CN103558387B - 一种用于检测样品中重金属铜离子含量的酶联免疫试剂盒 - Google Patents

一种用于检测样品中重金属铜离子含量的酶联免疫试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于检测样品中重金属铜离子含量的酶联免疫试剂盒，包被有包被原的酶标板，酶标记物，铜离子螯合物特异性单克隆抗体或多克隆抗体，铜离子螯合物标准品溶液，底物显色液，终止液，洗液，稀释后的螯合剂EDTA。本发明的检测铜离子的酶联免疫试剂盒具有下列各项优点：①特异性强，敏感性高，最低检测限为0.42μg/L，检测范围为2.83～456.04μg／L。②简便、快速、时效性强。③结果显示形象、直观、准确。④费用低廉，适用范围广，便于推广，能够现场监控且适合大量样本筛查。

Description

一种用于检测样品中重金属铜离子含量的酶联免疫试剂盒
技术领域：
本发明涉及一种用于检测铜离子的单克隆抗体及酶联免疫试剂盒。
背景技术：
重金属污染主要指生物毒性显著地汞、铬、镉、铅以及类金属砷，还包括具有毒性的重金属铜、钴、镍、锡等污染物。随着城市的扩大和大规模工业的发展，大量重金属进入环境后，即使浓度很低，也可能造成危害，通过饮用水，或者通过生物富集以及食物链等方式最终威胁人体健康。重金属污染不同于其他类型污染，具有隐蔽性、长期性和不可逆转性等特点。
重金属铜是自然界存在的一种重要的金属元素。由于具有多种优良性特性，铜及其化合物在工农业中应用十分广泛。常量铜对农作物或人均是营养物质，而过量时就会产生危害。随着工农业生产的快速发展，铜的用途越来越广泛，用量不断增加，含铜污染物的排放也越来越多，对土壤等环境的污染逐渐显现出来。重金属的污染来源具有多样性，农作物中积累的重金属离子通过食物链的生物放大作用进入人、畜体内，威胁着人、畜健康。重金属污染是食品、环境、卫生监测的重要内容之一，铜及其化合物污染日趋严重并再度成为全球热点问题之一。
传统的重金属监测方法原子吸收光谱分析、电感耦合等离子发射光谱分析等需要大型的分析仪器，无法用于现场检测，难以适应环境及农畜产品的现场抽查及产品进出口快速通关的要求。与传统的检测方法相比，重金属的免疫分析方法作为一种新型的检测技术具有快速、灵敏和便携等优点。
因此，铜离子污染已对人类健康构成了严重威胁，建立快速、简便、敏感、特异、经济、筛检量大的铜离子免疫检测技术，对于减少环境污染、提高食品质量、保障食品安全具有重要意义。
发明内容：
本发明的目的：针对现有检测技术的不足和缺陷，制备出抗铜离子螯合物的高亲和力、特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，以此为基础提供一种用于检测铜离子的酶联免疫试剂盒，能够快速、简便、敏感、特异的检测食品、茶叶、饲料、饮料、土壤、水等样品中的铜离子残留与含量。
所述的检测铜离子的酶联免疫试剂盒，包括96孔或48孔酶标板、最佳工作浓度的Cu2+mAb或pAb、最佳工作浓度的RaMIgG-HRP或GaMIgG-HRP、底物显色剂A、底物显色剂B、Cu2+-ITCBE-OVA或Cu2+-ITCBE-BSA包被并封闭好的酶标板、终止液，Cu2+螯合物配置的标准品稀释液1～9，洗液(PBST)。
所述的检测铜离子的酶联免疫试剂盒，用肉眼或酶标仪获取结果，并根据结果分析计算所检测样品中的铜离子含量。
所述的检测铜离子的酶联免疫试剂盒，所用的铜离子标准品为铜离子与EDTA的螯合物，螯合物中铜离子含量的用电感耦合等离子体原子发射光谱法ICP-AES检测获得螯合物半抗原中Cu2+的含量。
所述单克隆抗体或多克隆抗体的制备方法为：
A1、双功能螯合剂的选择：双功能螯合剂1-(4-异硫氰根苯基)-乙二胺四乙酸(ITCBE)，对氨基苯基-二乙三胺五乙酸(P-NH2-Bn-DTpA)，2-(4-异硫氰根苯基-1，4，7，10-四氮环十二烷四盐酸盐(P-SCN-Bn-DOTA)，然后在碱、酸的作用下，将铜离子螯合在双功能螯合剂上；
