或等于阴性对照OD值2.1倍时为阳性。通过鉴定，本实施例所制备的克隆抗体为IgM。
9.单克隆抗体的亲和性
(1)通过夹心ELISA法利用已知浓度羊抗鼠IgG及小鼠IgG标准品测定纯化后的腹水中抗体浓度，即以小鼠IgG标准品系列稀释浓度及其OD值建立标准曲线，然后根据待测腹水OD值计算得出腹水中抗体浓度。
(2)包被系列稀释的抗原BSA-Aminobenzyl-EDTA-Hg(1mg/ml)(0.5mg/ml、0.25mg/ml、0.125mg/ml)于酶标板，加入系列稀释且已知抗体浓度的腹水，按间接ELISA法操作，测定反应系统的OD450值，然后以抗体的不同浓度为横坐标，相应OD值为纵坐标建立三条测定曲线，以各曲线最大平缓处OD450值为100％，查出其OD450值为50％时的抗体浓度。然后按公式Ka＝(n-1)/2(n[Ab′]t-[Ab]t)计算亲和常数，公式中[Ab′]t表示抗原浓度为[Ag’]t时OD450＝1/2OD450max对应的抗体浓度，n为抗原[Ag’]t与[Ag]t间的稀释倍数。
结果表明本实施例所得细胞株分泌的抗体对BSA-Aminobenzyl-EDTA-Hg结合力较强。
10.单克隆抗体特异性分析
同上(上清液与其它金属之间交又反应的测定)。结果表明本实施例的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体与其他金属离子无交叉反应。
实施例3
1.免疫抗原KLH-Aminobenzyl-EDTA-Hg的制备
称取2.6mg螯合剂Aminobenzyl-EDTA溶于0.24ml 10mg/ml、pH6.0的Hg(NO3)2溶液中，37℃搅拌反应1小时，然后加入pH6.0、1％戊二醛溶液1ml，37℃搅拌反应0.5小时。将上述反应后的混合液逐滴加入到2ml浓度为5mg/ml的KLH溶液中，边加边搅拌。调节pH值为6.0，37℃搅拌反应18小时，选用截留分子量为30000dal的超滤离心管，7500g超滤6次，洗涤液为0.1M、pH6.0的Hepes溶液，每次离心15min。超滤完毕后，补加0.1M、pH6.0的Hepes溶液，使KLH终浓度为1mg/ml。免疫抗原制备完毕，分装，-20℃保存。
2.检测抗原BSA-Aminobenzyl-EDTA-Hg的制备
称取5.9mg螯合剂Aminobenzyl-EDTA溶于0.548ml 10mg/ml、pH6.0的Hg(NO3)2溶液中，37℃搅拌反应0.5小时，调节pH为6.0。然后加入pH6.0、1％戊二醛溶液2ml，37℃搅拌反应0.5小时。最后，将上述反应后的混合液逐滴加入到2ml浓度为5mg/ml的BSA溶液中，边加边搅拌，调节pH值为6.0，37℃搅拌反应18小时。将抗原转移至截留分子量为30000dal超滤管中，7500g离心15min，用0.1M、pH6.0的Hepes溶液洗涤，如此反复进行超滤6次，再将抗原以用0.1M、pH6.0的Hepes稀释成1mg/ml，得检测抗原BSA-Aminobenzyl-EDTA-Hg，分装，于-20℃保存。
3.对照检测抗原BSA-Aminobenzyl-EDTA的制备及检测
