CN103439508B - 用于检测铬离子的间接竞争酶联免疫试剂盒及其组建和检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于检测铬离子的酶联免疫试剂盒及其组建和检测方法。试剂盒内设有用三价铬离子包被抗原包被过的酶标板、抗三价铬离子的单克隆抗体、酶标二抗、底物显色液、终止液、三价铬离子标准溶液、洗液浓缩液、样品处理液。检测前进行样品处理，使样品中Cr³⁺形成Cr³⁺-EDTA，然后用试剂盒进行检测。本发明的铬离子酶联免疫试剂盒，能检测痕量的铬离子，检测Cr³⁺的灵敏度为2ng/mL，具有快速、简便、敏感、特异、经济等特性，检测步骤少，节省检测时间，降低操作误差；检测成本不到理化分析方法的1/20，时效性强，可进行现场检测，主要用于环境、土壤、水、食品中铬离子污染残留的大批量样品的筛检。

Description

用于检测铬离子的间接竞争酶联免疫试剂盒及其组建和检测方法

技术领域

本发明涉及酶联免疫和铬离子检测领域，特别是涉及一种用于检测铬离子的酶联免疫试剂盒及其组建和检测方法。

背景技术

铬是自然界中广泛存在的一种元素，分布于土壤、大气、水及生物体中，主要以三价铬（Cr³⁺）和六价铬（Cr⁶⁺）的形式存在。铬是人和动物体必须微量元素之一，Cr³⁺具有葡萄糖耐量因子（GTF）的活性，参与调节生物体内胆固醇和糖代谢作用，Cr³⁺缺乏会使机体血管内壁的脂肪产生沉积而导致动脉硬化。但Cr³⁺和Cr⁶⁺又是毒性物质，Cr⁶⁺的毒性是Cr³⁺毒性的100倍，许多研究证实，Cr³⁺具有致癌性和诱发基因突变的毒性作用；Cr⁶⁺具有致癌毒性、黏膜毒性、肝肾毒性。因此，我国《生活饮用水卫生标准》规定饮用水中铬离子含量不得超过50ng/mL，食品铬含量（GB14961-94）粮食食品不超过1000ng/mL，果蔬食品不超过500ng/mL，动物性食品肉蛋不超过1000ng/mL，铬离子是食品安全监管的重点对象。

由于铬具有良好的性能，在电镀、电池、汽车、航空、颜料、油漆、印刷、塑料等行业中发挥着重要作用，铬环境污染日趋严重，对人体健康的危害也愈来愈大，铬污染超标事件屡有发生，已成为环境污染的公害之一。2011年8月，曲靖铬渣污染事件，地下水的出水口检测出的六价铬含量超标200多倍；2012年4月，铬超标药用胶囊事件造成经济损失达160余亿元。

目前，已建立的食品铬检测技术主要有石墨炉原子吸收光谱法（GFAAS）、火焰原子吸收光谱法（FAAS）、电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）、电感耦合等离子体原子发射光谱法（ICP-AES）、氢化物发生-原子荧光光谱法（HG-AFS）、电化学分析法等，但这些理化分析方法需要昂贵的仪器设备和熟练的专业人员，检测烦琐费时、周期长，费用高，不能现场操作，样品筛检量小等，其应用受到了限制。

因此，研制快速、简便、敏感、特异、经济、筛检量大的铬离子快速检测技术，对于减少环境污染、提高食品质量、保障食品安全具有重要意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题：提供一种能够快速、简便、敏感、特异的检测铬离子的酶联免疫试剂盒；

还提供了该酶联免疫试剂盒的组建方法以及检测方法。

本发明的技术方案：

一种用于检测铬离子的间接竞争酶联免疫试剂盒，包括盒体，盒体内设有用三价铬离子包被抗原包被过的酶标板、抗三价铬离子的单克隆抗体、酶标二抗、底物显色液、终止液、三价铬离子标准溶液、洗液浓缩液、样品处理液。

所述的三价铬离子包被抗原是由以下方法制备的：

 （1）称取10 mg异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸鳌合剂ITCBE溶于 1mL二甲基亚砜DMSO形成金属鳌合剂溶液；称取18.1 mg CrCL₃·6H₂O溶于1 mL浓度为10 mmol/L、pH值为8.0的HEPES缓冲液中，形成Cr³⁺溶液；将金属鳌合剂溶液和Cr³⁺溶液混合，并用NaOH调节pH值至7.0，然后在室温下放在摇床上反应12 h，即形成Cr³⁺-ITCBE鳌合物半抗原溶液；

