CN104004719A - 一株邻苯二甲酸酯类通用性单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用 - Google Patents

Abstract

一株邻苯二甲酸酯类通用性单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫学检测技术领域。本发明制备半抗原，将半抗原通过戊二醛法偶联蛋白，得到邻苯二甲酸二丁酯完全抗原，与弗氏佐剂混合均匀后，通过皮下注射免疫BALB/c小鼠；用重氮化法合成包被抗原用于小鼠血清和细胞上清的筛选。将免疫小鼠的脾细胞通过PEG方法与小鼠骨髓瘤细胞融合，经过间接ELISA和间接竞争ELISA筛选和三次亚克隆，得到一株群选性的杂交瘤细胞株单克隆细胞株C。本发明提供的单克隆细胞株C对DEHP、DINP也具有一定的识别能力，可以满足目前市场上对邻苯二甲酸酯类塑化剂免疫检测产品的需求。

Description

一株邻苯二甲酸酯类通用性单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用

技术领域

本发明涉及一株邻苯二甲酸酯类通用性单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，涉及邻苯二甲酸酯类塑化剂通用单克隆抗体的制备方法，属于食品安全免疫学检测技术领域。

背景技术

塑化剂（Plasticizer），是一种增加材料的柔软性或是材料液化的添加剂。其中最常见的塑化剂是邻苯二甲酸酯类物质（Phthalate Esters，PAEs），是邻苯二甲酸的酯化衍生物。

邻苯二甲酸酯类塑化剂是具些许芳香气味或无气味的无色液体，中等黏度、高稳定性、低挥发性、成本低廉、低水溶解度，但易溶于多数有机溶剂中。邻苯二甲酸酯类在日常及工业上被广泛使用，以邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP）为最大宗，占塑化剂产量的四分之三，其次是邻苯二甲酸二丁酯（DBP）。邻苯二甲酸酯类塑化剂被归类为疑似环境荷尔蒙，其生物毒性主要属雌激素与抗雄激素活性，会造成内分泌失调，阻害生物体生殖机能，包括生殖率降低、流产、天生缺陷、异常的精子数、睪丸损害，还会引发恶性肿瘤、造成畸形儿。

近年来，酒、饮料、食用油以及方便食品中邻苯二甲酸酯类塑化剂超标事件频发，人们谈“塑”色变，使得邻苯二甲酸酯的快速、准确检测成为迫切需求。

目前检测PAEs的方法主要有高效液相色谱法（HPLC）、液质联用法（LC/MS）等仪器检测方法，而免疫分析方法相对较少。其中仪器检测方法检测准确，但仪器昂贵，操作复杂，样品前处理繁琐。免疫分析方法相对于仪器检测方法，具有低成本、高通量、高灵敏、对技术人员要求低等特点，因此适用于大量样品的快速筛查。

发明内容

本发明的目的在于提供一种邻苯二甲酸酯类塑化剂通用性单克隆抗体的制备方法，通过细胞株的筛选，得到的抗体对邻苯二甲酸酯类DBP、DIBP、BBP、DNP等具有较好检测灵敏度，可以用来建立邻苯二甲酸酯类总量的免疫学检测方法。

本发明的技术方案：一株邻苯二甲酸酯类通用性单克隆抗体杂交瘤细胞株，其分类命名为单克隆细胞株C号，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.9303。

菌株单克隆细胞株C号分泌产生的邻苯二甲酸酯类通用性单克隆抗体，其由邻苯二甲酸酯类通用性单克隆抗体杂交瘤细胞株单克隆细胞株C号所分泌产生。所述邻苯二甲酸酯类通用性单克隆抗体应用于邻苯二甲酸酯类的多残免疫检测。

提供的邻苯二甲酸酯类通用性单克隆抗体的制备方法基本步骤为：

（1）半抗原的制备：

a、酯化反应：称取0.12mol的4-硝基邻苯二甲酸于100mL三颈烧瓶，加入0.1mol正丁醇，加入6mL苯助溶，磁力搅拌，缓慢加入1.6mL浓硫酸，加热升温至120℃，反应12h，减压蒸去有机溶剂，将油状残留加入到冷水中并用10%的Na₂CO₃溶液洗至下层水层无色，上层得到暗红色的油状粗品，用无水乙醇重结晶得到4-硝基邻苯二甲酸二丁酯。

b、还原反应：称取7mmol的还原铁粉于50mL圆底烧瓶，加入2mL水、1mmol氯化铵，水浴加热15min。另取4-硝基邻苯二甲酸二丁酯1.4mmol，用5mL甲醇溶解，分3次加入上述反应液中，回流反应5h。趁热过滤铁粉，将滤液减压蒸馏，得到的橙红色残留用少量热甲醇溶解，低温析出1.17mmol 4-氨基邻苯二甲酸二丁酯作为半抗原备用。