称取5.9mg螯合剂Aminobenzyl-EDTA溶于0.6ml 0.1M、pH6.0的Hepes溶液中，37℃搅拌0.5小时，然后加入pH6.0、1％戊二醛溶液2ml，37℃搅拌反应0.5小时。最后，将上述反应后的混合液逐滴加入到2ml浓度为5mg/ml的BSA溶液中，边加边搅拌，调节pH值为6.0，37℃搅拌反应18小时。将反应液转移至截留分子量为30000dal超滤管中，7500g离心15min，用0.1M、pH6.0的Hepes溶液洗涤，如此反复进行超滤6次，再用0.1M、pH6.0的Hepes稀释成1mg/ml，得对照检测抗原BSA-Aminobenzyl-EDTA，分装，于-20℃保存。
4.小鼠免疫
选用4只8周龄BABL/c小鼠进行免疫。
首免：取100μl 1mg/ml KLH-Aminobenzyl-EDTA-Hg，加入10μl 1mg/ml、pH6.0的Hg(NO3)2溶液振荡2分钟，然后加入完全弗氏佐剂110μl，乳化，供1只小鼠1次腹腔注射免疫。
二免及以后免疫：取100μl 1mg/ml KLH-Aminobenzyl-EDTA-Hg，加入10μl 1mg/ml、pH6.0的Hg(NO3)2溶液振荡2分钟，然后加入弗氏不完全佐剂110μl，乳化，供1只小鼠1次腹腔注射免疫。每两周免疫一次。
5.小鼠血清效价的测定
(1)间接ELISA法测定血清效价
4免疫后小鼠断尾采血，用间接ELISA法检测血清效价。用0.1M、pH6.0的Hepes溶液将检测抗原BSA-Aminobenzyl-EDTA-Hg、对照检测抗原BSA-Aminobenzyl-EDTA作100倍稀释，按每孔100μl分别包被酶标板，37℃温育1小时，倒出孔内液体，用洗涤液(含0.05％吐温20的PBS液)洗涤3次。加封闭液(1％牛血清蛋白液)150μl/孔，37℃温育1小时，倒出孔内液体，洗涤3次。待检血清样品4000倍稀释后，再做倍比稀释，按100μl/孔加入，37℃温育1小时，洗涤3次。将酶标二抗(羊抗鼠)以1∶5000倍稀释按100μl/孔加入，37℃温育1小时，洗涤3次。加入TMB底物溶液100μl/孔，37℃避光静置10分钟，加终止液(2M H2SO4)50μl/孔，用酶标仪测定450nm处OD值。把待检血清OD值大于或等于阴性对照OD值2.1倍时的最高血清稀释倍数作为血清效价。四免疫后所有小鼠血清针对BSA-Aminobenzyl-EDTA-Hg的效价为1∶16000以上，针对BSA-Aminobenzyl-EDTA的OD值为BSA-Aminobenzyl-EDTA-Hg的1/4以下。
(2)检测抗原最佳包被浓度的测定(方阵间接ELISA法)
用包被缓冲液将检测抗原BSA-Aminobenzyl-EDTA-Hg作系列倍比稀释即作1∶100…～…1∶6400倍稀释包被于酶标板1～7列孔内；将抗血清用PBS缓冲液(0.01MpH7.4)作系列倍比稀释即作1∶1000…～…1∶32000倍稀释加于包被有检测抗原的酶标板A～F行孔内，按照间接ELISA进行操作，酶标仪测定450nm波长处各孔OD值。OD值最接近1.0时的抗原浓度即为最佳抗原包被浓度。经试验，确定检测抗原BSA-Aminobenzyl-EDTA-Hg的最佳包被浓度为800倍稀释。
6.细胞融合、筛选及克隆方案
(1)饲养细胞的制备
融合前1-2天，取2只小鼠摘眼球放血，颈部脱臼处死，75％酒精浸泡消毒10分钟，然后将小鼠固定于超净工作台的鼠板上。打开腹部皮肤，充分暴露腹膜。用5ml注射器取5ml 1640培养液注入小鼠腹腔，注射器不取出，用镊子夹住酒精棉球按摩两侧腹部1分钟，然后吸出培养液，置于50mL离心管中，同法进行三次。将离心管中的液体1000rpm离心10分钟，弃上清。用50ml HAT培养液悬浮细胞，按100μl/孔滴加到5块96孔细胞培养板中，37℃，5％CO2中培养，备用。