（2）称取20 mg 卵清蛋白OVA溶于1 mL浓度为0.1 mol/L、pH值为8.0的HEPES缓冲液中，形成载体蛋白溶液；

（3）取1 mL Cr³⁺-ITCBE鳌合物半抗原溶液加入到1 mL载体蛋白溶液中，并用NaOH调节pH值至9.0，室温摇床反应24 h，然后移入透析袋中透析5天，收集透析液，即形成包被抗原Cr³⁺-ITCBE-OVA，收集分装，－20℃冻存备用。

所述酶标板按如下方法包被：包被抗原为Cr³⁺-ITCBE-OVA，包被浓度为2 μg/mL，包被溶液为0.05 moL/L pH 9.6的碳酸盐缓冲液，包被剂量为100 μL/孔，37 ℃温育2 h或室温8 h，用洗液浓缩液PBST洗涤3次，用5%的猪血清封闭，每孔250 μL，37 ℃温育1 h，再用PBST洗涤3次；所述洗液浓缩液PBST为0.01 mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液，其中含0.05%的Tween-20。

所述的抗三价铬离子单克隆抗体是按以下方法制备的：

制备免疫抗原：称取10 mg异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸鳌合剂ITCBE溶于1mL二甲基亚砜DMSO形成金属鳌合剂溶液；称取18.1 mg CrCL₃·6H₂O溶于1mL浓度为10 mmol/L、pH值为8.0的HEPES缓冲液中，形成Cr³⁺溶液；将金属鳌合剂溶液和Cr³⁺溶液混合，并用NaOH调节pH值至7.0，然后在室温下放在摇床上反应12 h，形成Cr³⁺-ITCBE鳌合物半抗原溶液；称取20 mg牛血清白蛋白BSA溶于1 mL浓度为0.1 mol/L、pH值为8.0的HEPES缓冲液中，形成载体蛋白溶液；取1 mL Cr³⁺-ITCBE鳌合物半抗原溶液加入到1 mL载体蛋白溶液中，并用NaOH调节pH值至9.0，室温摇床反应24 h，然后移入透析袋中透析5天，收集透析液，即形成免疫抗原Cr³⁺-ITCBE-BSA，收集分装，－20℃冻存备用；

免疫动物：以Cr³⁺-ITCBE-BSA为免疫抗原，以Balb/c小鼠作为免疫动物，背部皮下多点注射，免疫剂量为每只每次50～100 μg，首免用弗氏完全佐剂，加强免疫用弗氏不完全佐剂，首免后3周进行第二次免疫，以后间隔2周免疫，共免疫5次；

选择细胞融合备用小鼠：间接ELISA法检测抗血清中Cr³⁺螯合物多克隆抗体的效价，阻断ELISA法检测Cr³⁺-ITCBE多克隆抗体对Cr³⁺-ITCBE的半数抑制浓度IC ₅₀，挑选效价最高、IC ₅₀最低的小鼠，超免用于细胞融合；

制备阳性杂交瘤细胞：取NS0骨髓瘤细胞与免疫小鼠脾细胞用PEG进行细胞融合，经过四次有限稀释法亚克隆，获得稳定分泌抗三价铬离子单克隆抗体的细胞株；

制备单克隆抗体：对经产母鼠腹腔注射杂交瘤细胞株，采集腹水纯化，获得抗三价铬离子的单克隆抗体。

所述的酶标二抗为羊抗鼠酶标二抗GaMIgG-HRP或兔抗鼠酶标二抗RaMIgG-HRP；所述的底物显色液由显色剂A和显色剂B组成，显色剂A为过氧化氢或过氧化脲，显色剂B为邻苯二胺或四甲基联苯胺；所述的终止液为2 mol/L硫酸溶液；所述的三价铬离子标准溶液为三价铬离子溶解于0.01 mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液得到的系列浓度的溶液；所述的洗液浓缩液为0.1 mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液，其中含0.05%的Tween-20；所述的样品处理液包括A液和B液，A液为1mol/L、pH 9.5的Na₂SO₃溶液，B液为0.1 mol/L的EDTA溶液；用于制备所述酶标板的固相材料为聚苯乙烯、聚乙烯或聚丙烯。

间接竞争酶联免疫试剂盒的组建方法，所述试剂盒包括：Cr³⁺-ITCBE-OVA包被并封闭的酶标板；C1号液：工作浓度为1∶10000的抗三价铬离子的单克隆抗体；C2号液：工作浓度为1∶1000的羊抗鼠酶标二抗GaMIgG-HRP或兔抗鼠酶标二抗RaMIgG-HRP， C3号液：显色剂A，为过氧化氢或过氧化脲、C4号液：显色剂B，为四甲基联苯胺或邻苯二胺，C5号液：终止液，为2moL/L的硫酸溶液；铬离子标准溶液为三价铬离子溶解于0.01 mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液得到的系列浓度的溶液；洗液浓缩液PBST为0.1mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液，其中含0.05%的Tween-20；样品处理液A液、B液：A液为1 mol/L、pH 9.5的Na₂SO₃溶液，B液为0.1 mol/L的 EDTA溶液。

