CN104155424A - 一种水样中镉离子污染阻断elisa检测法 - Google Patents

Abstract

本发明属于免疫学检测技术领域，主要涉及水样中重金属镉离子污染的免疫学定量检测，具体涉及一种水样中镉离子污染阻断ELISA检测法，将水样中的Cd²⁺与过量EDTA鳌合形成Cd²⁺-EDTA鳌合物；水样中的Cd²⁺-EDTA鳌合物与已经包被在酶标板上的Cd²⁺-ITCBE-OVA竞争Cd²⁺-EDTA单克隆抗体的抗原结合位点，添加HRP标记的羊抗鼠IgG和底物显色液，终止显色后，酶标仪读取A_450nm值，与标准曲线对照，即可得出水样中Cd²⁺浓度，待检水样处理方法简单，检测过程不需大型仪器设备，操作简便、快速、样品检测量大、时效性强、检测成本低、便于推广；检测结果准确性高、重复性好，检测范围为5.0～512μg/L。

Description

一种水样中镉离子污染阻断ELISA检测法

技术领域

本发明属于免疫学检测技术领域，主要涉及水样中重金属镉离子污染的免疫学定量检测，具体涉及一种水样中镉离子污染阻断ELISA检测法。

背景技术

随着工业的发展，重金属镉(cadmium, Cd)已成为环境污染的公害之一。环境中Cd主要以离子形式（Cd²⁺）存在，对人体具有肾脏、骨骼、肺脏、心血管等毒性作用和致癌、致畸、致突变等危害作用。因此，Cd²⁺污染的检测技术成为国内外学者的研究热点之一。

目前Cd²⁺污染的检测主要有传统的理化检测和免疫学检测两种类型的方法。理化检测是目前Cd²⁺污染检测的主要方法，灵敏度高，结果准确，但由于存在需要昂贵的仪器设备、熟练的专业人员、烦琐费时、周期长、费用高、不能现场操作、样品筛检量小等缺陷，其应用受到了限制。Cd²⁺污染免疫检测是一种新型的分析方法，是以抗原抗体的特异性反应为基础的分析技术，与理化分析方法相比，具有省时省力、费用低廉、快速、敏感、特异、筛检量大、便于携带、操作简便等优点，代表着今后重金属污染检测的发展趋势。

本发明通过研制出水样中Cd²⁺污染快速定量检测产品，旨在建立方便、快捷、有效的环境水样Cd²⁺污染监督检测技术体系，对保障生态环境及公共卫生安全具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足而提供一种水样中镉离子污染阻断ELISA检测法，该方法检测结果准确性高、重复性好，检测成本低。

本发明的目的是这样实现的：

水样中Cd²⁺污染阻断ELISA快速定量检测法的原理是：将水样中的Cd²⁺与过量EDTA鳌合形成Cd²⁺-EDTA鳌合物；水样中的Cd²⁺-EDTA鳌合物与已经包被在酶标板上的Cd²⁺-ITCBE-OVA竞争Cd²⁺-EDTA单克隆抗体的抗原结合位点，添加HRP标记的羊抗鼠IgG和底物显色液，终止显色后，酶标仪读取A _450nm值，与标准曲线对照，即可得出水样中Cd²⁺浓度。

本发明选用异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸(ITCBE）为双功能鳌合剂鳌合Cd²⁺形成Cd²⁺鳌合物半抗原，并将其耦连到牛血清蛋白(BSA)和鸡卵清蛋白(OVA)上形成Cd²⁺-ITCBE-BSA和Cd²⁺-ITCBE-OVA两种完全抗原，用Cd²⁺-ITCBE-BSA为免疫原免疫Balb/C小鼠，用Cd²⁺-ITCBE-OVA为检测抗原，通过细胞融合技术，以间接ELISA和阻断ELISA筛选建立抗Cd²⁺-EDTA的杂交瘤细胞系，体内诱生腹水法制备Cd²⁺-EDTA单抗，以制备的高亲和力配对单抗为核心试剂，研制出环境水样中Cd²⁺污染阻断ELISA快速定量检测方法。本发明的标准曲线回归方程为y＝－31.796x＋89.63，R²＝0.9902，IC₅₀为17.78μg/L，检测范围为5.0～512μg/L。