A2、Cu2+-ITCBE-载体蛋白人工抗原的合成：采用异硫氰酯法合成铜离子人工抗原。分别称取血蓝蛋白(KLH)和牛血清白蛋白(BSA)20mg溶于1mL浓度为10mmoL／L，pH9.0的N-2-羟乙基哌嗪-N-乙磺酸缓冲液(HBS)中形成KLH、BSA溶液。称取10mg金属鳌合剂1-(4-异硫氰基苯基)-乙二胺四乙酸(ITCBE)溶于1mL二甲基亚飒(DMSO)中形成23nmoL／L金属鳌合剂溶液；分别取78.1uL浓度为23nmol／L的金属鳌合剂溶液轻轻搅拌下逐滴滴加到0.5mLKLH和BSA溶液中，用10mol／L KOH调节pH至9.0，室温下反应24h。制备出铜离子人工抗原Cu2+-ITCBE-OVA，Cu2+-ITCBE-BSA，Cu2+-ITCBE-KLH，-20℃保存备用。
A3、铜离子单克隆抗体和多克隆抗体的获得：用Cu2+-ITCBE-BSA，Cu2+-ITCBE-KLH免疫6周雌性BALB／C小鼠5只，剂量为20μg/0.2mL／只，背部皮下分点注射。采用细胞融合技术无菌取脾脏制备脾细胞，在聚乙二醇-1500作用下与NS0骨髓瘤细胞进行融合；用间接ELISA法和阻断ELISA法进行阳性孔筛选，用经ICP-AES检测获得Cu2+螯合物做铜离子标准液，选择强阳性、抑制率高、细胞生长旺盛的孔进行有限稀释克隆化，扩大培养、冻存并鉴定，获得一株杂交瘤细胞株；之后采用体内诱生腹水法制备Cu2+mAb；
多抗制备：用Cu2+-ITCBE-BSA，Cu2+-ITCBE-KLH载体蛋白结合抗原免疫新西兰白兔，免疫剂量为50μg～100μg／次，背部皮下分多点注射；首免，用合成的人工抗原与等量弗氏完全佐剂乳化；加强免疫，用合成的人工抗原与等量弗氏不完全佐剂乳化，连续免疫4～5次，每次间隔4～8周，最后一次免疫后10～15天，以ELISA法测其定效价达到105以上时，采血并分离收集高免血清。以饱和硫酸铵盐析法提取IgG抗体，-20℃冻存备用。
本发明的检测铜离子的酶联免疫试剂盒具有下列各项优点：
①特异性强，敏感性高。该检测铜离子的酶联免疫试剂盒以高亲和力的单克隆抗体(mAb)或多克隆抗体(pAb)为基础制备而成。酶联免疫试剂盒采用的是非均相间接竞争模式，其基本原理是样品中的Cu2+与过量鳌合剂鳌合成可溶性的Cu2+-鳌合剂复合物后，将其与已包被于酶标板上的包被抗原Cu2+-鳌合剂-载体蛋白复合物共同竞争Cu2+mAb上有限的结合位点，反应达到平衡后洗脱多余的Cu2+-鳌合剂和Cu2+mAb，然后与酶标二抗反应，用酶及其底物显色系统显示抗原抗体的结合情况，进而定量检测Cu2+在样品中的含量。该试剂盒最低检测限为0.42μg／L，检测范围为2.83～456.04μg／L，与其它金属离子交叉反应较小。
②简便、快速、时效性强。使用该检测铜离子的酶联免疫试剂盒，无需任何其它试剂和仪器，可现场操作，只要按照该试剂盒说明书上操作步骤进行检测，60分钟内即可判定检测结果，并根据结果可计算样品中铜离子含量。
③结果显示形象、直观、准确。酶联免疫试剂盒根据显色液和底物不同显示不同颜色，本试剂盒显示蓝色，终止后显色为黄色肉眼可见。与所提供的标准检测液比较，显色越深含量越低或不含，显色越淡或不显色者说明样品中含有待检物，且含量越高如有酶标仪可进行度数，度数后根据稀释比例进行计算可得出铜离子的含量。结果判定形象、直观、准确，简单明了，不易出现假阳性和假阴性等人为误判。
④节省费用，适用范围广，便于推广。使用酶联免疫试剂盒，比用仪器分析的费用大幅下降。另外，酶联免疫试剂盒的适用范围广，可满足不同层次人员需要，包括专业检验，海关检疫，卫生检疫，质量监测，加工企业和养殖场户等，便于推广应用，具有广阔的市场前景和明显的经济、社会效益。
附图说明：
图1为检测铜离子酶联免疫试剂盒的标准曲线图。
具体实施方式：
一种用于检测铜离子的酶联免疫试剂盒，它包括检测酶标板、用于检测的试剂，其中试剂包括样品稀释液，样品提取液。要制成铜离子的酶联免疫试剂盒，首先需要对重金属铜离子与双功能螯合剂进行螯合反应，制备铜离子螯合物偶联载体蛋白，用于制备相应的检测抗体。
