CN104762268B

CN104762268B - 一种高亲和力抗重金属镉单克隆抗体及其应用

Info

Publication number: CN104762268B
Application number: CN201510106078.6A
Authority: CN
Inventors: 向军俭; 刘艳梅; 钟辉; 黄建芳
Original assignee: Jinan University
Current assignee: Jinan University
Priority date: 2015-03-11
Filing date: 2015-03-11
Publication date: 2017-12-29
Anticipated expiration: 2035-03-11
Also published as: CN104762268A

Abstract

本发明公开了一株分泌高亲和力抗重金属镉单克隆抗体的杂交瘤细胞株1H9以及由其分泌的单克隆抗体1H9。所述杂交瘤细胞株1H9于2015年3月4日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC C201521。所述单克隆抗体1H9的腹水Elisa效价达1:1×10⁶，并专可特异性识别重金属镉，以单克隆抗体1H9为基础建立的直接竞争Elisa检测方法（一步竞争法）具有特异、灵敏、准确、迅速快捷、安全简便、试剂稳定和成本低廉等特点，可在30min得出结果，可进行定量检测，敏感性可达2.1ng/mL。尤其适用于样品的快速检测，可广泛用于含重金属镉的环境水样及大米样品的分析测试和实际样品快速筛查。

Description

一种高亲和力抗重金属镉单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域。更具体地，涉及一种高亲和力抗重金属镉单克隆抗体及其应用。

背景技术

在自然界中，镉大多以镉盐的形式存在，可与硫、氯、氧等形成无机化合物。镉氧化态为+1或+2价，在空气中容易被氧化，在加热时会出现棕色氧化物层；在高温条件下镉可与卤素发生剧烈反应，产生卤化镉；镉还可与硫直接反应，生成有毒且具有致癌作用的黄色或橙色的硫化镉。此外，如氧化镉、溴化镉、硒化镉、碘化镉、氯化镉、氰化镉、硝酸镉等多种镉化合物均具有毒性。由于大多数镉化物都能溶于水，可经由饮用水、食物等途径通过呼吸道、消化道、皮肤等途径被机体所吸收与蓄积，对人类健康产生非常严重的危害。

根据不完全统计，我国土壤的重金属污染总体情况非常严重，约有1.5亿亩的耕地和1200万吨的粮食被污染，多达1000万吨的粮食受到污染，至少造成200亿元的经济损失。2008年，从广东、河南、江西等省随机抽取63份农贸市场中销售的大米，有60%以上的大米其镉含量超标。根据统计，广东省韶关市大宝山矿自1969年开矿以来造成了2个镇10个村土地的重金属污染，高达13000多人口受害和10000余亩的稻田遭到污染，由于农作物重金属含量严重超标使当地成为肾结石、肝癌、皮肤病的高发区。重金属的土壤污染具有不可逆、长久且毒害性大等特点，但是我国对于土壤的重金属污染修复才刚起步，据统计，修复率还低于3%，形势相对严峻。而对于镉等重金属污染修复的前提条件是镉等重金属污染的检测。

目前最常用的镉离子检测方法是电感耦联等离子体质谱法，石墨炉原子吸收法（Graphite Furnace AtomicAbsorption Spectrometry，GFAAS）等仪器检测方法，这些检测方法具有准确度高、特异性强和灵敏度高的特点，但实验仪器设备昂贵，同时需要一定的实验场地和专业仪器操作人员才能进行样品检测，不适用于市场产品的现场抽查和产品进出口快速通关的要求。因此，建立一种快速便捷的重金属镉检测方法对控制食品中的镉超标情况非常必要。近年来发展起来的重金属免疫检测法（ELISA）（间接竞争Elisa法），克服了上述方法的缺点，利用抗原抗体的特异性反应实现可作为抗原或抗体的污染物的检测，该方法检测灵敏度高，特异性强，目前已成功应用于重金属镉、汞、铅以及铝的检测。但是，ELISA法也有自身的缺陷，即完成一批试样的检测仍至少需要3h，不能达到快速检测的要求；而且抗原或抗体的选择是非常重要的因素，决定了检测的特异性和灵敏性。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有重金属镉离子检测方法的缺陷和技术不足，提供一种高亲和力的、特异性识别重金属镉的抗重金属镉单克隆抗体。利用该抗重金属镉单克隆抗体可以建立检测重金属镉的一步竞争法（直接竞争Elisa），该检测方法耗时短、灵敏性高，性能可靠，操作简单。