一种水样中镉离子污染阻断ELISA检测法，具体方法如下：

1）取10mL水样加入30mg EDTA钠盐，充分溶解，NaOH调节pH值为6.0，室温反应24小时；

2）在酶标板上加入浓度为1.0μg/mL的Cd²⁺-ITCBE-OVA，每孔50μL，37℃温育2小时，PBST洗板3次，每次间隔3分钟；

3）用5%猪血清封闭酶标孔，每孔250μL，37℃温育1小时，PBST洗板3次，每次间隔3分钟；

4）每孔加入50μL工作浓度的Cd²⁺-EDTA单抗，同时加入等体积的待测样品及不同浓度的Cd²⁺标准品与EDTA的鳌合物，设阴性和空白对照，37℃温育15分钟，PBST洗板3次，每次间隔3分钟；

5）加入工作浓度的HRP标记的羊抗鼠IgG，每孔50μL，37℃温育25分钟，PBST洗板3次，每次间隔3分钟；

6）加入TMB底物液，每孔100μL，室温显色5分钟；

7）加入终止液，每孔100μL，酶标仪读取A _450nm值；

8）结果判定：以吸光率B/B₀为纵坐标，B是Cd²⁺不同浓度时Cd²⁺-EDTA的A _450nm值，B0是Cd²⁺0浓度时Cd²⁺-EDTA的A _450nm值，以不同标准品浓度的对数值为横坐标，在半对数坐标纸上绘制标准曲线，进行回归分析，根据各样品的B/B₀值在标准曲线上求出其对应的质量浓度。

基于以上所述，所述的Cd²⁺-ITCBE-OVA检测抗原的制备方法如下：将20mg BSA和OVA分别溶于1mL pH8.0的HEPES缓冲液(10mM/L)中形成20mg/mL的载体蛋白溶液； Cd²⁺-ITCBE鳌合物半抗原溶液与载体蛋白溶液按1:1的比例混合并用NaOH调节pH值至9.0，室温摇床反应24小时，然后移入分子量为8000～14000透析袋中透析5天，形成Cd²⁺-ITCBE-OVA检测抗原。

基于以上所述，所述的Cd²⁺-EDTA单克隆抗体的制备方法为：

1）用Cd²⁺-ITCBE-BSA背部、皮下、多点以50μg /只·0.2 mL的剂量免疫Balb/C小鼠5只，共免5次，每次间隔4周，最后1次免疫后10 d断尾采血分离血清；

2）用Cd²⁺-ITCBE-OVA为包被抗原包被酶标板，采用间接ELISA检测免疫小鼠抗血清效价；将乙二胺四乙酸钠盐(EDTA)溶液与不同浓度梯度的Cd²⁺标准溶液混合，调节pH值为6.0，室温摇床反应24小时，制成Cd²⁺-EDTA鳌合物溶液做为抑制剂，采用阻断ELISA试验检测免疫小鼠抗血清的敏感性。选择抗血清效价高、并且抗血清对Cd²⁺-EDTA鳌合物的50%抑制浓度(IC₅₀)低的小鼠用Cd²⁺-ITCBE-BSA进行尾静脉超免；

3）无菌手术摘取超免小鼠的脾脏，制成脾细胞溶液；用分子量为1500的50%的聚乙二醇将脾细胞与与NS0骨髓瘤细胞按10:1的比例进行细胞融合，将融合后的细胞加到含饲养细胞的96孔细胞培养板上，每孔100μL，置37℃ 5% CO₂培养箱中培养；

4）用Cd²⁺-ITCBE-OVA为包被抗原包被酶标板，以Cd²⁺-EDTA鳌合物溶液以及汞、铬、铅、锌、铜、铯、钴、钼、铁与EDTA的鳌合物溶液和EDTA溶液做为抑制剂，采用间接ELISA和阻断ELISA进行阳性杂交瘤细胞株的筛选；选择效价高、抑制效果好、特异性强、细胞生长旺盛的孔采用有限稀释法进行克隆化；对单克隆细胞孔采用间接ELISA和阻断ELISA进行筛选，并对阳性单克隆细胞进行扩大培养；

5）给腹腔注射液体石蜡10 d后的小鼠腹腔注射克隆化特异性强的阳性杂交瘤细胞株10⁷个细胞，7 d后抽取腹水，提纯后即为抗Cd²⁺-EDTA鳌合物腹水型单克隆抗体。