本发明还包括食品、饲料、饮料、茶叶、土壤等样品预处理方法。饲料、茶叶、土壤等固体样品，研磨捣碎后称取1.0g样品，加入10mL HEPES缓冲液，搅拌30min，3000r／min离心5min，在上清液中加入30mg EDTA，并用N aOH溶液调pH至6.0，室温反应过夜；市场购买的饮料、自来水等液体样品，取10mL样品，加入30mg EDTA，用NaOH溶液调pH至6.0，室温反应过夜，反应后待检。
本发明的检测铜离子的酶联免疫试剂盒，样品处理简单，适合于大量样品的快速检测和筛选，具有高特异性、高灵敏度、高精确率等特点，最低检测限为0.42μg／L，检测范围为2.83～456.04μg／L。
以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。
实施例1、铜离子螯合物、多克隆、单克隆抗体的制备
1.1铜离子螯合物的改造与鉴定
称取76.7mg纯度为99.99％的硝酸铜溶于100μL纯度为优级的浓硝酸，待充分溶解加超纯水使终体积为1mL，形成浓度为409mmoL／L铜溶液。称取10mgEDTA溶于10mM HBS缓冲液配制EDTA溶液。将两者混匀后，用NaOH调节pH值为6.0，室温摇床反应24小时，即形成Cu2+-EDTA鳌合物溶液。
将100μg／mL的Cu2+标准储备液用2％的硝酸稀释成0μg／mL、0.25μg／mL、0.5μg／mL、1μg／mL、2μg／mL、4μg／mL的浓度梯度，仪器软件自动绘制标准曲线，并得出线性回归方程；样品溶液50倍稀释，用226nm波长在最佳优化实验条件下进行测定，仪器软件自动分析结果。计算出所螯合物中的铜离子含量。
1.2铜离子人工抗原的合成与鉴定
分别称取血蓝蛋白(KLH)，牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)20mg溶于1mL浓度为10mmoL／L，pH9.0的N-2-羟乙基哌嗪-N-乙磺酸缓冲液(HBS)中形成KLH、BSA溶液。
称取10mg金属鳌合剂1-(4-异硫氰基苯基)-乙二胺四乙酸(ITCBE)溶于1mL二甲基亚飒(DMSO)中形成23nmoL／L金属鳌合剂溶液；分别取160uL浓度为23nmol／L的金属鳌合剂溶液轻轻搅拌下逐滴滴加到1mLKLH，BSA和OVA溶液中，用10mol／L NaOH调节pH至9.0，室温下反应24h。反应产物用30Kd的超滤管纯化，超滤管内加入反应产物超滤，超滤管内先用10mmoL／L，pH9.0HBS冲洗3次，再用10mmoL／L，pH7.4的HBS缓冲液洗2次，除去其中未反应的小分子金属鳌合剂。
取16μL浓度为409mmoL／L铜溶液滴加到已反应过的载体蛋白溶液中，用用NaOH调节pH值至9.0，室温摇床反应24小时，然后移入透析袋中透析5天。所得产物即分别为纯化的铜离子鳌合后的人工抗原：Cu2+-ITCBE-BSA，Cu2+-ITCBE-KLH，包被抗原Cu2+-ITCBE-OVA。用蛋白核酸分析仪在280nm波长下测定人工抗原中的蛋白浓度。
1.3铜离子单克隆抗体(Cu2+mAb)和多克隆抗体(Cu2+pAb)的获得
用Cu2+-ITCBE-BSA、Cu2+-ITCBE-KLH分别免疫6周雌性BALB／C小鼠5只，剂量为20μg／0.2mL／只，背部皮下分点注射。采用细胞融合技术，在PEG-1500作用下与NS0骨髓瘤细胞进行融合；用间接ELISA和阻断ELISA进行阳性孔筛选，筛选后进行有限稀释克隆化，扩大培养、冻存并鉴定，获得一株杂交瘤细胞株。之后采用体内诱生腹水法制备Cu2+mAb。用蛋白核酸分析仪在280nm波长下测定所获抗体的IgG含量。
多抗制备：用Cu2+-ITCBE-BSA、Cu2+-ITCBE-KLH免疫新西兰白兔，免疫剂量为50μg～100μg／次，背部皮下分多点注射。首免，加等量弗氏完全佐剂(FCA)乳化；加强免疫，加等量弗氏不完全佐剂(FIA)乳化，连续免疫4～5次，每次间隔4～8周，最后一次免疫后10～15天，以ELISA法测其定效价达到1∶105以上时，采血并分离收集高免血清。以饱和硫酸铵盐析法提取IgG抗体，-20℃冻存备用。