本发明另一目的是提供所述抗重金属镉单克隆抗体的应用。

本发明的再一目的是提供一种用于测定重金属镉的直接竞争Elisa检测方法。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

一株分泌高亲和力抗重金属镉单克隆抗体的杂交瘤细胞株1H9，该杂交瘤细胞株1H9于2015年3月4日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC C201521，保藏地址为中国武汉武汉大学。

一种高亲和力抗重金属镉单克隆抗体1H9，由上述杂交瘤细胞株1H9分泌所得。所述高亲和力是指该单克隆抗体与Cd-EDTA复合物有高亲和力。

所述单克隆抗体1H9的可变区包括重链可变区和轻链可变区；所述重链可变区基因序列如SEQ ID NO.1所示，所述轻链可变区基因序列如SEQ ID NO.2所示；所述重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

所述重链可变区由342个碱基组成，编码114个氨基酸，可变区含有3个CDR（互补决定簇）区。CDR1编码5个氨基酸，CDR2编码17个氨基酸，CDR3编码6个氨基酸（如附图4所示）。可变区的框架区与其他鼠源性抗体的同源性高达90.8%，而3个CDR区则是特异性序列，与其他鼠源性抗体重链可变区CDR区有差异。

所述轻链可变区由336个碱基组成，编码112个氨基酸，可变区含有3个CDR（互补决定簇）区。CDR1编码16个氨基酸，CDR2编码7个氨基酸，CDR3编码7个氨基酸（如附图5所示）。可变区的框架区与其他鼠源性抗体的同源性为98%，而3个CDR区则为特异性序列，与其他鼠源性抗体轻链可变区CDR区有差异。

上述单克隆抗体1H9的腹水Elisa效价达1×10⁶。

上述单克隆抗体1H9对金属镉的检测灵敏度可达到2.1ng/mL。

上述高亲和力抗重金属镉单克隆抗体1H9在金属镉的检测方面的应用也在本发明的保护范围之内。

具体可应用于以单克隆抗体1H9为核心建立的各种免疫学检测方法和免疫学检测试剂盒。

作为一种可实施方案，本发明提供了一种金属镉的直接竞争Elisa检测方法，步骤如下：

（1）包被：将镉单克隆抗体1H9稀释至工作浓度加入包被板，37℃条件下孵育后，再用脱脂奶粉和聚乙二醇20000为混合封闭液，37℃恒温封闭；

（2）加样：每孔分别加入待测样品和酶标物Cd-EDTA-HRP，37℃孵育后，进行TMB底物显色，浓硫酸终止实验，进行酶标仪读数测定结果。

更具体地，操作如下：

（1）包被：将制备的镉单克隆抗体1H9稀释至工作浓度每孔100μL，37℃条件下孵育3小时后用PBST缓冲液洗涤3次，再用5%的脱脂奶粉和2%的聚乙二醇20000为混合封闭液进行37℃恒温封闭1小时，PBST缓冲液洗涤3次；

（2）加样：每孔分别加入50μL的待测样品和50μL工作浓度酶标物（Cd-EDTA-HRP）37℃孵育10min，PBST缓冲液洗涤3次，进行TMB底物显色，分别加A、B液各50μL，37℃避光15min，浓硫酸（2M）终止实验，进行酶标仪读数测定结果。

本发明采用直接竞争Elisa检测方法，通过对抗原合成时条件的优化并严格控制cd-EDTA与载体蛋白的偶联比，并免疫小鼠后，经过多次融合，及5次克隆化，筛选获得多株稳定的单克隆抗体细胞株，其中杂交瘤细胞株1H9效价最高，灵敏度最好，且反应非常迅速，并可应用于实际样品的检测中。

杂交瘤细胞株1H9分泌并纯化得到的单克隆抗体1H9具有高灵敏度与高特异性的特点，而且具有准确、迅速快捷、安全简便、试剂稳定和成本低廉等特点，可进行定量检测，特别适用于样品中镉的快速筛选。

本发明所述单克隆抗体与其他抗体相比具有高效价和高亲和力，所述抗体可在10min内与抗原结合达到平衡状态，采用测一步法反应快速，整个直接竞争ELISA可在30min内完成，并应用于实际样品检测中。