所述试剂盒检测Cr³⁺的灵敏度为2 ng/mL，半数抑制浓度IC ₅₀为9.84 ng/mL，检测范围为2.0～128.0 ng/mL。

间接竞争酶联免疫试剂盒的检测方法，包括以下步骤：

（1）样品前处理：向预处理的样品中先加入过量样品处理液A，将样品中酸酐形式的Cr⁶⁺完全还原为游离的Cr³⁺；之后用过量样品处理液B处理样品，使Cr³⁺完全形成Cr³⁺-EDTA，离心取上清液用于检测；其中样品处理液A为1mol/L、pH 9.5的Na₂SO₃溶液；样品处理液B为0.1 mol/L的 EDTA溶液；

（2）检测步骤：第一步，每孔加入50 μL工作浓度的抗铬离子单克隆抗体，同时等体积加入铬离子的标准溶液或样品溶液，设阴性和空白对照，37℃温育15 min，用PBST缓冲液洗板；第二步，每孔加入50 μL工作浓度的酶标二抗，37℃温育25 min，用PBST缓冲液洗涤酶标板；第三步，每孔加入100 μL的底物显色液A、B的混合液显色，室温反应5 min，每孔加入100 μL终止液，用酶标仪读A ₄₅₀值，记录结果。

本发明的积极有益效果：

1. 本发明试剂盒的组建方法，制备了重金属三价铬离子的人工抗原，得到了适宜分子结合比的人工免疫抗原和包被抗原，并获得了高效价、敏感和特异性的抗血清，为试剂盒的组建提供了必要条件。

2. 本发明试剂盒的组建方法，制备了抗铬离子的单克隆抗体，抗体的腹水效价为1∶6.4×10⁵，亲和常数Ka为1.76×10⁹ L/moL，与其它重金属离子的交叉反应率小于0.05%，该抗体具有高效价、高亲和力、特异性强等特性，为其铬离子的痕量快速检测提供了保障。

3. 本发明的铬离子酶联免疫试剂盒，能痕量检测铬离子，具有快速、简便、敏感、特异、经济等特性，检测步骤少，节省检测时间，降低操作误差。快速，45～50 min出结果，比理化检测方法（3 d）大大节省时间；简便，不需要任何附加仪器和试剂，人人均可操作；敏感，检测灵敏度为2 ng/mL，符合国家限量标准要求，与理化检测方法灵敏度相当；特异，与其它重金属离子无交叉反应；经济，与理化检测方法相比，检测成本不到理化分析方法的1/20；检测的时效性强，可进行现场检测。

4. 本发明的铬离子酶联免疫试剂盒，主要用于环境、土壤、水、食品中铬离子污染残留的大批量样品筛检。对样品的前处理要求低且处理过程简单，既可用于大批样品的筛检，又可进行小批样品的快速检测，不仅为环境、食品安全提供技术支撑，也为食品进出口检验、食品检验、环境污染监测评价等提供有效的技术手段和检测方法，对于提高食品安全、保障人民身心健康、保持环境友好与可持续发展具有重要现实意义，该技术的推广将具有显著的经济效益和社会效益。

附图说明

图1为人工免疫抗原Cr³⁺-ITCBE-BSA合成的技术路线图；

图2为抗Cr³⁺单克隆抗体的亲和常数测定图；

图3为检测Cr³⁺酶联免疫试剂盒的标准曲线图。

具体实施方式

以下用实施例具体说明本发明，但是并不表示对本发明的任何限制，如没有特别说明，其中的百分含量均为重量百分含量。

由于铬离子不具有免疫原性而仅具有免疫反应性，要组装铬离子间接竞争酶联免疫测定试剂盒，必须要制备抗铬离子的特异性抗体，而其首要条件先制备人工免疫抗原与包被抗原；制备铬离子的人工免疫抗原后，免疫Balb/c小鼠，制备抗铬离子的高亲和力、高特异性的单克隆抗体，在此基础上组装铬离子酶联免疫试剂盒。

实施例一、铬离子人工免疫抗原的制备与鉴定

（一）Cr³⁺免疫抗原的制备

（1）称取10 mg鳌合剂异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸（ITCBE）溶于1 mL 二甲基亚砜（DMSO）中，形成金属鳌合剂溶液；称取18.1 mgCrCL₃·6H₂O溶于1mL浓度为10 mmol/L、pH值为8.0的HEPES缓冲液中，形成Cr³⁺溶液；将金属鳌合剂溶液和Cr³⁺溶液混合并用NaOH调节pH值至7.0，然后在室温条件下放在摇床上反应12 h，即形成Cr³⁺-ITCBE鳌合物半抗原溶液；