(2)Sp2/0骨髓瘤细胞的准备
融合前36-48小时将处于对数生长期的骨髓瘤细胞扩大培养。融合前用弯头吸管将细胞从细胞培养瓶壁上吹下，收集于50ml离心管中，1000rpm离心10分钟，弃上清。再加入20ml 1640培养液，重新混匀，1000rpm离心10分钟，弃上清，加10ml 1640培养液，混匀。取细胞悬液0.1ml，再加入0.1ml台盼兰，混匀，滴加到细胞计数板上显微镜下计数，备用。
(3)脾细胞的准备
选择血清针对BSA-Aminobenzyl-EDTA-Hg效价高而针对BSA-Aminobenzyl-EDTA效价低的BABL/c小鼠于融合前3天加强免疫1次。免疫时取100μl 1mg/ml KLH-Aminobenzyl-EDTA-Hg，加入10μl 10mg/ml、pH6.0的Hg(NO3)2溶液振荡2分钟，供1只小鼠1次腹腔注射免疫。融合前取小鼠摘眼球放血，颈部脱臼处死，75％酒精浸泡消毒10分钟，然后将小鼠固定于超净工作台的鼠板上，无菌操作打开腹腔，取出脾脏，于含10ml 1640培养液的平皿中洗涤两次，去掉周围的脂肪组织与结缔组织，置于含10ml 1640培养液的平皿中。取200目网筛放于平皿中，加1640培养液至浸没网筛，将脾脏置于网筛上培养液中，用L型玻璃棒轻轻挤压脾脏，使脾细胞完全进入培养液中。将脾细胞液吸入50ml离心管中，1000rpm离心10分钟，弃上清，再加10ml 1640培养液，混匀。细胞计数(同上)，备用。
(4)细胞融合
取脾细胞(108个左右)与Sp2/0(107个左右)骨髓瘤细胞充分混匀于50ml离心管中，1000rpm离心8分钟，弃上清。用手轻击离心管底，使细胞沉淀松散混匀，然后置于37℃水中预热。同时，用1ml吸管吸取1ml 50％PEG在1分钟内均匀加入离心管中，边加边混匀，使细胞与PEG充分接触，静置30秒，再在5分钟内加入20-30ml1640培养液，37℃静置10分钟。800rpm离心8分钟，弃上清，用50ml HAT培养液悬浮细胞，分别加入预先已经准备好饲养细胞的5块96孔细胞培养板中，100μl/孔，37℃，5％CO2中培养，7-10天后用HT培养液换出一半HAT培养液，14天后可以用HT培养液培养。
(5)阳性细胞株的筛选和克隆
经常观察杂交瘤细胞生长情况，待细胞长到孔底面积的1/10以上时吸出上清检测效价。采用已建立的间接ELISA法(同上)，检测抗原为BSA-Aminobenzyl-EDTA-Hg，对照检测抗原为BSA-Aminobenzyl-EDTA，作800倍稀释包被于酶标板，封闭液为1％牛血清蛋白液，免疫小鼠血清为阳性对照，Sp2/0细胞培养上清液为阴性对照，对阳性克隆进行初步筛选。目的杂交瘤细胞的标准为：对BSA-Aminobenzyl-EDTA-Hg的反应为强阳性，对BSA-Aminobenzyl-EDTA的反应为阴性。筛选出的阳性杂交瘤细胞采用有限稀释法进行克隆。克隆前1-2天按前述方法制备饲养细胞。将需克隆的阳性杂交瘤细胞按前述方法用1％台盼兰染色，计数板计数，根据计数结果将细胞稀释至10个/ml，分别加入已经制备好饲养细胞的5块96孔细胞培养板中，100μl/孔，37℃，5％CO2中培养，仔细观察各孔细胞的生长情况。取单克隆细胞株的培养上清液进行抗体检测，选取阳性的细胞株继续扩大培养并进行下一次克隆，连续3次克隆，直到阳性率达100％，备用。