本发明具有以下有益效果：

本发明根据筛选获得的杂交瘤细胞株1H9，表达纯化得到了一种高亲和力抗重金属镉单克隆抗体1H9，单克隆抗体1H9克服了现有技术的瓶颈（现有技术中高效价、高特异性单克隆抗体的制备是制约金属镉免疫检测技术的瓶颈），具有高效价、高特异性、高灵敏性的特点，使得直接竞争Elisa法用于重金属镉的测定成为可能。

另外，根据单克隆抗体1H9建立的直接竞争Elisa检测方法，很好弥补了ELISA方法的时间缺陷，具有迅速快捷耗时短、灵敏准确、性能可靠，操作安全简便、试剂稳定和成本低廉等特点，可在30min得出结果，可进行定量检测，其敏感性可达2.1ng/mL，可实现样品中痕量重金属镉的快速筛查，可广泛用于含重金属镉的水溶液样品的分析测试和实际样品快速筛查。

附图说明

图1为完全抗原的合成原理图。

图2为重金属镉鼠源性单克隆抗体1H9纯化的SDS-PAGE检测结果图；1号泳道（M）为Marker，2号泳道（1）为纯化后1H9单抗。

图3为抗重金属镉鼠源性单克隆抗体1H9的效价检测ELISA结果图。

图4为抗体重链可变区3个CDR（互补决定簇）区。

图5为抗体轻链可变区3个CDR（互补决定簇）区。

图6为直接竞争ELISA的操作流程及检测原理图。

图7为抗重金属镉鼠源性单克隆抗体1H9与Cd-EDTA的竞争ELISA结果图。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。

实施例1 重金属镉完全抗原的合成

通过异硫氰酯法合成Cd-iEDTA-BSA（免疫原）与Cd-iEDTA-OVA（检测原），合成原理图如附图1所示，具体的制备方法如下：

（1）将1mg的iEDTA溶解于200μL DMSO，再逐滴加入200μL 6.4mg/mL的Cd²⁺标准液，确保Cd²⁺标准液与iEDTA的摩尔比为1.1～1.2：1，放置于24℃、125rpm摇床中震荡约5h，直至溶液呈现微黄色。

（2）将5mg BSA（或3.4mg OVA）溶解于2mLTris-HCl缓冲液（pH7.4）中，搅拌并逐滴加入反应后的Cd-iEDTA，并逐滴加入三乙胺调节pH至9.0，再添加10μL的PEG600，于24℃，125rpm摇床中震荡约36h，直至溶液呈现微黄色。反应后经Centricon-30超滤管超滤5次除去未螯合的Cd²⁺，其中离心机转速为5000g离心10min，合成得到重金属镉完全抗原，即免疫原Cd-iEDTA-BSA和检测原Cd-iEDTA-OVA。

实施例2杂交瘤细胞株1H9的筛选及单克隆抗体的制备

抗重金属镉鼠源性单克隆抗体的制备方法如下：

1、动物免疫

（1）用生理盐水将免疫原Cd-iEDTA-BSA稀释至200μg/mL，再加入相同体积的弗氏完全佐剂，通过注射器双推法乳化完全抗原；

（2）将5只BALB/c鼠（6～8周龄）进行编号，每只小鼠免疫剂量为100 μg、200μL，通过颈部皮下、腹部进行多点免疫；

（3）免疫3周后，配置200μg/mL的完全抗原0.7mL与0.7mL的弗氏不完全佐剂混匀，用上述免疫方法免疫，且日后2周免疫一次；

（4）小鼠免疫3次后，在第10天后断尾取血并测定血清效价。

（5）免疫5次后，取0.1 mL免疫原Cd-iEDTA-BSA通过尾静脉直接加强免疫。

（6）加强免疫后取小鼠脾脏用于细胞融合。

2、细胞融合

（1）脾细胞的准备：选择效价高且灵敏度高的BALB/c鼠，摘除眼球放血处死且收集血清作为阳性对照，将处死小鼠放于75%酒精中浸泡并转移至超净工作台内。无菌手术取出脾脏并去除多余的周围结缔组织，将脾脏放置于平皿中的钢丝网上，以注射器的内芯轻轻研磨并以不完全培养液冲洗，收集通过钢丝网孔的脾细胞溶液并计数；