实施例2、铜离子检测酶联免疫试剂盒的制备
2.1联免疫试剂盒检测反应原理
联免疫试剂盒选用合适的包被抗原浓度包被酶标板，用异源蛋白封闭后制成的检测试剂盒，可用于样品的检测。将待测已处理后的样品按要求取用和提供的多克隆或单克隆抗体结合反应，未完全结合的抗体与酶标板上的位点结合，通过辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠或兔抗鼠二抗结合反应，通过显色体现显色，观察结果，或用酶标仪渎度数，根据结果计算待测物的含量。结果的判断同所提供的阴性、阳性对照比较，如显色深浅同阴性对照完全相同，则视为阴性，即为不含待测物；如显色较弱，或是不显色则为阳性或弱阳性，即为含有待测物。如空白对照显色，或阴性对照不显色则视为无效。
2.2铜离子检测酶联免疫试剂盒的制备
(1)待标铜离子mAb或pAb的工作浓度将待标铜离子mAb或pAb溶液10000rpm离心30min，除去杂质。采用方阵法筛选确定铜离子mAb或pAb的工作浓度。用不同浓度的包被抗原包被，测出最佳包被浓度和最佳抗体浓度。本试剂盒最佳包被浓度即用Cu2+-ITCBE-BSA包被，蛋白质浓度为0.25mg／mL；铜离子mAb的工作浓度为1∶1.6×105；铜离子pAb的工作浓度为1∶2.56×105。
(2)铜离子检测酶联免疫试剂盒标准品的制备称取10mgEDTA溶于10mM HBS缓冲液配制EDTA溶液，将Cu2+标准储备液稀释成0ng／mL、3.906ng／mL、7.812ng／mL、15.625ng／mL、31.25ng／mL、62.5ng／mL、125ng／mL、250ng／mL、500ng／mL、1000ng／mL的浓度梯度，用NaOH调节pH值为6.0，室温摇床反应24小时，即形成Cu2+-EDTA鳌合物溶液。将100μg／mL的Cu2+标准储备液用2％的硝酸稀释成0μg／mL、0.25μg／mL、0.5μg／mL、1μg／mL、2μg／mL、4μg／mL的浓度梯度，仪器软件自动绘制标准曲线，并得出线性回归方程；样品溶液50倍稀释，用226nm波长在最佳优化实验条件下进行测定，仪器软件自动分析结果。
(3)铜离子检测酶联免疫试剂盒的组装铜离子残留与含量的酶联免疫试剂盒，标准配置包括C1号液(最佳工作浓度的Cu2+mAb)，C2号液(最佳工作浓度的RaMIgG-HRP)，C3号液(底物显色剂A)，C4号液(底物显色剂B)，Cu2+-ITCBE-OVA包被并封闭好的8×12(96孔)或酶8×12(48孔)酶标板，C5号液(终止液)，Cu2+标准品稀释液1～9，洗液(PBST)。洗液为0.01mol／L、pH7.4的磷酸盐缓冲液含0.05％Tween-20(PBST)，底物显色剂A为过氧化脲，底物显色剂B为四甲基联苯胺(TMB)，终止液为2mol／L的硫酸溶液。
见表1。
表1铜离子酶联免疫试剂盒的标准配置
(4)铜离子酶联免疫试剂盒操作步骤
A1、样品前处理方法：用0.1mol／L EDTA溶液处理样品，离心取上清液用于检测。
A2、检测步骤：第一步除第一排最后两孔分别为阴性对照和空白对照外，每孔加入50μL工作浓度的C1号液Cu2+mAb，同时加入等体积铜离子标准液，其他孔根据检测要求加入50μL已处理的待检样品和等体积工作浓度的C1号液Cu2+mAb，混匀后37℃温育15min，反应后用PBST洗板；第二步每孔加入50μL工作浓度的RaRIgG-HRP，37℃温育25min，PBST洗板；第三步每孔加入100μL的酶底物A、B混合液显色，室温反应5min，每孔加入100μL终止液，用酶标仪读A450值，记录结果。
A3、分析检测结果：将获得的OD值放入标准曲线的回归方程式中进行计算得出待测样品中铜离子的含量。
(5)铜离子酶联免疫试剂盒标准曲线阻断ELISA测定单克隆抗体对不同浓度Cu2+标准品的抑制率，以抑制率B／B0％(B是Cu2+不同标准浓度的A450值，B0是Cu2+0μg／L的标准浓度的A450值)为纵坐标，以不同标准品浓度的对数值为横坐标，在半对数坐标纸上绘制标准曲线，推导回归方程，进行回归分析。标准曲线见附图1。线性的回归方程为y=一36.235x+106.36，R2=0.9524，IC50为35.64μg／L。
