CN102998454A - 一种检测生物体内邻苯二甲酸二丁酯相对含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种检测生物体内组织邻苯二甲酸二丁酯（DBP）相对含量的方法。利用DBP人工抗原免疫小鼠而制得DBP单克隆抗体，用DBP单克隆抗体与生物组织样品中的DBP结合，再通过荧光二抗标示DBP的分布。本发明还可以通过图像分析软件分析荧光强度，从而计算DBP的含量。本发明对DBP的含量和分布可以进行可视化分析，灵敏度高，方便快捷，稳定性好，成本低廉。

Description

一种检测生物体内邻苯二甲酸二丁酯相对含量的方法

技术领域

本发明涉及一种检测生物体内邻苯二甲酸二丁酯相对含量的方法，属于生物技术领域。

背景技术

近年来在许多国家和地区，塑化剂对食品、环境的污染引起了人们强烈的担忧。邻苯二甲酸二丁酯(DBP)属于苯二甲酸酯类化合物，被普遍应用于塑料制品、胶水、油漆、指甲油、洗发水和沐浴液等数百种产品中。邻苯二甲酸二丁酯是半挥发性化合物，不与终产品共价结合，在生产和生活中，被不断地释放到大气、土壤和水环境中。环境中的邻苯二甲酸二丁酯又通过呼吸、饮食、皮肤接触等三种途径进入人体。因此，人类正面临着越来越高的邻苯邻苯二甲酸二丁酯暴露风险。有研究报告指出：我国普通人群DBP日摄入量为12.2ug/kg bw，高于世界平均水平。

动物模型研究和流行病学调查发现邻苯二甲酸二丁酯可以引起雄性生殖发育的障碍。邻苯二甲酸酯还具有免疫毒性，能导致儿童产生哮喘、湿疹、鼻炎等持久性过敏症。此外，邻苯二甲酸二丁酯还能能导致糖尿病、肥胖症等。

因此，邻苯二甲酸二丁酯检测已成为食品安全、环境监测、毒理学研究等领域的重要工作。由于邻苯二甲酸二丁酯在水环境、生物体内的含量较低，常常在检测域以下，因此邻苯二甲酸二丁酯的含量分析是一件非常困难的工作。

早期用含同位素¹⁴C的DBP饲喂实验动物，然后检测体内组织中的放射性水平来评价DBP的水平。但是由于DBP在生物体内降解快，所检测到的放射量只是DBP和降解代谢物的总体水平，并不能代表DBP在生物组织内的真正含量。

现在DBP的分析多采用气相色谱（GC）、HLPC、GC-质谱联用法等色谱分析技术，但这些技术需要进行样品前处理等，耗时多，并且有较高的仪器要求，色谱柱等耗材价格昂贵，此外，还需要操作人员有丰富的经验。

免疫分析由于选择性强、灵敏度高，一次可检测多种样品，因此把免疫分析技术应用于DBP检测具有简便、快速、成本低的优点。张明翠等用一种DBP的多克隆抗体，通过免疫组化法分析了水和包装的食品中DBP的含量。Yanaihara等运用酶联免疫分析法(ELISA)分析了邻苯二甲酸酯类物质的含量。但是，这两个研究都是基于多克隆抗体的免疫分析。多克隆抗体对抗原的专一选择性、灵敏度上都不及单克隆抗体。多克隆抗体受限于实验动物，不能无限制的获取。此外，由于从不同动物个体中获取的多克隆抗体的选择性、灵敏度、效价等都不同，因此用多克隆抗体建立同一标准的免疫分析方法就很困难。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明所要解决的技术问题是提供操作简便、灵敏度高的检测生物体内邻苯二甲酸二丁酯相对含量的方法。

本发明利用DBP结构类似物作为半抗原连接载体蛋白OVA而制得人工抗原，该人工抗原免疫小鼠所得脾细胞和瘤细胞杂交融合而筛选得到能稳定分泌DBP单克隆抗体的细胞株，小鼠腹水法大量制备DBP单克隆抗体。取待测生物组织样品制成冰冻切片，用该DBP单克隆抗体与生物组织样品中的DBP结合，再通过荧光二抗标示DBP的分布。通过图像分析软件IPP分析荧光强度，从单位面积荧光值计算DBP的相对含量。

本发明所采用的技术方案是：

（1） 利用DBP结构类似物4-氨基邻苯二甲酸二丁酯（DBAP）作为半抗原连接载体蛋白OVA而制得人工抗原，用该人工抗原免疫小鼠所得脾细胞和瘤细胞杂交融合，而筛选得到能稳定分泌DBP单克隆抗体的细胞株，通过小鼠腹水法大量制备DBP单克隆抗体；