（2）Sp2/0细胞的准备：取对数生长的骨髓瘤细胞SP2/0，用RPMI1640基础培养基（RPMI Medium 1640 basic，gibco购买，货号8114056，使用前加入青霉素与链霉素，每100mL培养基加入1mL含100U青霉素与链霉素双抗）洗涤，吹悬后计数；

（3）将收集的Sp2/0细胞与脾细胞悬液以1:5～10的比例转移至50 mL离心管中混匀，以1000 rpm离心7 min并倒除上清，轻轻叩动离心管管底使细胞松散下来；

（4）放置于37℃中水浴，在1min内逐滴加入50%的PEG4000共0.7mL，随后静置90s，再于2～4min内加入15mL的RPMI1640基础培养基终止融合，1000rpm离心7min后倒去上清；

（5）轻轻叩动管底使细胞松散下来，并加入HAT培养基混匀细胞，每孔100μL加入铺有饲养细胞的96孔板中，再放置于培养箱内（37℃、5% CO₂）培养。

3、融合细胞的筛选与克隆化

融合第7天以后观测细胞，先用间接ELISA方法检测细胞培养上清，筛选阳性细胞株，筛选得到的阳性孔再以竞争ELISA检测，操作如下：

（1）用包被缓冲液（pH 9.6、0.05M）将检测原Cd-iEDTA- OVA包被于酶标板中，每孔100μL，并放置于4℃冰箱过夜；

（2）以PBS-T洗涤3次，每次3 min，再加入5%的脱脂奶粉37℃封闭1 h，以PBS-T洗涤3次（3 min/次）；

（3）在包被的酶标板中分别加入50μL 10ng/mL的Cd²⁺-EDTA和EDTA、三蒸水，再加入50μL间接ELISA筛选得到的阳性孔细胞上清，于37℃温孵1h；

（4）同前洗涤，再加入1：10000稀释的HRP标记羊抗小鼠IgG，每孔100μL，37℃温孵1h；

（5）同前洗涤，再分别加入50μLA、B底物显色液，反应 10 min后用H₂SO₄（2 M）终止显色反应；

（6）检测OD450值并计算抑制率，确定阳性细胞孔；

4、阳性细胞克隆化及杂交瘤细胞株的筛选

将筛选的阳性孔细胞通过限稀释法进行克隆：将筛选的阳性细胞孔的细胞吹下并进行细胞计数；根据计数结果将细胞悬液加入一定量的不完全培养基进行系列稀释，使其稀释至10个/mL；按100 μL/孔将细胞稀释液铺到含饲养细胞的96孔板内，放置于培养箱（37℃，5% CO₂）中培养，将阳性细胞孔重复克隆直至得到100%的阳性细胞株，再进行扩大化培养。经过三次亚克隆筛选得到稳定分泌抗重金属镉单抗的杂交瘤细胞株，记为杂交瘤细胞株1H9，于2015年3月4日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC C201521，保藏地址为中国武汉武汉大学。

5、腹水型单抗的制备

（1）1到2周前，将10周龄的BALB/c鼠腹腔注射不完全佐剂（300μL /只）；

（2）选取生长状态良好的重金属镉阳性细胞，以不完全培养基洗涤后轻轻吹下，转移至离心管后进行细胞计数并离心（1000 rpm、7min），以5×105 cells/只腹腔注射预先处理的BALB/c鼠，并制备骨髓瘤细胞腹水为阴性对照；

（3）接种细胞7～10天后，待BALB/c鼠腹部出现明显膨大时通过注射器吸取腹水，并于3000 rpm离心15 min，收集上清并做好标记并在-20℃保存。

6、单克隆抗体的大量制备

（1）取10周龄雌性Balb/c小鼠腹腔注射0.5mL弗氏不完全佐剂；

（2）1周后于小鼠腹腔接种4×10⁵个杂交瘤细胞，细胞接种7～10天后可诱生腹水；

（3）待腹水尽可能多时抽取腹水；

（4）间隔1～2天，待腹水再生积聚后，同法再抽，抽取后腹水3000rpm 离心10min，取上清冻存于-20℃。

7、单克隆抗体的纯化

收集腹水，并利用滤器（0.22 μm孔径）进行过滤，以去掉脂肪等较大块的杂质。再置于4℃离心机中离心（10000 rpm, 15 min）去掉残留的细胞等微小颗粒，采集上清。