（2）称取20 mg 载体蛋白BSA，溶于1 mL浓度为10 mmol/L、pH值为8.0的HEPES缓冲液中，形成载体蛋白溶液；

（3）取1mLCr³⁺-ITCBE鳌合物半抗原溶液加入到1mL载体蛋白溶液中，并用NaOH调节pH值至9.0，室温摇床反应24h，然后移入透析袋中透析5天，收集透析液，即形成Cr³⁺-ITCBE-BSA免疫抗原，收集分装，－20℃冻存备用；

所使用的鳌合剂为乙二胺四乙酸（EDTA）的衍生物或二乙烯三胺五乙酸（DTPA）的衍生物，包括异硫氰酸苯基-EDTA（ITCBE)、硝基苯基-EDTA、环己基-EDTA、硝基苯基-DTPA、环己基-DTPA、异硫氰酸苯基-DTPA。

（二）Cr³⁺免疫抗原鉴定

（1）载体蛋白浓度测定。采用二喹啉甲酸法测定Cr³⁺-ITCBE-BSA中载体蛋白BSA的浓度，以BSA作为标准蛋白，用二喹啉甲酸法构建浓度检测标准曲线。BSA浓度标准曲线的线性方程为：y=0.00048x＋0.0076，R²＝0.9991，其中y为样品在波长为562n m处吸光度，x为样品蛋白浓度。测定结果：载体蛋白BSA的浓度为6.4 mg/mL。

（2）Cr³⁺离子浓度测定。采用ICP-AES法测定Cr³⁺-ITCBE-BSA中Cr³⁺的浓度。将100 μg/mL的Cr³⁺-ITCBE-BSA中Cr³⁺标准储备液用2%的硝酸稀释成0.1μg/mL、0.3 μg/mL、0.9 μg/mL、2.7 μg/mL、8.1 μg/mL的浓度梯度，仪器软件自动绘制标准曲线，并得出线性回归方程；样品溶液50倍稀释，在267.7 nm波长的最佳优化实验条件下进行测定，仪器软件自动分析结果。测定结果，Cr³⁺离子的质量浓度为3.1 mg/mL。

实施例二、Cr³⁺ 包被抗原的制备与鉴定

按照Cr³⁺免疫抗原制备与鉴定所述的方法，制备和鉴定Cr³⁺包被抗原Cr³⁺-ITCBE-OVA。鉴定结果：载体蛋白OVA的浓度为3.6 mg/mL，Cr³⁺离子的质量浓度为2.8 mg/mL。

实施例三、抗Cr ³⁺ 离子单克隆抗体的制备与鉴定

（一）抗Cr³⁺离子单克隆抗体的制备

（1）免疫动物。用Cr³⁺-ITCBE-BSA免疫Balb/c小鼠5只，免疫剂量为50μg·0.2 mL/只，背部皮下多点注射。首免，用灭菌磷酸盐缓冲液（PBS）稀释Cr³⁺-ITCBE-BSA，与等量弗氏完全佐剂（CFA）混合乳化；加强免疫，用灭菌PBS稀释Cr³⁺-ITCBE-BSA，与等量弗氏不完全佐剂（IFA）混合乳化，首免后3周进行第二次免疫，以后间隔3周免疫一次，共免5次，第三次免疫后10天断尾取血，37 ℃水浴30 min，4 ℃放置过夜，800 r/min 4 ℃离心5 min，取上清后－20℃保存备用。

（2）细胞融合备用小鼠选择。间接ELISA检测抗血清中Cr³⁺与ITCBE螯合物Cr³⁺- ITCBE的多克隆抗体（pAb）效价，阻断ELISA检测Cr³⁺- ITCBE pAb对Cr³⁺- ITCBE的半数抑制浓度（IC ₅₀），挑选效价最高、IC ₅₀最低的小鼠，超免用于细胞融合。

（3）细胞融合和阳性杂交瘤细胞株的筛选。细胞融合，将PEG溶液、GNK溶液预热至40 ℃，将制备好的脾细胞与NS0骨髓瘤细胞按10∶1的比例混合于50 mL离心管中，加GNK溶液至40 mL，1000 r/min离心10 min，弃上清，打散细胞团，将此融合管移入40 ℃水浴中。用1 mL吸管将预热的50% PEG（pH 8.0）滴加到融合管中，边加边轻轻摇动融合管，1 min内加完，并继续在水浴中缓缓摇动融合管1.5 min；然后慢慢补加GNK溶液至40 mL，37℃水浴静置5 min，1000 r/min离心10 min，弃上清；打散细胞团，加40 mL HAT吹打混匀，加到含饲养细胞的96孔细胞培养板上，每孔100 μL，置37 ℃ 5% 的CO₂培养箱中培养。