实施例3、铜离子酶联免疫试剂盒的性能
3.1灵敏性测定按照阻断ELISA最低检测限为B／B0％=120％的方法，根据曲线回归方程计算出试剂盒的灵敏度，确定检测限。测定结果，检测限为0.42μg／L。根据阻断ELISA所得结果中B／B0％=10％～90％为检测范围，根据曲线回归方程计算出试剂盒的检测范围为2.83～456.04μg／L。
3.2准确性测定将Cu2+标准品以终浓度分别为5、10、20、40μg／L添加到土壤、自来水中，设6个重复，以回收率和变异系数(CV)确定其准确度。结果见表2。土壤的回收率在77.25％～82.3％，平均80.56％，变异系数(CV)在9.5％～13.7％；自来水的回收率在80.8％～88.35％，平均84.21％，CV在9.8％～14.6％；平均CV小于15％，表明试剂盒具有较高准确
度。见表2。
表2铜离子酶联免疫试剂盒添加回收试验(n=6)
3.3特异性测定采用交叉反应试验，选择汞、铅、镉、锌、铬、钴、铁等金属离子与EDTA的螯合物、EDTA、ITCBE、DOTA、DTPA为抑制物，用阻断ELISA测定各抑制物的IC50，以Cu2+mAb对Cu2+的IC50和对其它各竞争物的IC50的百分率为其交叉反应率(CR％)。见表3。
表3Cu2+-EDTA mAb与其它金属螯合物的交叉反应
化合物 IC50(μg／L) 交叉反应率(％)
Cu2+-EDTA 35.64 100
EDTA 113.15 31.5
ITCBE 135 26.4
DTPA 1×103 ＜0.1
DOTA 1×103 ＜0.1
C02+-EDTA ＞4×103 ＜0.1
Hg2+-EDTA ＞4×103 ＜0.1
pb2+-EDTA ＞4×103 ＜0.1
Fe2+-EDTA ＞4×103 ＜0.1
Cd2+-EDTA ＞4×103 ＜0.1
Mo2+-EDTA ＞4×103 ＜0.1
Cr3+-EDTA ＞4×103 ＜0.1
Zn2+-EDTA ＞4×103 ＜0.1
3.4稳定性：取同一批次的试剂盒保存于4℃，测定保存6个月中各月份的A450值、IC50、R2变化情况，确定其稳定性。见表4。
表4试剂盒的保存期
保存天数(d) IC50(μg/L) R2 最大吸光值
1 35.64 0.9524 1.112
30 35.76 0.9659 1.056
60 32.65 0.9327 0.9648
90 31.82 0.9659 0.9598
120 30.49 0.9345 0.9371
150 30.43 0.9572 0.8479
180 29.91 0.9487 0.8387
实施例4、铜离子酶联免疫试剂盒的应用
4.1固体样品的提取(饲料、动物组织、土壤等)
取组织(鸡肉、兔肉、饲料等)均质物1.0g，研磨捣碎后加入过量的已稀释的EDTA溶液混匀，用NaOH调节pH值为6.0，室温摇床反应24小时，即形成Cu2+-EDTA鳌合物溶液。
液体样品的提取不需研磨可直接加入EDTA溶液混匀进行螯合，用于检测。
4.2检测操作方法
第一步除第一排最后两孔分别为阴性对照和空白对照外，每孔加入50μL工作浓度的C1号液Cu2+mAb，同时加入等体积不同浓度的铜离子标准液，其他孔根据检测要求加入50μL已处理的待检样品和等体积工作浓度的C1号液Cu2+mAb，混匀后37℃温育15min，反应后用PBST洗板；第二步每孔加入50μL工作浓度的RaRIgG-HRP，37℃温育25min，PBST洗板；第三步每孔加入100μL的酶底物A、B混合液显色，室温反应5min，每孔加入100μL终止液，用酶标仪读A450值，记录结果。
将获得的第一排的铜离子标准液的OD值按照公式，绘出标准曲线图，并添加的回归方程，待检物的OD值按照回归方程，进行计算得出待测样品中铜离子的含量。如果没有酶标仪进行度数的，可根据肉眼观察判断结果，判断方法是观察待测物的显色深浅与不同铜离子的标准液的显色进行比较，相近颜色的铜离子标准液的浓度可大概判定为该待测物的铜离子含量。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。