水样中Cd²⁺污染阻断ELISA快速定量检测法的原理是：将水样中的Cd²⁺与过量EDTA鳌合形成Cd²⁺-EDTA鳌合物；水样中的Cd²⁺-EDTA鳌合物与已经包被在酶标板上的Cd²⁺-ITCBE-OVA竞争Cd²⁺-EDTA单克隆抗体的抗原结合位点，添加HRP标记的羊抗鼠IgG和底物显色液，终止显色后，酶标仪读取A _450nm值，与标准曲线对照，即可得出水样中Cd²⁺浓度。

本发明选用异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸(ITCBE）为双功能鳌合剂鳌合Cd²⁺形成Cd²⁺鳌合物半抗原，并将其耦连到牛血清蛋白(BSA)和鸡卵清蛋白(OVA)上形成Cd²⁺-ITCBE-BSA和Cd²⁺-ITCBE-OVA两种完全抗原，用Cd²⁺-ITCBE-BSA为免疫原免疫Balb/C小鼠，用Cd²⁺-ITCBE-OVA为检测抗原，通过细胞融合技术，以间接ELISA和阻断ELISA筛选建立抗Cd²⁺-EDTA的杂交瘤细胞系，体内诱生腹水法制备Cd²⁺-EDTA单抗，以制备的高亲和力配对单抗为核心试剂，研制出环境水样中Cd²⁺污染阻断ELISA快速定量检测方法。本发明的标准曲线回归方程为y＝－31.796x＋89.63，R²＝0.9902，IC₅₀为17.78μg/L，检测范围为5.0～512μg/L。

待检水样处理方法简单，检测过程不需大型仪器设备，操作简便、快速、样品检测量大、时效性强、检测成本低、便于推广；检测结果准确性高、重复性好，检测范围为5.0～512μg/L。

附图说明

图1为Cd²⁺污染阻断ELISA法的标准曲线。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明作进一步的描述。

一种水样中镉离子污染阻断ELISA检测法，可以先进行Cd²⁺鳌合物完全抗原的制备和抗Cd²⁺-EDTA单克隆抗体的制备，然后在进行具体的实验。

1）Cd²⁺鳌合物完全抗原的制备：

称取10mg ITCBE溶于1mL DMSO中形成金属鳌合剂溶液；称取4.2mg CdCl₂溶于1mL pH8.0的HEPES缓冲液(10mM/L)中形成Cd²⁺溶液；将金属鳌合剂溶液和Cd²⁺溶液混合并用NaOH调节pH值至7.0，然后在室温条件下放在摇床上反应12小时，即形成Cd²⁺-ITCBE鳌合物半抗原。将20mg BSA和OVA分别溶于1mL pH8.0的HEPES缓冲液(10mM/L)中形成20mg/mL的载体蛋白溶液； Cd²⁺-ITCBE鳌合物半抗原溶液与载体蛋白溶液按1:1的比例混合并用NaOH调节pH值至9.0，室温摇床反应24小时，然后移入分子量为8000～14000透析袋中透析5天，即形成Cd²⁺-ITCBE-BSA免疫抗原和Cd²⁺-ITCBE-OVA检测抗原。

2）抗Cd²⁺-EDTA单克隆抗体的制备：

①用Cd²⁺-ITCBE-BSA背部、皮下、多点以50μg /(只·0.2 mL)的剂量免疫Balb/C小鼠5只，共免5次，每次间隔4周，最后1次免疫后10 d断尾采血分离血清。

②用Cd²⁺-ITCBE-OVA为包被抗原包被酶标板，采用间接ELISA检测免疫小鼠抗血清效价；将乙二胺四乙酸钠盐(EDTA)溶液与不同浓度梯度的Cd²⁺标准溶液混合，调节pH值为6.0，室温摇床反应24小时，制成Cd²⁺-EDTA鳌合物溶液做为抑制剂，采用阻断ELISA试验检测免疫小鼠抗血清的敏感性。选择抗血清效价高、并且抗血清对Cd²⁺-EDTA鳌合物的50%抑制浓度(IC₅₀)低的小鼠用Cd²⁺-ITCBE-BSA进行尾静脉超免。

③无菌手术摘取超免小鼠的脾脏，制成脾细胞溶液；用分子量为1500的50%的聚乙二醇(PEG)将脾细胞与与NS0骨髓瘤细胞按10:1的比例进行细胞融合，将融合后的细胞加到含饲养细胞的96孔细胞培养板上，每孔100μL，置37℃ 5% CO₂培养箱中培养。