阳性杂交瘤细胞的筛选，用间接ELISA和阻断ELISA进行阳性杂交瘤细胞株的筛选。选择强阳性、抑制效果好、细胞生长旺盛的孔进行3次有限稀释克隆化，分别于冻存15 d、30 d 和60 d后复苏杂交瘤细胞，培养后取上清液，间接ELISA测定抗体效价，考察杂交瘤细胞分泌的抗Cr³⁺离子单克隆抗体（Cr³⁺- ITCBE mAb）的稳定性。

（4）单克隆抗体的制备。采用体内诱生腹水法制备单克隆抗体，取8周龄健康Balb/c雌性小鼠，腹腔注射FIA 0.5 mL/只，10～15天后使用。将培养的阳性杂交瘤细胞1000 r/min离心10min弃上清，收集细胞沉淀。用灭菌的PBS将细胞沉淀悬浮、混匀，将细胞数调至10⁶ 个/mL，腹腔注射Balb/C小鼠0.5 mL/只。接种细胞7～10天后产生腹水，进行收集，于37 ℃水浴30 min，4 ℃放置过夜，12000 r/min离心5 min，弃去上层的脂肪、IFA和下层的沉淀，饱和硫酸铵盐析法提纯后测定IgG含量和效价，－20 ℃保存备用。

（二）抗Cr³⁺离子单克隆抗体的鉴定

（1）亚型鉴定。取出正在培养的杂交瘤细胞上清，按1∶50稀释后，参照小鼠单克隆抗体亚型鉴定试纸条说明书操作。取稀释液0.15 mL加入试剂盒小管中，室温放置1 min。待其自然溶解后，轻轻混匀；然后将试纸条插到小管底部，5 min后，当最前端条带在两对“+”中间出现时，即可见与杂交瘤细胞株所分泌的抗体亚类和轻链类型对应所在的位置，从而确定抗体亚型。鉴定结果，单克隆抗体亚型为IgG₁/λ。

（2）效价测定。间接ELISA测定其效价。测定结果，Cr³⁺-EDTA mAb的腹水效价为1∶6.4×10⁵。

（3）亲和力鉴定。饱和ELISA测定亲和常数（Ka），用浓度分别为3.4 μg/mL和1.7 μg/mL的Cr³⁺-ITCBE-BSA包被酶标板，加入倍比稀释的Cr³⁺-EDTA mAb，再加入酶标二抗GaMIgG-HRP，TMB显色测A _450nm值，以Cr³⁺-EDTA mAb浓度为横坐标，以A _450nm值为纵坐标，绘出相应的2条反应曲线，以每条曲线上部平坦段的A _450nm值作为100%，在曲线上算出50% A _450nm值时对应的Cr³⁺-EDTA mAb浓度，按照公式Kaff＝（n－1）/2（n[Ab']t－[Ab]t）计算Ka。鉴定结果，Cr³⁺-EDTA mAb的Ka为1.76×10⁹ L/moL，为高亲和力抗体。

（4）敏感性鉴定。用阻断ELISA测定Cr³⁺-EDTA mAb对不同浓度Cr³⁺-EDTA的抑制率，以抑制率B/B₀为纵坐标，以不同浓度Cr³⁺-EDTA的对数值为横坐标，绘制标准抑制曲线，进行相关回归分析，计算Cr³⁺-EDTA mAb对Cr³⁺-EDTA的IC ₅₀。鉴定结果，IC ₅₀为9.84 ng/mL。

（5）特异性鉴定。采用交叉反应试验鉴定其特异性。鉴定结果，与其它重金属离子交叉反应小于0.05%。

实施例四、铬离子酶联免疫试剂盒的制备

（1）酶标二抗和抗Cr³⁺单克隆抗体工作浓度的确定。采用方阵法筛选确定酶标二抗（GaMIgG-HRP或RaMIgG-HRP）和单克隆抗体工作浓度，浓度分别为1∶1000和1∶10000。

（2）试剂盒的配置。

包括C1号液（最佳工作浓度的抗Cr³⁺单克隆抗体工作浓度），C2号液（最佳工作浓度的酶标二抗RaMIgG-HRP），C3号液（底物显色剂A为过氧化脲），C4号液（底物显色剂B为四甲基联苯胺），Cr³⁺-ITCBE-OVA包被并封闭好的8×12（96孔）酶标板，C5号液（终止液），Cr³⁺标准品稀释液1～9（浓度分别为0 ng/mL、1 ng/mL、2.5 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、40 ng/mL、80 ng/mL、160ng/mL），洗液（PBST）。