（2） 取待测生物组织样品制成冰冻切片，用（1）所得DBP单克隆抗体与生物组织样品中的DBP结合，再通过荧光二抗标示DBP的分布；

（3） 通过图像分析软件分析荧光强度，从单位面积荧光值计算DBP的相对含量。

本发明将单克隆抗体技术、免疫荧光技术和图像分析软件技术相结合。更具体地，可采用如下步骤：

1） 用人工抗原DBAP-OVA免疫小鼠，取免疫小鼠脾细胞与瘤细胞融合，筛选出阳性杂交瘤细胞并克隆化，通过小鼠腹水法大量制备单克隆抗体，再通过硫酸铵沉淀法纯化DBP单克隆抗体；

2） 抗体效价检测；

3） 载玻片预处理：将载玻片用王水浸泡过夜，大量流水冲洗干净并晾干，再在DEPC水配制的多聚赖氨酸溶液中浸泡30min，室温晾干备用；

4） 生物组织材料切片和封闭：取待测生物组织样品用4%PFA固定1小时，再用液氮冰冻并用OCT包埋样品，用冰冻切片机在-20℃下将包埋样品切成5-10μL薄片，将冰冻切片贴于载玻片上在37℃烘干1h，冷却至室温，在卧式染缸中用PBS将载玻片洗3次，每次10min；用5%的溶于PBS的奶粉在室温下封闭1h；

5） DBP单克隆抗体结合DBP：用PBS冲洗载玻片洗去牛奶，加入DBP单克隆抗体孵育，每片加200μL 1%溶于PBS的奶粉，按1：100比例稀释DBP单克隆抗体，4℃孵育过夜;取出玻片，放入卧式染缸用PBST（PBS+0.1%Tween-20）在摇床上洗5次,每次10min;再用PBS在摇床上洗3次，每次10min;

6） 二抗标记DBP单克隆抗体：加入二抗和PI孵育液（1:100稀释FITC-标记羊抗鼠血清，10μg/ml PI，2%正常羊血清，溶于PBS）黑暗中室温孵育1h;取出玻片，放入卧式染缸用PBS在摇床上洗6次，每次10min;

7） 用抗淬灭剂封片，用激光共聚焦显微镜观察并拍照，使用图像软件分析荧光强度，从单位面积荧光值计算DBP的相对含量。

比较分析各样品DBP含量时，显微镜的波长等参数应一致。

本发明对DBP含量和分布可以进行可视化分析，灵敏度高，方便快捷，稳定性好，成本低廉，且由于本发明的单克隆抗体对DBP特异性强，因此检测结果不受其它酞酸酯的影响。本发明可以广泛适用于检测生物体内邻苯二甲酸二丁酯的含量，评价环境中邻苯二甲酸二丁酯的污染水平。

附图说明

图1显示的是将大鼠通过皮肤涂抹400mg/kg/d DBP染毒五天后，取皮肤组织制成冰冻切片，通过基于DBP单克隆抗体的免疫荧光技术分析DBP在皮肤组织内的分布。

上排为DBP染毒组：左为FITC绿色荧光显示DBP的分布；中为PI染色显示细胞核； 右为前两者的融合照片。

下排为未染毒对照组：左为FITC绿色荧光显示DBP；中为PI染色显示细胞核； 右为前两者的融合照片。

图2显示的是通过灌胃法将大鼠暴露于400mg/kg/d的DBP，染毒五天后，24小时内取肾组织制成冰冻切片，通过基于DBP单克隆抗体的免疫荧光技术分析DBP在肾组织内的分布。

上排为DBP染毒组：左为FITC绿色荧光显示DBP的分布；中为PI染色显示细胞核； 右为前两者的融合照片。

下排为未染毒对照组：左为FITC绿色荧光显示DBP；中为PI染色显示细胞核； 右为前两者的融合照片。

图3显示的是通过灌胃法将大鼠暴露于400mg/kg/d的DBP，染毒五天后，24小时内取肾、肝、胃、睾丸组织制成冰冻切片，通过基于DBP单克隆抗体的免疫荧光技术分析DBP在各组织内的分布，再通过IPP软件分析激光共聚焦照片的荧光强度而计算DBP的相对含量。

图4显示的是通过灌胃法将大鼠暴露于400mg/kg/d的DBP，染毒五天，分别在染毒结束后的24小时、48小时、72小时采集肾组织样品制成冰冻切片，通过基于DBP单克隆抗体的免疫荧光技术分析DBP在肾组织内的分布，再通过IPP软件分析激光共聚焦照片的荧光强度而计算DBP的相对含量。

图5显示的是通过灌胃法将大鼠暴露于400mg/kg/d的DBP，染毒五天，分别在染毒结束后的24小时、48小时、72小时采集肝组织样品制成冰冻切片，通过基于DBP单克隆抗体的免疫荧光技术分析DBP在肝组织内的分布，再通过IPP软件分析激光共聚焦照片的荧光强度而计算DBP的相对含量。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明。