④用Cd²⁺-ITCBE-OVA为包被抗原包被酶标板，以Cd²⁺-EDTA鳌合物溶液以及汞、铬、铅、锌、铜、铯、钴、钼、铁与EDTA的鳌合物溶液和EDTA溶液做为抑制剂，采用间接ELISA和阻断ELISA进行阳性杂交瘤细胞株的筛选；选择效价高、抑制效果好、特异性强、细胞生长旺盛的孔采用有限稀释法进行克隆化；对单克隆细胞孔采用间接ELISA和阻断ELISA进行筛选，并对阳性单克隆细胞进行扩大培养。

⑤给腹腔注射液体石蜡10 d后的小鼠腹腔注射克隆化特异性强的阳性杂交瘤细胞株10⁷个细胞，7 d后抽取腹水，提纯后即为抗Cd²⁺-EDTA鳌合物腹水型单克隆抗体。

3）水样Cd²⁺污染阻断ELISA检测法的建立

①将Cd²⁺-ITCBE-OVA稀释成0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0μg/mL包被96孔酶标板，将Cd²⁺-EDTA mAb稀释成1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400、1:12800、1:25600的稀释梯度，采用方阵滴定法，间接ELISA检测，确定Cd²⁺-ITCBE-OVA的工作浓度为1.0μg/mL，Cd²⁺-EDTA mAb的工作浓度为1:12800。将商品化生产的HRP标记的羊抗鼠IgG以1:1000的浓度做为工作浓度。

②在0、2、4、8、16、32、64、128、256、512μg/L的Cd²⁺溶液里面加入过量的EDTA，调节pH至6.0，室温摇床反应过夜，形成Cd²⁺-EDTA鳌合物溶液，以此溶液为阻断剂，阻断ELISA测定Cd²⁺-EDTA mAb对不同浓度的Cd²⁺-EDTA标准溶液的抑制效价。以吸光率B/B₀（B是Cd²⁺不同浓度时Cd²⁺-EDTA的A _450nm值，B0是Cd²⁺0浓度时Cd²⁺-EDTA的A _450nm值）为纵坐标，以不同标准品浓度的对数值为横坐标，在半对数坐标纸上绘制标准曲线，进行回归分析。曲线回归方程为y＝－31.796x＋89.63，R²＝0.9902，IC₅₀为17.78μg/L。

③水样处理：每10mL水样加入30mgEDTA钠盐，充分溶解，调节pH值为6.0，室温反应24小时。

④水样中镉离子污染阻断ELISA检测法：

第一步，在酶标板上加入浓度为1.0μg/mL的Cd²⁺-ITCBE-OVA，每孔50μL，37℃温育2小时，PBST洗板3次，每次间隔3分钟；

第二步，用5%猪血清封闭酶标孔，每孔250μL，37℃温育1小时，PBST洗板3次，每次间隔3分钟；

第三步，每孔加入50μL工作浓度的Cd²⁺-EDTA单抗，同时加入等体积的待测样品及不同浓度的Cd²⁺标准品与EDTA的鳌合物，设阴性和空白对照，37℃温育15分钟，PBST洗板3次，每次间隔3分钟；

第四步，加入工作浓度的HRP标记的羊抗鼠IgG，每孔50μL，37℃温育25分钟，PBST洗板3次，每次间隔3分钟；

第五步，加入TMB底物液，每孔100μL，室温显色5分钟；

第六步，加入终止液，每孔100μL，酶标仪读取A _450nm值。

第七步，结果判定，根据各样品的抑制百分率B/B₀值在标准曲线上求出其对应的质量浓度，如图1所示，其中y=-31.796x+89.63，R²=0.9902。

4）检测方法的准确性及重复性验证

将Cd²⁺标准品以终浓度分别为5、10、20、40μg/L添加到自来水、蒸馏水中，用建立的阻断ELISA检测Cd²⁺浓度，每个样品设6个重复孔。检测结果显示，自来水样的回收率在(90.7%±14.1%)-(100.3%±13.2%)之间，平均95.5%，变异系数在10.2%-12.9%之间，平均11.45%；蒸馏水样的回收率在(93.5%±13.2%)-(106.3%±15.3%)之间，平均99.2%，变异系数在10.7%-14.6%之间，平均12.75%。表明该检测方法准确性高，重复性好。

Claims (3)