（2）完全抗原的制备：采用戊二醛法合成免疫原，重氮化法合成包被原。

免疫原合成的具体步骤如下：将5mg半抗原用DMF溶解，与戊二醛溶液以1:1.2的摩尔比混合，室温下活化30min后，将活化液逐滴加入10mg KLH中,室温反应3-4h，用0.1mol PBS透析5天即可；

包被原合成的具体步骤如下：A液制备：取0.023mmol半抗原于25mL烧杯中，加入2mL DMF、0.2mL水和0.2mL的1mol/L盐酸，形成黄色溶液，冷至0-5℃。然后逐滴滴加1mol/L亚硝酸钠溶液，用淀粉碘化钾试纸监测，直到试纸变蓝灰色停止滴加，4℃下搅拌1h。B液制备：称取150mg的OVA溶于6mL pH 9.0硼酸盐缓冲液，4℃保存。在4℃搅拌下，将A液逐滴滴加到B液中，并用1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH，使pH保持在9，4℃搅拌过夜，透析即得到包被原（DBP-OVA）。

（3）动物免疫与效价测定：采用小剂量短周期方案免疫健康BALB/c 雌性小鼠，首次免疫用100μg 偶联抗原与等量福氏完全佐剂混匀后进行皮下注射，间隔3周后，再用100μg 偶联抗原与等量福氏不完全佐剂加强免疫，此后每隔3周用半量偶联抗原加强免疫一次；冲刺免疫剂量减半，与等体积的生理盐水混合后采用腹腔免疫，通过间接竞争ELISA检测血清效价和抑制；

其具体ELISA 程序如下：

1)包被：将包被抗原用0.05M pH9.6 碳酸盐缓冲液梯度稀释，100μL/孔，37℃孵育2h；

2)洗涤：将板内溶液倾去，每孔注入200μL PBST溶液，置于摇床上振荡3min，甩干，洗涤3次。以下洗涤方法相同；

3)封闭：拍干后，加入200μL /孔封闭液，37℃孵育2h。洗涤后烘干备用；

4)加样：酶标板上半部分加入PBS，50μL/孔（上半部分称为0标），下半部分加入不同浓度的邻苯二甲酸酯类标准品，将抗血清从1:1000开始梯度稀释，50μL/孔（下半部分成为加标），上下部分对应加入不同稀释梯度包被抗原的孔中，37℃孵育30min；充分洗涤后，加入1:3000稀释的鼠二抗，100μL/孔，37℃孵育30min，洗涤后拍干；

5)显色：将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100μL的显色液（TMB与底物液比例1:5），37℃避光反应15min；

6)终止和测定：取出酶标板，每孔加入50μL终止液（2mol/L的硫酸）终止反应，然后用酶标仪测定各孔的吸光值A₄₅₀；

7)结果判读：以OD值大于或等于阴性血清对照孔的2.1倍（即P/N≥2.1）所对应的血清最高稀释倍数即为血清的ELISA效价。上下部分对照，加标OD值为0标一半的，即是所加的标准品浓度。

（4）细胞融合与筛选：在冲击免疫三天后，按照常规PEG（聚乙二醇，分子量为1450）方法进行细胞融合，具体步骤如下：

a、无菌取小鼠脾脏，研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，并进行细胞计数；

b、收集SP2/0细胞，悬浮于RPMI-1640基础培养液中，进行细胞计数；

c、将脾细胞和SP2/0细胞按照数量比1︰10的比例混合，离心后用50% PEG融合，时间1 min，之后按照从慢到快，加入RPMI-1640基础培养液，离心后悬浮于含20% 胎牛血清、2%的50×HAT的RPMI-1640筛选培养液中，加到96孔细胞培养板，置于37℃、5%CO₂的培养箱中培养。在细胞融合的第三天对融合细胞进行RPMI-1640筛选培养液半换液，第6天进行用含20% 胎牛血清、1%的100×HT的RPMI-1640过渡培养液进行全换液，在第9天取细胞上清进行筛选。

筛选分三步：第一步先用间接ELISA筛选出阳性细胞孔。第二步选用DBP、BBP、DIBP及DNP为标准品，用间接竞争ELISA对阳性细胞进行抑制效果测定。第三步将第二步筛选出的孔进行扩大培养，加入其它邻苯二甲酸酯类标准品，进一步进行筛选，选择对多种标准品均有较好抑制的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，用同样的方法进行检测。重复三次，即可得到能稳定分泌邻苯二甲酸酯类通用性单克隆抗体的细胞株单克隆细胞株C号。