Claims (3)

1.一种用于检测食品、饮料、茶叶、土壤、动物组织样品中的铜离子含量的酶联免疫试剂盒，其特征在于：
包括包被Cu2+-ITCBE-OVA并封闭好的96孔或48孔酶标板，以Cu2+-ITCBE-BSA为抗原制备的铜离子多克隆或单克隆抗体Cu2+mAb或pAb，酶标二抗为兔抗鼠或羊抗鼠抗体标记辣根过氧化物酶RaMIgG-HRP或GaMIgG-HRP，Cu2+螯合物配置的标准品稀释液、洗液PBST为0.01mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液含0.05％Tween-20，底物显色剂A为过氧化脲，底物显色剂B为四甲基联苯胺，终止液为2mol/L的硫酸溶液；
所述抗原Cu2+-ITCBE-OVA、Cu2+-ITCBE-BSA的制备步骤如下：
(1)铜离子螯合物的改造与鉴定
称取76.7mg纯度为99.99％的硝酸铜溶于100μL纯度为优级的浓硝酸，待充分溶解加超纯水使终体积为1mL，形成浓度为409mmol/L铜溶液；称取10mgEDTA溶于10mM HBS缓冲液配制EDTA溶液；将两者混匀后，用NaOH调节pH值为6.0，室温摇床反应24小时，即形成Cu2+-EDTA鳌合物溶液；
将100μg/mL的Cu2+标准储备液用2％的硝酸稀释成0μg/mL、0.25μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL的浓度梯度，仪器软件自动绘制标准曲线，并得出线性回归方程；样品溶液50倍稀释，用226nm波长在最佳优化实验条件下进行测定，仪器软件自动分析结果；根据铜离子标准品稀释液绘制的标准曲线计算出所螯合物中的铜离子含量；
(2)铜离子人工抗原的合成与鉴定
分别称取牛血清白蛋白BSA或卵清蛋白OVA 20mg溶于1mL浓度为10mmol/L，pH9.0的N-2-羟乙基哌嗪-N-乙磺酸缓冲液HBS中形成BSA或OVA溶液；
称取10mg金属鳌合剂1-(4-异硫氰基苯基)-乙二胺四乙酸ITCBE溶子1mL二甲基亚砜中形成23nmol/L金属鳌合剂溶液；分别取160μL浓度为23nmol/L的金属鳌合剂溶液轻轻搅拌下逐滴滴加到1mLBSA或OVA溶液中，用10mol/LNaOH调节pH至9.0，室温下反应24h；反应产物用30Kd的超滤管纯化，超滤管内加入反应产物超滤，超滤管内先用10mmol/L，pH9.0 HBS冲洗3次，再用10mmol/L，pH7.4的HBS缓冲液洗2次，除去其中未反应的小分子金属鳌合剂；
取16μL浓度为409mmol/L铜溶液滴加到已反应过的载体蛋白溶液中，用NaOH调节pH值至9.0，室温摇床反应24小时，然后移入透析袋中透析5天；所得产物即分别为纯化的铜离子鳌合后的人工抗原：Cu2+-ITCBE-BSA，包被抗原Cu2+-ITCBE-OVA；用蛋白核酸分析仪在280nm波长下测定人工抗原中的蛋白浓度；
所述单克隆抗体Cu2+mAb、多克隆抗体Cu2+pAb的制备步骤如下：
(1)铜离子单克隆抗体Cu2+mAb的获得
用Cu2+-ITCBE-BSA分别免疫6周雌性BALB/C小鼠5只，剂量为20μg/0.2mL/只，背部皮下分点注射；采用细胞融合技术，在PEG-1500作用下与NS0骨髓瘤细胞进行融合；用间接ELISA和阻断ELISA进行阳性孔筛选，筛选后进行有限稀释克隆化，扩大培养、冻存并鉴定，获得一株杂交瘤细胞株；之后采用体内诱生腹水法制备Cu2+mAb；用蛋白核酸分析仪在280nm波长下测定所获抗体的IgG含量；
(2)多克隆抗体Cu2+pAb的获得
用Cu2+-ITCBE-BSA免疫新西兰白兔，免疫剂量为50μg～100μg/次，背部皮下分多点注射；首免，加等量弗氏完全佐剂FCA乳化；加强免疫，加等量弗氏不完全佐剂FIA乳化，连续免疫4～5次，每次间隔4～8周，最后一次免疫后10～15天，以ELISA法测其定效价达到1∶105以上时，采血并分离收集高免血清；以饱和硫酸铵盐析法提取IgG抗体，-20℃冻存备用；