（3）试剂盒标准曲线绘制。阻断ELISA测定单克隆抗体对不同浓度Cr³⁺标准品的抑制率，以抑制率B/B₀%（B是Cr³⁺不同标准浓度的A ₄₅₀值，B₀是Cr³⁺ 0标准浓度的A ₄₅₀值）为纵坐标，以不同标准品浓度的对数值为横坐标，在半对数坐标纸上绘制标准曲线，推导回归方程，进行回归分析。标准曲线见附图3。其线性回归方程为y＝－36.582x＋86.326，检测灵敏度为2 ng/mL，IC ₅₀为9.84ng/mL，检测范围为2.0～128.0 ng/mL。

实施例五、铬离子酶联免疫试剂盒的配置

在制备免疫抗原、包被抗原、特异性单克隆抗体以及商品化酶标二抗的基础上，组装检测铬离子的间接竞争酶联免疫试剂盒，其优化标准配置包括：

（1）Cr³⁺-ITCBE-OVA包被并封闭的8×12（96孔）酶标板；

（2）C1号液：工作浓度为1∶10000的抗三价铬离子的单克隆抗体；

（3）C2号液：工作浓度为1∶1000的羊抗鼠酶标二抗GaMIgG-HRP或兔抗鼠酶标二抗RaMIgG-HRP，其中酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶；

（4）C3号液：显色剂A，为过氧化氢，C4号液：显色剂B，为四甲基联苯胺，显色剂A与显色剂B进行等比量混匀；

（5）C5号液：终止液，为2 moL/L的硫酸溶液；

（6）Cr³⁺离子标准溶液：将铬离子溶于0.01 mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液中，得到浓度分别为0 ng/mL、1 ng/mL、2.5 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、40 ng/mL、80 ng/mL、160 ng/mL的系列标准溶液，

（7）洗液浓缩液：为0.1 mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液含0.05%Tween-20（PBST）；

（8）样品处理液：样品处理液A为 1mol/L、pH 9.5的Na₂SO₃溶液，B为0.1 mol/L的 EDTA溶液，使用时先使用A液，再使用B液。

实施例六、铬离子试剂盒的检测步骤

（1）样品前处理：样品中铬离子的存在形式有Cr³⁺和Cr⁶⁺两种，只有Cr³⁺-EDTA能够被免疫试纸检测到，因此，样品前处理由两步完成。第一步是加入过量化学还原剂如SO₂、NaHSO₃、Na₂SO₃中的一种，将酸酐形式的Cr⁶⁺完全还原为游离的Cr³⁺；第二步是用过量的0.1moL/L EDTA溶液处理样品，使Cr³⁺完全形成Cr³⁺-EDTA，离心取上清液用于检测。

（2）检测步骤：第一步，每孔加入50 μL工作浓度的Cr³⁺单克隆抗体，同时等体积加入Cr³⁺标准液或样品溶液，设阴性和空白对照，37 ℃温育15 min，PBST洗板；第二步，每孔加入50 μL工作浓度的RaMIgG-HRP，37 ℃温育25 min，PBST洗板；第三步，每孔加入100 μL的酶底物A、B混合液显色，室温反应5 min，每孔加入100 μL终止液，用酶标仪读A₄₅₀值，记录结果。

实施例七、铬离子酶联免疫试剂盒的性能测定

（1）灵敏性。按照阻断ELISA最低检测限为B₀/B＝1.2的方法，根据曲线回归方程计算出试剂盒的灵敏度，确定检测限。测定结果，检测限为2 ng/mL。

（2）准确性。将Cr³⁺标准品添加到饲料样、猪尿样中，使终浓度分别为2ng/mL、8 ng/mL、32 ng/mL，每个浓度设6个重复，以回收率和变异系数确定其准确度。结果见表1，饲料样、猪尿样的平均批内变异系数CV分别为11.5%、10.4%，平均批间CV分别为6.2%、6.0%，平均批间CV均小于平均批内CV，且不超过15%，表明试剂盒具有较高的准确性。

表1  铬离子酶联免疫试剂盒添加回收试验（n＝6）

（3）特异性。采用交叉反应试验，选择汞、铅、镉、铜、锌、钴、铁等金属离子与EDTA的螯合物、EDTA为抑制物，用阻断ELISA测定各抑制物的IC ₅₀，以抗Cr³⁺单克隆抗体Cr³⁺的IC ₅₀和对其它各竞争物的IC ₅₀的百分率为其交叉反应率（CR％)。结果见表2，试剂盒对Cr³⁺-EDTA的IC ₅₀为9.84ng/mL，对与EDTA及其它金属离子的IC ₅₀均大于10³，说明试剂盒具有较高的特异性。