硫酸铵盐析法纯化抗体：

（1）混合：取同体积生理盐水与上清液混匀，然后逐滴加入等体积的饱和硫酸铵（预先配置）；

（2）静置：将混合液放置4℃的冰箱中，静置过夜使蛋白质沉淀下来；于将配制饱和硫酸铵（ASA）溶液；

（3）离心：将静置后的混合液转移至离心管内，于4℃离心（10000 rpm，20min）；

（4）重悬：将离心后的上清液倒出，再以PBS重悬沉淀物；

（5）透析：将重悬液转移到透析袋中，于4℃ 透析3天且期间不断更换PBS缓冲液；

（6）将透析后的抗体取出进行Protein G亲和层析柱纯化蛋白：

具体纯化步骤如下：

1）装柱:平衡柱子：用0.1M PBS（5～10倍柱体积），平衡柱子，冲出柱内20%乙醇，将核酸蛋白仪调零；

2）上样：上样前，先将恒流泵关闭，再缓慢上样，当A值开始上升时，收集液体（杂蛋白）防止蛋白质未结合上柱子，当样品即将上样完毕时加入0.1M PBS稀释，使蛋白质几乎完全上柱；

3）洗脱：当A值降至“0”时，用洗脱液洗脱目的蛋白，当A值开始上升时收集液体（由于蛋白质带负电，呈弱碱性，收集管中预先加入一定量中和液，使收集液pH保持在7.0以上）；

4）平衡柱子：当A值为“0”时，用0.1M PBS（5倍以上柱体积）过柱；

5）保存：用20%乙醇（5倍柱体积）过柱子，保存柱子。

6）蛋白质超滤浓缩后即得到抗重金属镉鼠源性单克隆抗体1H9，分装后-20℃保存。

8、SDS-PAGE检测

取少量单克隆抗体1H9进行SDS-PAGE凝胶电泳鉴定纯度，结果如附图2所示，抗体纯度较好，满足后续实验需求。

9、ELISA检测抗体效价

将检测原Cd-iEDTA-OVA以 100ng/mL进行包被，再加入倍比稀释的1H9纯化抗体，同时把倍比稀释的SP2/0 腹水做为阴性对照，间接ELISA的结果（如附图3所示）显示1H9腹水型单抗其效价达1×10⁶。

10、所述单克隆抗体1H9的可变区基因包括重链可变区基因和轻链可变区基因；所述重链可变区的基因序列如SEQ ID NO.1所示，所述轻链可变区的基因序列如SEQ ID NO.2所示；所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

实施例3 直接竞争ELISA检测

根据单克隆抗体1H9，建立了直接竞争ELISA检测方法，操作流程及检测原理如附图6所示。

具体操作如下：

（1）将制备的镉单克隆抗体稀释至工作浓度每孔100μL，37℃条件下孵育3小时后用PBST缓冲液洗涤3次。

（2）再用5%的脱脂奶粉和2%的聚乙二醇20000为混合封闭液进行37℃恒温封闭1小时，PBST缓冲液洗涤3次。

（3）分别加入50μL三蒸水作为对照孔和20 ng/mL Cd²⁺标准品作为竞争孔，再加入工作浓度稀释的酶标物Cd-iEDTA-HRP 50μL，37℃恒温箱反应10min。

（4）PBST 洗涤三次后，每孔分别加入50μL的A、B液，37℃显色反应15min，再每孔加入50μL H₂SO₄（2M）终止反应，测定OD₄₅₀值。每次检测均用3个平行组，以各重复样的平均值为检测结果。

实施例4抗体灵敏度检测

1、单克隆抗体1H9的灵敏度检测

（1）用三蒸水将Cd-EDTA标准品配置成系列浓度，即2.5、5、10、15、20、30ng/mL系列浓度，按50 μL/孔（μL/well）加入以最优工作条件包被的酶标板内；