所述铜离子检测酶联免疫试剂盒的制备
(1)待标铜离子mAb或pAb的工作浓度
将待标铜离子mAb或pAb溶液10000rpm离心30min，除去杂质；采用方阵法筛选确定铜离子mAb或pAb的工作浓度；铜离子mAb的工作浓度为1∶1.6×105；铜离子pAb的工作浓度为1∶2.56×105；
(2)铜离子检测酶联免疫试剂盒标准品的制备
称取10mgEDTA溶于10mM HBS缓冲液配制EDTA溶液，将Cu2+标准储备液稀释成0ng/mL、3.906ng/mL、7.812ng/mL、15.625ng/mL、31.25ng/mL、62.5ng/mL、125ng/mL、250ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL的浓度梯度，用NaOH调节pH值为6.0，室温摇床反应24小时，即形成Cu2 +-EDTA鳌合物溶液；将100μg/mL的Cu2+标准储备液用2％的硝酸稀释成0μg/mL、0.25μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL的浓度梯度，仪器软件自动绘制标准曲线，并得出线性回归方程；样品溶液50倍稀释，用226nm波长在最佳优化实验条件下进行测定，仪器软件自动分析结果；
(3)铜离子检测酶联免疫试剂盒的组装铜离子残留与含量的酶联免疫试剂盒，标准配置包括最佳工作浓度的Cu2+mAb，最佳工作浓度的RaMIgG-HRP，底物显色剂A，底物显色剂B，Cu2+-ITCBE-OVA包被并封闭好的96孔或48孔酶标板，终止液，Cu2+标准品稀释液1～9，洗液PBST；洗液为0.01mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液含0.05％Tween-20，底物显色剂A为过氧化脲，底物显色剂B为四甲基联苯胺，终止液为2mol/L的硫酸溶液；
所述铜离子酶联免疫试剂盒操作步骤如下：
A1、样品前处理方法：用0.1mol/L EDTA溶液处理样品，离心取上清液用于检测；
A2、检测步骤：第一步除第一排最后两孔分别为阴性对照和空白对照外，每孔加入50μL工作浓度的Cu2+mAb，同时加入等体积铜离子标准液，其他孔根据检测要求加入50μL已处理的待检样品和等体积工作浓度的Cu2+mAb，混匀后37℃温育15min，反应后用PBST洗板；第二步每孔加入50μL工作浓度的RaMIgG-HRP，37℃温育25min，PBST洗板；第三步每孔加入100μL的酶底物A、B混合液显色，室温反应5min，每孔加入100μL终止液，用酶标仪读A450值，记录结果；
A3、分析检测结果：将获得的OD值放入标准曲线的回归方程式中进行计算得出待测样品中铜离子的含量；
所述铜离子酶联免疫试剂盒标准曲线阻断ELISA测定单克隆抗体对不同浓度Cu2+标准品的抑制率，以抑制率B/B0％为纵坐标，其中B是Cu2+不同标准浓度的A450值，B0是Cu2+0μg/L的标准浓度的A450值，以不同标准品浓度的对数值为横坐标，在半对数坐标纸上绘制标准曲线，推导回归方程，进行回归分析；线性的回归方程为y＝-36.235x+106.36，R2＝0.9524，IC50为35.64μg/L。
2.权利要求1所述的用于检测食品、饮料、茶叶、土壤、动物组织样品中的铜离子含量的酶联免疫试剂盒在检测Cu2+浓度中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其检测结果分析：将获得的OD值放入标准曲线的回归方程式中进行计算得出待测样品中Cu2+含量；线性的回归方程为y＝-36.235x+106.36，R2＝0.9524，IC50为35.64μg/L；检测限为0.42μg/L，检测范围为2.83～456.04μg/L。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105486822A (zh) * 2014-10-11 2016-04-13 江苏维赛科技生物发展有限公司 一种用于检测样品中重金属离子砷含量的免疫试剂盒
