CN106282126B

CN106282126B - 一株抗重金属镉的单克隆抗体杂交瘤细胞株yh2及其应用

Info

Publication number: CN106282126B
Application number: CN201610895579.1A
Authority: CN
Inventors: 匡华; 邹淑珍; 胥传来; 徐丽广; 马伟; 刘丽强; 吴晓玲; 宋珊珊; 胡拥明
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2016-10-14
Filing date: 2016-10-14
Publication date: 2019-07-16
Anticipated expiration: 2036-10-14
Also published as: CN106282126A

Abstract

一株抗重金属镉的单克隆抗体杂交瘤细胞株YH2及其应用，属于食品安全检测技术领域。本发明抗重金属镉单克隆抗体杂交瘤细胞株YH2，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号为CGMCC No.12027。此细胞株YH2分泌的单克隆抗体可识别二价镉离子，特异性好和灵敏度高，可以用于食品安全中镉的残留检测。本发明制备的抗二价镉离子单克隆抗体细胞株YH2，对Cd²⁺‑ITCBE有较好的检测灵敏度和特异性（IC₅₀值为0.1 ng/mL）。该细胞株分泌的抗体稳定性好：杂交瘤细胞冻存于液氮中至少保存5年，纯化的抗体在‑20℃冰箱中至少可存放2年；抗体特异性高，与其他金属离子暂未发现交叉反应。

Description

一株抗重金属镉的单克隆抗体杂交瘤细胞株YH2及其应用

技术领域

本发明涉及一株抗重金属镉的单克隆抗体杂交瘤细胞株YH2及其应用，属于食品安全检测技术领域。

背景技术

镉(cadmium，Cd)是五种剧毒重金属之一，通过食物链富集作用进入人体，危害人类健康。超量的镉进入人体后，会造成肾功能损害、消化道疾病及肺炎等，镉还被认为是一种强致癌物。因此，我国《生活饮用水卫生标准》规定饮用水镉含量不得超过5ng/mL。GB2762-2012《食品中污染物限量》中规定粮食食品镉含量不超过200ng/mL，果蔬类不超过50ng/mL。

据统计，我国土壤的镉污染非常严重，大米等粮食作物镉含量超标情况严重，对人民健康、国家经济造成很大损害。随着镉超标事件的屡有发生，重金属镉的检测受到广泛关注。

目前常用的镉检测方法有电感耦合等离子体质谱法、电化学分析法、石墨炉原子吸收光谱法等仪器检测方法，检测耗时长、费用高，难以用于现场检测。因此建立一种快速简便的镉化合物检测方法具有重要意义。酶联免疫法（ELISA）是一种极为高效、敏感、快速的检测方法，检测时对样本的纯度要求不高而且操作简便，适用于大量样本的现场快速检测。然而得到高检测灵敏度和高特异性的单克隆单体是免疫学检测的前提。

发明内容

本发明的目的是提供一种对镉离子具有较好特异性和检测灵敏度的单克隆抗体杂交瘤细胞株YH2。

本发明的技术方案，一株抗重金属镉单克隆抗体杂交瘤细胞株YH2，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号为CGMCC No.12027。

重金属镉单克隆抗体，它由所述保藏编号为CGMCC No.12027的重金属镉单克隆抗体杂交瘤细胞株YH2分泌产生。

所述重金属镉单克隆抗体的应用，其可用于食品安全中重金属镉的残留检测。

本发明提供的细胞株YH2的制备基本步骤为：

1）完全抗原的合成：取1-(4-异硫氰苄基)乙烯基二胺-N,N,N',N'-四乙酸10mg溶于1mL二甲基亚砜中形成A液；10mg牛血清蛋白溶于1mL pH9.0的10mM HBS中形成B液；取100μL A液逐滴加入B液中，调节pH9.0，搅拌24h；用超滤管离心，得到1-(4-异硫氰苄基)乙烯基二胺-N,N,N',N'-四乙酸-牛血清蛋白；取150μL 1mg/mL硝酸镉标准溶液逐滴加入到1-(4-异硫氰苄基)乙烯基二胺-N,N,N',N'-四乙酸-牛血清蛋白中，调节pH8搅拌5h；用超滤管离心，得到检测抗原（包被原）镉-1-(4-异硫氰苄基)乙烯基二胺-N,N,N',N'-四乙酸-牛血清蛋白。用双功能螯合剂1-(4-异硫氰苄基)乙烯基二胺-N,N,N',N'-四乙酸将镉离子偶联到匙孔血蓝蛋白上，制成免疫抗原。