（2）再添加按最佳浓度稀释的抗体（50 μL/well），37℃恒温箱反应10min；

（3）洗涤两次（3min/次）后，添加50μL A、B液显色15min后测定OD450nm。

（4）把Cd²⁺浓度对数作为横坐标，抑制率(B0-B)/B0(%)作为纵坐标，绘制标准抑制曲线，抑制率I以下公式计算：

其中，

——竞争物浓度的吸光值；

——空白对照孔吸光值。

（5）以抑制率为50%的竞争物浓度（IC₅₀）作为ELISA检测法的敏度，以抑制率为10%的竞争物浓度（IC₁₀）作为检测限，以IC₂₀- IC₈₀作为检测范围。

2、结果

以(B0-B)/B0(%)为纵坐标，横坐标为Cd²⁺ 浓度的对数，绘制标准曲线，检测结果如附图7所示，直接竞争ELISA检测法的标准曲线线性回归方程为y= 62.68x -12.4，R² =0.9966，检测灵敏度（IC₅₀）为9.9ng/mL，检测限（LOD）在2.1 ng/mL，检测范围（IC₂₀-IC₈₀）为3.3～29.8ng/mL，可达到《生活饮用水卫生标准》（GB5749-2006）中对Cd²⁺ ≤5ppb的检测要求，有实用价值。

实施例5 抗体准确性检测

1、ELISA检测法的准确性

（1）在直接ELISA检测法的线性范围内，配置4个不同浓度的的标准液，包括5ng/mL、8ng/mL、12ng/mL、25ng/mL；

（2）采用上述优化后的直接竞争ELISA法测定OD值，再通过标准曲线计算其浓度，其中，每个浓度点样三个孔并重复三块板进行检测；

（3）确定每个标准液检测的精密度和回收率，考察检测方法的准确性。

2、结果如表1所示

表1为抗重金属镉鼠源性单克隆抗体1H9实际应用精密度（准确性）测定结果

由检测结果可知，直接竞争ELISA法，标样的添加回收率平均变异系数为6（2.2%～8.76%），平均回收率为98.95%（98.20%～101.62%），能够满足重金属残留分析的一般要求。

实施例6 抗体特异性检测

1、采用竞争ELISA测定重金属单抗1H9与Hg²⁺、Mn²⁺、Zn²⁺、Ni²⁺、Mg²⁺、Fe²⁺、Cr³⁺、Pb²⁺、Al³⁺、Ca²⁺等金属离子和螯合剂EDTA的交叉反应：

（1）将检测原Cd-iEDTA-OVA包被，并以5%脱脂奶粉封闭；

（2）每排依次加入50μL三蒸水与7个系列浓度稀释的重金属螯合物（或螯合剂EDTA），再加入50μL稀释至工作浓度的小鼠腹水，37℃反应1 h；

（3）稀释三次后加入HRP标记的二抗并反应1h，洗涤5次；

（4）加入50μLA、B显色液反应10min后，以终止液终止，并检测OD₄₅₀值；

（5）根据以下公式计算交叉反应率：交叉反应率（CR%）= IC₅₀ (Cd²⁺)/ IC₅₀ (其它金属离子或EDTA)×100%。

2、通过直接竞争ELISA法结果显示，检测抗体的特异性良好。结果如表2所示。

表2单抗1H9与EDTA和其他重金属的交叉反应率

由表2数据可知，该镉单克隆抗体1H9除了对Hg²⁺有20%的交叉反应以外，与EDTA及Mg²⁺、Cr³⁺、Pb²⁺、Al³⁺、Ca²⁺、Ni²⁺、Hg²⁺、Mn²⁺、Zn²⁺、Fe²⁺等其他金属离子交叉反应较小，表明单克隆抗体1H9对重金属Cd²⁺具有很好的特异性。

实施例7 实际大米样品检测

1、大米样品不能进行直接检测，需要进行样品微波消解，及纳米TiO₂富集后才能用于Elisa检测中，将5份市售大米样品经烘干、粉碎、过筛后准确称量0.4000g样品于Teflon 消解罐里，加入5 mL HNO₃和1mL H₂O₂，室温放置1h进行预消解，然后放入微波消解仪中进行微波消解，消解完全后冷却至室温，所得消解液进行赶酸后用超纯水定容到50mL。所得消解液通过纳米TiO₂富集后使镉离子得到富集，同时排除大部分其他阳离子干扰，富集洗脱后再进行直接竞争Elisa检测实验，同时用石墨炉原子吸收法测定检测结果的准确度，每份样品做5份重复。