表2  Cr³⁺-EDTA mAb与其它金属螯合物的交叉反应试验

 

化合物	IC 50（ng/mL）	交叉反应率（％）
			Cr3+-EDTA	9.84ng/mL	100
EDTA	＞6.4×103	＜0.05
			Hg2+-EDTA	＞3.2×103	＜0.05
Pb2+-EDTA	＞6.4×103	＜0.05
			Cd2+-EDTA	＞6.4×103	＜0.05
Cu2+-EDTA	＞3.2×103	＜0.05
			Zn2+-EDTA	＞3.2×103	＜0.05
Co2+-EDTA	＞6.4×103	＜0.05
			Fe2+-EDTA	＞6.4×103	＜0.05

（4）稳定性。取同一批次的试剂盒，保存于4 ℃，测定保存6个月中各月份的A ₄₅₀值、IC ₅₀、R²变化情况，确定其稳定性。结果见表3，随着试剂盒保存期延长，各Cr³⁺标准液的A ₄₅₀值有所减小，但其IC ₅₀、R²变化不大，曲线拟合良好，说明试剂盒在4℃下6个月保存期内质量稳定。

表3  试剂盒的保存期试验

保存时间（d）	IC 50（ng/mL）	R2	最大吸光值Amax.
				1	9.84	0.9842	0.975
30	10.23	0.9838	0.956
				60	11.45	0.9802	0.921
90	11.86	0.9778	0.874
				120	12.18	0.9744	0.825
150	12.46	0.9712	0.783
				180	12.98	0.9703	0.736

Claims (6)

1.一种用于检测铬离子的间接竞争酶联免疫试剂盒，包括盒体，其特征是：盒体内设有用三价铬离子包被抗原包被过的酶标板、抗三价铬离子的单克隆抗体、酶标二抗、底物显色液、终止液、三价铬离子标准溶液、洗液浓缩液、样品处理液；

所述的三价铬离子包被抗原是由以下方法制备的：

 （1）称取10 mg异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸鳌合剂ITCBE溶于 1mL二甲基亚砜DMSO形成金属鳌合剂溶液；称取18.1 mg CrCL₃·6H₂O溶于1 mL浓度为10 mmol/L、pH值为8.0的HEPES缓冲液中，形成Cr³⁺溶液；将金属鳌合剂溶液和Cr³⁺溶液混合，并用NaOH调节pH值至7.0，然后在室温下放在摇床上反应12 h，即形成Cr³⁺-ITCBE鳌合物半抗原溶液；

（2）称取20 mg 卵清蛋白OVA溶于1 mL浓度为0.1 mol/L、pH值为8.0的HEPES缓冲液中，形成载体蛋白溶液；

（3）取1 mL Cr³⁺-ITCBE鳌合物半抗原溶液加入到1 mL载体蛋白溶液中，并用NaOH调节pH值至9.0，室温摇床反应24 h，然后移入透析袋中透析5天，收集透析液，即形成包被抗原Cr³⁺-ITCBE-OVA，收集分装，－20℃冻存备用；

所述酶标板按如下方法包被：包被抗原为Cr³⁺-ITCBE-OVA，包被浓度为2 μg/mL，包被溶液为0.05 moL/L pH 9.6的碳酸盐缓冲液，包被剂量为100 μL/孔，37 ℃温育2 h或室温8 h，用洗液浓缩液PBST洗涤3次，用5%的猪血清封闭，每孔250 μL，37 ℃温育1 h，再用PBST洗涤3次；所述洗液浓缩液PBST为0.01 mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液，其中含0.05%的Tween-20。

2.根据权利要求1所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述的抗三价铬离子单克隆抗体是按以下方法制备的：

制备免疫抗原：称取10 mg异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸鳌合剂ITCBE溶于1mL二甲基亚砜DMSO形成金属鳌合剂溶液；称取18.1 mg CrCL₃·6H₂O溶于1mL浓度为10 mmol/L、pH值为8.0的HEPES缓冲液中，形成Cr³⁺溶液；将金属鳌合剂溶液和Cr³⁺溶液混合，并用NaOH调节pH值至7.0，然后在室温下放在摇床上反应12 h，形成Cr³⁺-ITCBE鳌合物半抗原溶液；称取20 mg牛血清白蛋白BSA溶于1 mL浓度为0.1 mol/L、pH值为8.0的HEPES缓冲液中，形成载体蛋白溶液；取1 mL Cr³⁺-ITCBE鳌合物半抗原溶液加入到1 mL载体蛋白溶液中，并用NaOH调节pH值至9.0，室温摇床反应24 h，然后移入透析袋中透析5天，收集透析液，即形成免疫抗原Cr³⁺-ITCBE-BSA，收集分装，－20℃冻存备用；