2）小鼠的免疫：二价镉离子免疫抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后，通过背部皮下注射免疫BALB/c小鼠。第一次免疫用完全弗氏佐剂，之后都用不完全弗氏佐剂。首免与加强免疫之间间隔一个月，三次加强免疫之间隔21天。最后一次用完全免疫原（不含佐剂）冲击免疫；通过间接ELISA检测血清效价和抑制；

3）细胞融合与细胞株建立：通过聚乙二醇（PEG4000）法将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合，通过HAT培养基培养，利用间接ELISA检测阳性细胞孔，并进一步利用间接竞争ELISA法测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制的阳性细胞孔进行三次亚克隆，最终筛选获得杂交瘤细胞株YH2；

4）杂交瘤细胞株性质的鉴定：通过ELISA法测定灵敏度和特异性。

本发明的有益效果：本发明获得的抗二价镉离子单克隆抗体细胞株YH2，对Cd²⁺-ITCBE有较好的检测灵敏度和特异性（IC₅₀值为0.1 ng/mL）。该细胞株分泌的抗体稳定性好：杂交瘤细胞冻存于液氮中至少保存5年，纯化的抗体在-20℃冰箱中至少可存放2年；抗体特异性高，与其他金属离子暂未发现交叉反应。

生物材料样品保藏：单克隆细胞株YH2，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.12027，保藏日期2016年1月20日，分类命名为单克隆抗体。

附图说明

图1.YH2分泌的单克隆抗体的抑制标准曲线。

具体实施方式

本发明下面的实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不能作为本发明的限定内容或范围。下面通过实施例对本发明作进一步说明。

本发明通过用二价镉离子免疫原免疫小鼠，通过细胞融合，HAT选择性培养基培养，通过间接ELISA和间接竞争ELISA筛选细胞上清，最终得到了对Cd²⁺-ITCBE有较好特异性和灵敏度的单克隆抗体杂交瘤细胞株YH2。

实施例 1：杂交瘤细胞株YH2的制备

（1）完全抗原的合成：取1-(4-异硫氰苄基)乙烯基二胺-N,N,N',N'-四乙酸（ITCBE）10mg溶于1mL二甲基亚砜中形成A液；10mg牛血清蛋白溶于1mL pH9.0的10mM HBS中形成B液；取100μL A液逐滴加入B液中，调节pH9.0，搅拌24h；用超滤管离心，得到1-(4-异硫氰苄基)乙烯基二胺-N,N,N',N'-四乙酸-牛血清蛋白；取150μL 1mg/mL硝酸镉标准溶液逐滴加入到1-(4-异硫氰苄基)乙烯基二胺-N,N,N',N'-四乙酸-牛血清蛋白中，调节pH8搅拌5h；用超滤管离心，得到检测抗原镉-1-(4-异硫氰苄基)乙烯基二胺-N,N,N',N'-四乙酸-牛血清蛋白。用双功能螯合剂1-(4-异硫氰苄基)乙烯基二胺-N,N,N',N'-四乙酸将镉离子偶联到匙孔血蓝蛋白上，制成免疫抗原。

（2）动物免疫：选择健康的6～8周龄的BALB/c小鼠进行免疫。取二价镉离子免疫原与等量弗氏佐剂混合乳化后，通过背部皮下注射免疫BALB/c小鼠。第一次免疫用完全弗氏佐剂，之后都用不完全弗氏佐剂。首免与加强免疫之间隔一个月，三次加强免疫之间隔21天。三免后7天采血，使用间接竞争ELISA方法测定小鼠血清效价和抑制，选择效价高抑制好的小鼠，在四免后18天冲击免疫，不使用佐剂，腹腔注射。

（3）细胞融合：在冲击免疫三天后，按照常规PEG（聚乙二醇，分子量为4000）方法进行细胞融合，具体步骤如下：

a、无菌取小鼠脾脏，研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，并进行细胞计数；

b、收集SP2/0细胞，悬浮于RPMI-1640基础培养液中，进行细胞计数；

c、将脾细胞和SP2/0细胞按照计数比1︰10 的比例混合，离心后用50% PEG融合，时间1 min，之后按照从慢到快，加入RPMI-1640基础培养液，离心后悬浮于含20% 胎牛血清、2%的50×HAT的RPMI-1640筛选培养液中，加到96孔细胞培养板，置于37℃、5%CO₂的培养箱中培养。