1.一种水样中镉离子污染阻断ELISA检测法，其特征在于：具体方法如下：

1）取10mL水样加入30mg EDTA钠盐，充分溶解，NaOH调节pH值为6.0，室温反应24小时；

2）在酶标板上加入浓度为1.0μg/mL的Cd²⁺-ITCBE-OVA，每孔50μL，37℃温育2小时，PBST洗板3次，每次间隔3分钟；

3）用5%猪血清封闭酶标孔，每孔250μL，37℃温育1小时，PBST洗板3次，每次间隔3分钟；

4）每孔加入50μL工作浓度的Cd²⁺-EDTA单抗，同时加入等体积的待测样品及不同浓度的Cd²⁺标准品与EDTA的鳌合物，设阴性和空白对照，37℃温育15分钟，PBST洗板3次，每次间隔3分钟；

5）加入工作浓度的HRP标记的羊抗鼠IgG，每孔50μL，37℃温育25分钟，PBST洗板3次，每次间隔3分钟；

6）加入TMB底物液，每孔100μL，室温显色5分钟；

7）加入终止液，每孔100μL，酶标仪读取A _450nm值；

8）结果判定：以吸光率B/B₀为纵坐标，B是Cd²⁺不同浓度时Cd²⁺-EDTA的A _450nm值，B0是Cd²⁺0浓度时Cd²⁺-EDTA的A _450nm值，以不同标准品浓度的对数值为横坐标，在半对数坐标纸上绘制标准曲线，进行回归分析，根据各样品的B/B₀值在标准曲线上求出其对应的质量浓度。

2.根据权利要求1所述的一种水样中镉离子污染阻断ELISA检测法，其特征在于：所述的Cd²⁺-ITCBE-OVA检测抗原的制备方法如下：将20mg BSA和OVA分别溶于1mL pH8.0的HEPES缓冲液(10mM/L)中形成20mg/mL的载体蛋白溶液； Cd²⁺-ITCBE鳌合物半抗原溶液与载体蛋白溶液按1:1的比例混合并用NaOH调节pH值至9.0，室温摇床反应24小时，然后移入分子量为8000～14000透析袋中透析5天，形成Cd²⁺-ITCBE-OVA检测抗原。

3.根据权利要求1所述的一种水样中镉离子污染阻断ELISA检测法，其特征在于：所述的Cd²⁺-EDTA单克隆抗体的制备方法为：

1）用Cd²⁺-ITCBE-BSA背部、皮下、多点以50μg /只·0.2 mL的剂量免疫Balb/C小鼠5只，共免5次，每次间隔4周，最后1次免疫后10 d断尾采血分离血清；

2）用Cd²⁺-ITCBE-OVA为包被抗原包被酶标板，采用间接ELISA检测免疫小鼠抗血清效价；将乙二胺四乙酸钠盐(EDTA)溶液与不同浓度梯度的Cd²⁺标准溶液混合，调节pH值为6.0，室温摇床反应24小时，制成Cd²⁺-EDTA鳌合物溶液做为抑制剂，采用阻断ELISA试验检测免疫小鼠抗血清的敏感性；

选择抗血清效价高、并且抗血清对Cd²⁺-EDTA鳌合物的50%抑制浓度(IC₅₀)低的小鼠用Cd²⁺-ITCBE-BSA进行尾静脉超免；

3）无菌手术摘取超免小鼠的脾脏，制成脾细胞溶液；用分子量为1500的50%的聚乙二醇将脾细胞与与NS0骨髓瘤细胞按10:1的比例进行细胞融合，将融合后的细胞加到含饲养细胞的96孔细胞培养板上，每孔100μL，置37℃ 5% CO₂培养箱中培养；

4）用Cd²⁺-ITCBE-OVA为包被抗原包被酶标板，以Cd²⁺-EDTA鳌合物溶液以及汞、铬、铅、锌、铜、铯、钴、钼、铁与EDTA的鳌合物溶液和EDTA溶液做为抑制剂，采用间接ELISA和阻断ELISA进行阳性杂交瘤细胞株的筛选；选择效价高、抑制效果好、特异性强、细胞生长旺盛的孔采用有限稀释法进行克隆化；对单克隆细胞孔采用间接ELISA和阻断ELISA进行筛选，并对阳性单克隆细胞进行扩大培养；

5）给腹腔注射液体石蜡10 d后的小鼠腹腔注射克隆化特异性强的阳性杂交瘤细胞株10⁷个细胞，7 d后抽取腹水，提纯后即为抗Cd²⁺-EDTA鳌合物腹水型单克隆抗体。