2、结果如表3所示

表3 为抗重金属镉鼠源性单克隆抗体1H9检测大米样品结果

由结果得到，两种检测方法对5份大米样品的检测结果相吻合，ELISA检测结果略高于仪器法检测，可能检测基质对免疫学检测造成一定影响，该ELISA检测方法变异系数在4.17%～11.4%之间符合检测变系数小于20%的检测需求，可用于实际样品检测分析中。

SEQUENCE LISTING

<110> 暨南大学

<120> 一种高亲和力抗重金属镉单克隆抗体及其应用

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 348

<212> DNA

<213> 抗体重链可变区的基因序列

<400> 1

ttaggtcaag ctgcagcagt ctggggctga actggctaaa cctggggcct cagtgaggat 60

gtcctgcaag gcttctggct acacgtttac tgtctactgg atatcctgga taaaacagag 120

gcctggacag ggtctggaat ggattggata tattaatcct agtattggtt atcctgatta 180

caatcagaag ttcaaggaca aggccacatt gactatagac atatcctcca ccacagccta 240

catggaactg agcagcctga catctgaaga ctctgcagtc tattattgta caagaggaca 300

ctactttgac tactggggcc aagggaccac ggtcaccgtc tcctcaaa 348

<210> 2

<211> 336

<212> DNA

<213> 抗体轻链可变区的基因序列

<400> 2

gatgttgtga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60

atctcttgca gatctagtca gaacattgta catagtaatg gaaacaccta tttagaatgg 120

ttcctgcaga aaccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttt caaccgattt 180

tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240

agcagagtgg aggctgagga tctgggaatt tattactgct ttcaaagttc acatgttcct 300

cggacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaa 336

<210> 3

<211> 114

<212> PRT

<213> 抗体重链可变区的氨基酸序列

<400> 3

Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys Pro Gly Ala Ser

1 5 10 15

Val Arg Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Val Tyr Trp

20 25 30

Ile Ser Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly

35 40 45

Tyr Ile Asn Pro Ser Ile Gly Tyr Pro Asp Tyr Asn Gln Lys Phe Lys

50 55 60

Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ile Asp Ile Ser Ser Thr Thr Ala Tyr Met

65 70 75 80

Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Thr

85 90 95

Arg Gly His Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val

100 105 110

Ser Ser

<210> 4

<211> 112

<212> PRT

<213> 抗体轻链可变区氨基酸序列

<400> 4

Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Phe Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Phe Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys Phe Gln Ser

85 90 95

Ser His Val Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Claims

1.一株分泌高亲和力抗重金属镉单克隆抗体的杂交瘤细胞株1H9，其特征在于，该杂交瘤细胞株1H9于2015年3月4日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCC201521。

2. 一种高亲和力抗重金属镉单克隆抗体1H9，其特征在于，由权利要求1所述杂交瘤细胞株1H9分泌所得；所述单克隆抗体1H9的可变区包括重链可变区和轻链可变区；所述重链可变区基因序列如SEQ ID NO.1所示，所述轻链可变区基因序列如SEQ ID NO.2所示；所述重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

3.权利要求2所述高亲和力抗重金属镉单克隆抗体1H9在制备金属镉的免疫学检测试剂盒方面的应用。

4.一种非诊断的金属镉的直接竞争Elisa检测方法，其特征在于，步骤如下：

（1）包被：将权利要求2的镉单克隆抗体1H9稀释至工作浓度加入包被板，37℃条件下孵育后，再用脱脂奶粉和聚乙二醇20000为混合封闭液，37℃恒温封闭；

5.根据权利要求4所述金属镉的直接竞争Elisa检测方法，其特征在于，步骤（1）包被：将镉单克隆抗体1H9稀释至工作浓度，每孔100μL，37℃条件下孵育3小时后，用PBST缓冲液洗涤3次，再用5%的脱脂奶粉和2%的聚乙二醇20000为混合封闭液，37℃恒温封闭1小时，PBST缓冲液洗涤3次。

6.根据权利要求4所述金属镉的直接竞争Elisa检测方法，其特征在于，步骤（2）加样：每孔分别加入50μL的待测样品和50μL工作浓度酶标物Cd-EDTA-HRP，37℃孵育10min，PBST缓冲液洗涤3次，进行TMB底物显色，37℃避光15min，2M的浓硫酸终止实验，进行酶标仪读数测定结果。