(6)上清液特异性分析
按照间接竞争ELISA法检测抗Hg单克隆抗体与其他金属离子间的交叉反应。检测抗原BSA-Aminobenzyl-EDTA-Hg作800倍稀释包被于酶标板，螯合剂Aminobenzyl-EDTA分别与浓度系列稀释为10-7mM、10-6mM、10-5mM、10-4mM、10-3mM、10-2mM、10-1mM、1mM的Cd2+、Pb2+、Ag+、Cu2+、Fe2+、Zn2+、Mg2+、Mn2+、Cr2+、In3+、Ni2+、Co2+置37℃反应1h，然后再与待检上清置37℃反应1h；将混合液加于酶标板37℃恒温孵育1h，洗涤；加酶标二抗37℃恒温孵育1h，洗涤；显色，酶标仪测定各孔OD450值。分别构建抑制标准曲线，并计算各自的IC50，按以下公式计算交叉反应率(CR)：CR＝IC50(Hg2+)/IC50(其它金属离子)×100％。
只保留上清液与其他各种金属的交叉反应率低于0.2％的细胞株，进行扩大培养、冻存，备用。
经过上述筛选，得到2株针对Hg2+的特异性细胞株。
7.单克隆抗体腹水的制备和纯化方案
取6只BABL/c小鼠，腹腔注射灭菌液体石蜡0.5ml/只，1-2周后接种杂交瘤细胞(1-2×106/ml)0.5ml/只，7-12天后当小鼠腹部明显增大时用注射器收集腹水，4℃下10000rpm离心10分钟，去油脂和沉淀后，取上清液，20℃保存备用。腹水的纯化采用饱和硫酸铵法，具体步骤为：取腹水样品10ml，加12ml PBS(0.02M，pH6.0)，在冰浴中缓慢加入饱和硫酸铵溶液20ml，边加边搅匀，搅拌10分钟，4℃过夜。4℃，12000rpm离心10分钟，弃上清，沉淀用12ml PBS溶解，同上加入饱和硫酸铵溶液8ml，搅拌30分钟，置4℃24小时。4℃，12000rpm离心10分钟，弃上清，沉淀用13.4ml PBS溶解，同上加入饱和硫酸铵溶液6.6ml，搅拌10分钟，4℃静置1小时。4℃12000rpm离心10分钟，弃上清，沉淀用少量PBS溶解，装入透析袋中，4℃透析72小时，第一天每4小时换透析液一次，以后每8小时换透析液一次。透析结束后，加等体积甘油，-20℃保存。
8.单克隆抗体亚类的鉴定
以包被原BSA-Aminobenzyl-EDTA-Hg包被酶标板，100μl/孔，4℃过夜，倒出孔内液体，洗涤液(含0.05％吐温20的PBS液)洗涤3次，再加入杂交瘤细胞培养上清，100μl/孔，室温孵育1小时，洗涤3次，然后分别加入抗体亚类分型检测试剂，100μl/孔，室温孵育0.5小时，洗涤3次，加HRP标记的马抗羊IgG(1∶5000倍稀释)，室温孵育0.5小时，洗涤3次，加新鲜配制的底物溶液，100μl/孔，避光反应10-15分钟，加终止液(2M H2SO4)50μl/孔终止反应，酶标仪检测相应吸光值。当OD值大于或等于阴性对照OD值2.1倍时为阳性。通过鉴定，本实施例中所得的2株杂交瘤细胞中，1株分泌的单克隆抗体为IgM，1株分泌的单克隆抗体为IgG。
9.单克隆抗体的亲和性
(1)通过夹心ELISA法利用已知浓度羊抗鼠IgG及小鼠IgG标准品测定纯化后的腹水中抗体浓度，即以小鼠IgG标准品系列稀释浓度及其OD值建立标准曲线，然后根据待测腹水OD值计算得出腹水中抗体浓度。