免疫动物：以Cr³⁺-ITCBE-BSA为免疫抗原，以Balb/c小鼠作为免疫动物，背部皮下多点注射，免疫剂量为每只每次50～100 μg，首免用弗氏完全佐剂，加强免疫用弗氏不完全佐剂，首免后3周进行第二次免疫，以后间隔2周免疫，共免疫5次；

选择细胞融合备用小鼠：间接ELISA法检测抗血清中Cr³⁺螯合物多克隆抗体的效价，阻断ELISA法检测Cr³⁺-ITCBE多克隆抗体对Cr³⁺-ITCBE的半数抑制浓度IC ₅₀，挑选效价最高、IC ₅₀最低的小鼠，超免用于细胞融合；

制备阳性杂交瘤细胞：取NS0骨髓瘤细胞与免疫小鼠脾细胞用PEG进行细胞融合，经过四次有限稀释法亚克隆，获得稳定分泌抗三价铬离子单克隆抗体的细胞株；

制备单克隆抗体：对经产母鼠腹腔注射杂交瘤细胞株，采集腹水纯化，获得抗三价铬离子的单克隆抗体。

3.根据权利要求1所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述的酶标二抗为羊抗鼠酶标二抗GaMIgG-HRP或兔抗鼠酶标二抗RaMIgG-HRP；所述的底物显色液由显色剂A和显色剂B组成，显色剂A为过氧化氢或过氧化脲，显色剂B为邻苯二胺或四甲基联苯胺；所述的终止液为2 mol/L硫酸溶液；所述的三价铬离子标准溶液为三价铬离子溶解于0.01 mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液得到的系列浓度的溶液；所述的洗液浓缩液为0.1 mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液，其中含0.05%的Tween-20；所述的样品处理液包括A液和B液，A液为1mol/L、pH 9.5的Na₂SO₃溶液，B液为0.1 mol/L的 EDTA溶液；用于制备所述酶标板的固相材料为聚苯乙烯、聚乙烯或聚丙烯。

4.一种如权利要求1-2任一项所述的间接竞争酶联免疫试剂盒的组建方法，其特征在于：所述试剂盒包括Cr³⁺-ITCBE-OVA包被并封闭的酶标板；C1号液：工作浓度为1∶10000的抗三价铬离子的单克隆抗体；C2号液：工作浓度为1∶1000的羊抗鼠酶标二抗GaMIgG-HRP或兔抗鼠酶标二抗RaMIgG-HRP， C3号液：显色剂A，为过氧化氢或过氧化脲、C4号液：显色剂B，为四甲基联苯胺或邻苯二胺，C5号液：终止液，为2moL/L的硫酸溶液；铬离子标准溶液为三价铬离子溶解于0.01 mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液得到的系列浓度的溶液；洗液浓缩液PBST为0.1mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液，其中含0.05%的Tween-20；样品处理液A液、B液：A液为1 mol/L、pH 9.5的Na₂SO₃溶液，B液为0.1 mol/L的 EDTA溶液。

5.根据权利要求4所述的间接竞争酶联免疫试剂盒的组建方法，其特征在于：所述试剂盒检测Cr³⁺的灵敏度为2 ng/mL，半数抑制浓度IC ₅₀为9.84 ng/mL，检测范围为2.0～128.0 ng/mL。

6.一种如权利要求1-3任一项所述的间接竞争酶联免疫试剂盒的检测方法，其特征在于：检测操作包括以下步骤：

（1）样品前处理：向预处理的样品中先加入过量样品处理液A，将样品中酸酐形式的Cr⁶⁺完全还原为游离的Cr³⁺；之后用过量样品处理液B处理样品，使Cr³⁺完全形成Cr³⁺-EDTA，离心取上清液用于检测；其中样品处理液A为1mol/L、pH 9.5的Na₂SO₃溶液；样品处理液B为0.1 mol/L的 EDTA溶液；

（2）检测步骤：第一步，每孔加入50 μL工作浓度的抗铬离子单克隆抗体，同时等体积加入铬离子的标准溶液或样品溶液，设阴性和空白对照，37℃温育15 min，用PBST缓冲液洗板；第二步，每孔加入50 μL工作浓度的酶标二抗，37℃温育25 min，用PBST缓冲液洗涤酶标板；第三步，每孔加入100 μL的底物显色液A、B的混合液显色，室温反应5 min，每孔加入100 μL终止液，用酶标仪读A ₄₅₀值，记录结果。