CN106596923A (zh) * 2015-10-15 2017-04-26 镇江亿特生物科技发展有限公司 用于检测样品中重金属钴离子含量的酶联免疫试剂盒
CN106841626B (zh) * 2017-02-23 2019-06-07 河南科技学院 一种环境污染中铜离子直接竞争酶联免疫检测试剂盒及其应用
CN108802360B (zh) * 2018-05-28 2023-08-25 首都医科大学 一种血清中可交换铜和铜蓝蛋白一步同时检测用试剂盒、制备方法及应用
CN109342136B (zh) * 2018-09-30 2021-03-12 台州中知英健机械自动化有限公司 一种茶叶重金属含量的检测方法
CN109374880A (zh) * 2018-09-30 2019-02-22 广西驰胜农业科技有限公司 一种茶叶重金属含量的准确检测方法
CN111690618B (zh) * 2020-07-08 2022-03-15 江南大学 一株分泌抗铝单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用
CN114778725B (zh) * 2022-04-18 2023-08-25 安徽农业大学 一种基于QuEChERS法结合UPLC-MS/MS的吡咯里西啶碱检测方法及应用
CN115825042A (zh) * 2022-11-28 2023-03-21 湖北兴福电子材料股份有限公司 一种检测苯基脲中痕量金属元素的方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101560257A (zh) * 2009-04-27 2009-10-21 南京农业大学 重金属铜单克隆抗体及其制备方法
CN101768217A (zh) * 2010-01-20 2010-07-07 中国农业大学 铜离子抗原及其制备方法与应用
CN101775074A (zh) * 2009-11-18 2010-07-14 吉林大学 重金属Cu2+完全抗原及其制备方法
CN101968481A (zh) * 2010-08-13 2011-02-09 中国农业大学 一种检测样品中是否含有重金属铜离子的方法及其专用试剂盒
CN102680691A (zh) * 2012-01-15 2012-09-19 河南科技大学 一种检测铜离子的酶联免疫试剂盒及其应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101560257A (zh) * 2009-04-27 2009-10-21 南京农业大学 重金属铜单克隆抗体及其制备方法
CN101775074A (zh) * 2009-11-18 2010-07-14 吉林大学 重金属Cu2+完全抗原及其制备方法
CN101768217A (zh) * 2010-01-20 2010-07-07 中国农业大学 铜离子抗原及其制备方法与应用
CN101968481A (zh) * 2010-08-13 2011-02-09 中国农业大学 一种检测样品中是否含有重金属铜离子的方法及其专用试剂盒
CN102680691A (zh) * 2012-01-15 2012-09-19 河南科技大学 一种检测铜离子的酶联免疫试剂盒及其应用

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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重金属铜单克隆抗体的制备及免疫检测方法的建立;刘文迪;《中国优秀硕士学位论文全文数据库》;20121115;参见第8－40页 *

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