（5）单克隆抗体的制备与鉴定：取8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射石蜡油1 mL；7天后每只小鼠腹腔注射1×10⁶单克隆细胞株C号细胞，从第七天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-硫酸铵法纯化，获得的单抗置于 -20℃保存。

本发明的有益效果：本发明通过衍生得到半抗原4-氨基邻苯二甲酸二丁酯，再用戊二醛法合成完全抗原DBP-KLH，免疫BALB/c 小鼠，用重氮化法合成包被原用于小鼠血清以及获得了对DBP、DIBP、BBP、DNP等均具有较好亲和力和检测灵敏度的单克隆抗体；该单克隆抗体使得邻苯二甲酸酯类的多残免疫检测方法成为了可能。

生物材料样品保藏：上述小鼠单克隆抗体杂交瘤细胞株单克隆细胞株C号，已于2014年5月 28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址为:北京市朝阳区北辰西路1号院3 号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.9303。

附图说明

图1 该单克隆抗体对DBP、BBP、DIBP、DNP及DMP的标准曲线。

具体实施方式

本发明下面的实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不能作为本发明的限定内容或范围。下面通过实施例对本发明作进一步说明。

本发明通过将DBP完全抗原免疫小鼠，通过细胞融合，HAT选择性培养基培养，通过间接ELISA和间接竞争ELISA筛选细胞上清，最终得到了对DBP、BBP、DIBP、DNP等均有较好灵敏度的通用性单克隆抗体。

实施例1 邻苯二甲酸酯类通用性单克隆抗体的制备

1、半抗原的合成 

1.1酯化反应：称取0.12mol的4-硝基邻苯二甲酸于100mL三颈烧瓶，加入0.1mol正丁醇，加入6mL苯助溶，磁力搅拌，缓慢加入1.6mL浓硫酸，加热升温至120℃，反应12h，减压蒸去有机溶剂，将油状残留加入到冷水中并用10%的Na₂CO₃溶液洗至下层水层无色，上层得到暗红色的油状粗品，用无水乙醇重结晶得到4-硝基邻苯二甲酸二丁酯。

1.2还原反应：称取7mmol的还原铁粉于50mL圆底烧瓶，加入2mL水、1mmol氯化铵，水浴加热15min。另取4-硝基邻苯二甲酸二丁酯1.4mmol，用5mL甲醇溶解，分3次加入上述反应液中，回流反应5h。趁热过滤铁粉，将滤液减压蒸馏，烘干，得到4-氨基邻苯二甲酸二丁酯作为半抗原备用。

2、完全抗原的制备

免疫原的合成：将5mg半抗原用DMF溶解，与戊二醛溶液以1:1.2的摩尔比混合，室温下活化30min后，将活化液逐滴加入10mg KLH中，室温反应3-4h，用0.1mol PBS透析5天即可；

包被原合成：

A液制备：取0.023mmol半抗原于25mL烧杯，加入2mL DMF、0.2mL水和0.2mL的1mol/L盐酸，形成黄色溶液，冷至0-5℃。然后逐滴滴加1mol/L亚硝酸钠溶液，用淀粉碘化钾试纸监测，直到试纸变蓝灰色停止滴加，4℃下搅拌1h。

B液制备：称取150mg的OVA溶于6mL pH9.0硼酸盐缓冲液，4℃保存。在4℃搅拌下，将A液逐滴滴加到B液中，并用1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH，使pH保持在9，4℃搅拌过夜，透析即得到包被原（DBP-OVA）。

3、动物免疫：选择健康的6～8周龄的BALB/c 小鼠进行免疫。取DBP完全抗原与等体积弗氏完全佐剂混合均匀后，通过皮下注射免疫BALB/c小鼠，每只100μg；每间隔21天，采用DBP完全抗原与等体积弗氏不完全佐剂进行加强免疫，三免后7-10天采血，使用间接竞争ELISA方法测定小鼠血清效价和抑制，选择抑制最好的小鼠，在四免后21天冲击免疫，不使用佐剂，腹腔注射。通过间接竞争ELISA检测血清效价和抑制；