(2)包被系列稀释的抗原BSA-Aminobenzyl-EDTA-Hg(1mg/ml)(0.5mg/ml、0.25mg/ml、0.125mg/ml)于酶标板，加入系列稀释且已知抗体浓度的腹水，按间接ELISA法操作，测定反应系统的OD450值，然后以抗体的不同浓度为横坐标，相应OD值为纵坐标建立三条测定曲线，以各曲线最大平缓处OD450值为100％，查出其OD450值为50％时的抗体浓度。然后按公式Ka＝(n-1)/2(n[Ab′]t-[Ab]t)计算亲和常数，公式中[Ab′]t表示抗原浓度为[Ag’]t时OD450＝1/2OD450max对应的抗体浓度，n为抗原[Ag’]t与[Ag]t间的稀释倍数。
结果表明本实施例所得细胞株分泌的抗体对BSA-Aminobenzyl-EDTA-Hg结合力较强。
10.单克隆抗体特异性分析
同上(上清液与其它金属之间交又反应的测定)。结果表明本实施例的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体与其他金属离子无交叉反应。
Claims (6)
1.一种Hg2+完全免疫抗原，其特征在于：完全免疫抗原紫外吸收峰值为225nm～300nm，Hg含量达57.15μg/mg，紫外扫描结果见图1。
2.根据权利要求1所述Hg2+完全免疫抗原的制备方法，包括以下步骤：
称取2.6mg螯合剂Aminobenzyl-EDTA溶于0.22-0.28ml 10mg/ml、pH 6.0-7.0的Hg(NO3)2溶液中，37℃搅拌反应1小时，然后加入pH 6.0-7.0、1％戊二醛溶液1ml，37℃搅拌反应0.5小时；将上述反应后的混合液逐滴加入到2ml浓度为5mg/ml的KLH溶液中，边加边搅拌；调节pH值为6.0-7.0，37℃搅拌反应18小时，选用截留分子量为30000dal的超滤离心管、7500g超滤6次，洗涤液为0.1M、pH 6.0-7.0的Hepes缓冲液，每次离心15min；超滤完毕后，补加0.1M、pH 6.0-7.0的Hepes溶液，使KLH终浓度为1mg/ml，制备出完全免疫抗原。
3.根据权利要求2所述Hg2+完全免疫抗原的制备方法的制备方法，其特征在于：Hepes缓冲液pH值为6.5。
4.权利要求1所述Hg2+完全免疫抗原的单克隆抗体，其特征在于：单克隆抗体对Hg2+具有特异性。
5.权利要求4所述单克隆抗体的制备方法，其特征在于：用权利要求2得到的完全免疫抗原免疫BALB/c小鼠，选择对BSA-Aminobenzyl-EDTA-Hg血清效价高、对BSA-Aminobenzyl-EDTA血清效价低的小鼠加强免疫，将其脾细胞与骨髓瘤细胞融合；采用间接ELISA法筛选杂交瘤细胞株，只保留对BSA-Aminobenzyl-EDTA-Hg反应为强阳性、对BSA-Aminobenzyl-EDTA反应为阴性、对其它金属离子无交叉反应的细胞株。
6.权利要求5所述Hg2+抗原的单克隆抗体的制备方法，其特征在于免疫方法为：
首免：取100μl 1mg/ml的Hg2+完全免疫抗原，加入10μl 1mg/ml、pH 6.0-7.0的Hg(NO3)2溶液振荡2分钟，然后加入弗氏完全佐剂110μl，乳化，供1只小鼠1次腹腔注射免疫；
二免及以后免疫：取100μl 1mg/ml的Hg2+完全免疫抗原，加入10μl 1mg/ml、pH6.0-7.0的Hg(NO3)2溶液振荡2分钟，然后加入弗氏不完全佐剂110μl，乳化，供1只小鼠1次腹腔注射免疫，每两周免疫一次。
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