（4）细胞筛选与细胞株建立：在细胞融合的第3天对融合细胞进行RPMI-1640筛选培养液半换液，第5天进行用含20% 胎牛血清、1%的100×HT的RPMI-1640过渡培养液进行全换液，在第7天取细胞上清进行筛选。

筛选分两步：第一步先用间接ELISA筛选出阳性细胞孔，第二步选用Cd²⁺-ITCBE为标准品，用间接竞争ELISA对阳性细胞进行抑制效果测定。选择对Cd²⁺-ITCBE标准品均有较好抑制的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，用同样的方法进行检测。重复三次，获得细胞株YH2。

（5）单克隆抗体的制备与鉴定：取8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射石蜡油1mL；7天后每只小鼠腹腔注射1×10⁶杂交瘤细胞YH2，从第七天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-硫酸铵法纯化，获得的单抗置于-20℃保存。

使用间接竞争ELISA，测定单克隆抗体对Cd²⁺-ITCBE的IC₅₀为0.1 ng/mL，说明对Cd² ⁺-ITCBE有很好的灵敏度，可用于二价镉离子免疫分析检测。

（6）抗体应用：将杂交瘤细胞株YH2通过体内腹水制备的单克隆抗体应用于水中二价镉离子的间接竞争酶联免疫检测，具体步骤如下：

6.1包被：将包被原（Cd²⁺-ITCBE-BSA）用0.05M pH9.6 碳酸盐缓冲液稀释为1.0μg/mL，100μL/孔加入酶标板，37℃反应2h；

6.2洗涤：将板内溶液倾去，甩干，并用洗涤液洗涤3次，每次3min；

6.3封闭：拍干后，加入200μL /孔封闭液，37℃反应2h。洗涤后烘干备用；

6.4加样：加入Cd²⁺-ITCBE和抗体：用含0.1 mM ITCBE的10μM HBS缓冲液倍比逐级稀释Cd²⁺，每孔加入50μL，再加入稀释一定倍数的抗体溶液50μL，37℃反应0.5h；充分洗涤后，加入1:3000稀释的HRP-羊抗鼠IgG，100μL /孔，37℃反应0.5h；

6.5显色：将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100μL的TMB显色液，37℃避光反应15min；

6.6终止和测定：每孔加入50μL终止液以终止反应，然后用酶标仪测定各孔的OD₄₅₀值；

6.7结果判读：以OD₄₅₀值大于或等于阴性对照孔的2.1倍（即P/N≥2.1）所对应的血清最高稀释倍数即为血清的ELISA效价，计算抑制率。抗体IC₅₀=0.1ng/mL。结果表明，制备的抗体能较好的识别Cd²⁺-ITCBE。

表1.YH2分泌的单克隆抗体的交叉反应率

（7）溶液的配置：

碳酸盐缓冲液（CBS）：称取Na₂CO₃1.59g，NaHCO₃ 2.93g，分别溶于少量双蒸水后混合，加双蒸水至约800mL混匀，调pH值至9.6，加双蒸水定容至1000mL，4℃贮存备用；

磷酸盐缓冲液（PBS）：8.00g NaCl，0.2g KCl，0.2g KH₂PO₄，2.9 g Na₂HPO₄·12H₂O，溶于800mL纯水中，用NaOH或HCl调pH到7.2～7.4，定容至1000mL；

PBST：含0.05% 吐温 20的PBS；

HBS缓冲液：8.00g NaCl，0.2g KCl，HEPES（4-羟乙基哌嗪乙磺酸）2.386g，溶于800mL纯水中，用NaOH或HCl调pH到7.2～7.4，定容至1000mL；

TMB显色液：A液：Na₂HPO₄·12H₂O 18.43g，柠檬酸9.33g，纯水定容至1000mL；B液：60mg TMB 溶于100mL乙二醇中。A、B液按体积比1︰5混合即为TMB显色液，现用现混。

综上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用来限定本发明的实施范围。即凡依本发明申请专利范围的内容所作的等效变化与修饰，都应为本发明的技术。

Claims

1.一株抗重金属镉的单克隆抗体杂交瘤细胞株YH2，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号为CGMCC No.12027。

2.重金属镉单克隆抗体，其特征在于：它由所述保藏编号为CGMCC No.12027的重金属镉单克隆抗体杂交瘤细胞株YH2分泌产生。

3.权利要求2所述重金属镉单克隆抗体的应用，其特征在于：用于食品安全中镉的残留检测。