其具体ELISA 程序如下：

1)包被：将包被抗原用0.05M pH9.6 碳酸盐缓冲液梯度稀释，100μL/孔，37℃孵育2h；

2)洗涤：将板内溶液倾去，每孔注入200μL PBST溶液，置于摇床上振荡3min，甩干，洗洗涤3次。以下洗涤方法相同；

3)封闭：拍干后，加入200μL /孔封闭液，37℃孵育2h。洗涤后烘干备用；

4)加样：酶标板上半部分加入PBS，50μL/孔（上半部分称为0标），下半部分加入不同浓度的邻苯二甲酸酯类标准品，将抗血清从1:1000开始梯度稀释，50μL/孔（下半部分成为加标），上下部分对应加入不同稀释梯度包被抗原的孔中，37℃孵育30min；充分洗涤后，加入1:3000稀释的鼠二抗，100μL/孔，37℃孵育30min，洗涤后拍干；

5)显色：将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100μL的显色液（TMB与底物液比例1︰5），37℃避光反应15min；

6)终止和测定：取出酶标板，每孔加入50μL终止液（2mol/L的硫酸）终止反应，然后用酶标仪测定各孔的吸光值OD₄₅₀。

7)结果判读：以OD₄₅₀值大于或等于阴性血清对照孔的2.1倍（即P/N≥2.1）所对应的血清最高稀释倍数即为血清的ELISA效价。上下部分对照，加标OD值为0标一半的，即是所加的标准品浓度。

4、细胞融合：在冲击免疫三天后，按照常规PEG（聚乙二醇，分子量为1450）方法进行细胞融合，具体步骤如下：

（1）无菌取小鼠脾脏，研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，并进行细胞计数；

（2）收集SP2/0细胞，悬浮于RPMI-1640基础培养液中，进行细胞计数；

（3）将脾细胞和SP2/0细胞按照数量比1︰10的比例混合，离心后用50% PEG融合，时间1 min，之后按照从慢到快，加入RPMI-1640基础培养液，离心后悬浮于含20% 胎牛血清、2%的50×HAT的RPMI-1640筛选培养液中，加到96孔细胞培养板，置于37℃、5%CO₂的培养箱中培养。

5、细胞筛选与细胞株建立：在细胞融合的第三天对融合细胞进行RPMI-1640筛选培养液半换液，第6天进行用含20% 胎牛血清、1%的100×HT的RPMI-1640过渡培养液进行全换液，在第9天取细胞上清进行筛选。筛选分三步：第一步先用间接ELISA筛选出阳性细胞孔。第二步选用DBP、BBP、DIBP和DNP为标准品，用间接竞争ELISA对阳性细胞进行抑制效果测定。第三步将第二步筛选出的孔进行扩大培养，加入其它邻苯二甲酸酯类标准品，进一步进行筛选，选择对多种标准品均有较好抑制的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，用同样的方法进行检测。重复三次，即可得到能稳定分泌邻苯二甲酸酯类通用性单克隆抗体的细胞株。

6、单克隆抗体的制备与鉴定：取8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射石蜡油1 mL；7天后每只小鼠腹腔注射1×10⁶单克隆细胞株C号细胞，从第七天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-硫酸铵法纯化，获得的单抗置于-20℃保存。

使用间接竞争ELISA和间接ELISA，测定单克隆抗体对DBP、DIBP、BBP、DNP、DMP的IC₅₀分别为：10.5ng/mL、15ng/mL、15.5ng/mL、42.5ng/mL、64.3ng/mL；此外该细胞株C号对DEHP、DINP也具有一定的识别能力，可以满足目前市场上对邻苯二甲酸酯类塑化剂免疫检测产品的需求。

该单克隆抗体对BBP、DIBP、DNP、DMP、DEHP及DINP的IC₅₀和交叉反应率如表1所示。

表1

	IC50(ng/mL)	交叉反应率
			DBP	10.5	100.00%
DIBP	15	70.00%
			BBP	15.5	67.74%
DNP	42.5	24.71%
			DMP	64.3	16.32%
DEHP	1300	＜10%
			DINP	1000	＜10%

综上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用来限定本发明的实施范围。即凡依本发明申请专利范围的内容所作的等效变化与修饰，都应为本发明的技术范畴。

Claims (3)

1.一株邻苯二甲酸酯类通用性单克隆抗体杂交瘤细胞株，其分类命名为单克隆细胞株C号，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.9303。

2.权利要求1所述菌株单克隆细胞株C号分泌产生的邻苯二甲酸酯类通用性单克隆抗体，其特征在于：其由邻苯二甲酸酯类通用性单克隆抗体杂交瘤细胞株单克隆细胞株C号所分泌产生。

3.权利要求2所述邻苯二甲酸酯类通用性单克隆抗体的应用，其特征在于：所述邻苯二甲酸酯类通用性单克隆抗体应用于邻苯二甲酸酯类的多残免疫检测。