一、实验材料

1. 分泌抗DBP单克隆抗体的杂交瘤细胞株：由华中师范大学生命科学学院环境科学实验室保存，可对外发售。该杂交瘤细胞细胞能稳定分泌抗体，生长状态良好。

2. 10周龄BALB/C小鼠，购自湖北省疾病控制

3. 6周龄Wistar大鼠中心

二、实验方法

1. 实验动物染毒处理

6周龄Wistar大鼠购自湖北省疾病控制中心，每笼2-3只饲养在22±3 ◦C 和湿度为 55±10%房间里，可自由进食和饮水。将DBP溶解在玉米油中分别通过灌胃方式、皮肤涂抹方式暴露5天，暴露剂量为400mg/kg/d, 分别在染毒结束后的24小时、48小时、72小时取大鼠皮肤、肝、肾、胃、睾丸等组织固定。

2. 抗DBP单克隆抗体制备

取10周龄BALB/C小鼠，腹腔注射0.5ml灭菌石蜡油。10天后。取生长状态良好的杂交瘤细胞，用PBS漂洗，吹下，1000rpm离心5min收集细胞，0.4mlPBS重悬细胞。注射到石蜡处理过的小鼠腹腔内，10-12天后收集小鼠腹水，1000rpm离心5min沉淀细胞，收集细胞上清。

3. 硫酸铵沉淀法纯化DBP单克隆抗体

1）取腹水与醋酸盐缓冲液按1:2混合，再加入33μl正辛酸，室温搅拌30min，4℃静置2h。

2）4℃12000g离心15min，取上清调pH值到7.4。

3）向上清液中加入等体积饱和硫酸铵溶液，搅拌30min，4℃静置1h。

4）4℃12000g离心15min，弃上清，用4ml半饱和硫酸铵溶液洗涤后，再溶于PBS中。

5）向悬液中加适量饱和硫酸铵溶液使饱和度为33%，搅拌30min，4℃静置1h。

6）4℃12000g离心15min，弃上清，再溶于PBS中，用100倍体积的PBS4℃透析24h，8h换一次液。

7）取透析后样品测定蛋白含量并用SDS-PAGE检测抗体纯度。

4 抗体效价测定

1） 包被：用包被缓冲液将人工抗原（DBAP-BSA）稀释到0.25μg/ml或0.5μg/ml，100μL/空加入酶标板中，同时设置加有100μL包被缓冲液的对照孔，4℃过夜；

2）封闭:倒出酶标板内孔内液体，拍干，每孔加入250μL1%OVA，37℃封闭1h，倒出酶标板内孔内液体，拍干；每孔加入200μL洗涤缓冲液洗板，倒出孔内液体，拍干；重复洗3次；

3）用抗体稀释液将DBP单抗从1:500开始2倍梯度稀释后加入酶标板孔内，37℃孵育1h，倒出酶标板内孔内液体，拍干；每孔加入200μL洗涤缓冲液洗板，倒出孔内液体，拍干；重复洗3次；

4）加酶标二抗：用抗体稀释液将HRP标记羊抗小鼠IgG以1:10000稀释，100μL每孔加入酶标板中，37℃孵育1h，倒出酶标板内孔内液体，拍干；每孔加入200μL洗涤缓冲液洗板，倒出孔内液体，拍干；重复洗3次；

5）显色：每孔加入新鲜配制的底物显色液，室温避光反应15min；

6）终止：每孔加入50μL 2mol/L H₂SO₄终止反应；

7）用酶标仪测定492nm处吸光度值；吸光度接近1.0处的抗体稀释度1：1600为抗体的工作浓度；

5. 冰冻切片

1）载玻片预处理

将载玻片用王水浸泡过夜，大量流水冲洗干净并晾干，再在DEPC水配制的多聚赖氨酸溶液中浸泡30min，室温晾干备用；

2）生物组织材料固定

取步骤1中准备的大鼠皮肤、肝、肾、胃、睾丸生物组织材料用4%PFA固定1小时；

3）冰冻切片制作

a.用液氮冰冻并用OCT包埋生物样品；

b.用冰冻切片机在-20℃下将包埋样品切成5-10μL薄片制成冰冻切片；

c.将贴有样品的玻片在37℃烘干1h；

4）封闭

切片烘干后，冷却至室温，在卧式染缸中用PBS将玻片洗3次，每次10min；用5%的奶粉（溶于PBS）在室温下封闭1h；

5）DBP单克隆抗体结合DBP

a. PBS冲洗玻片数次，洗去牛奶;

b.加入DBP单克隆抗体孵育（1：100稀释DBP单克隆抗体，1%奶粉，溶于PBS中，每片加200μL），4℃孵育过夜;

c.取出玻片，放入卧式染缸用PBST（PBS+0.1%Tween-20）在摇床上洗5次。每次10min;

d.再用PBS在摇床上洗3次，每次10min;

6） 二抗标记DBP单克隆抗体

a.加入二抗和PI孵育液（1:100稀释FITC-标记羊抗鼠血清，10μg/ml PI，2%正常羊血清，溶于PBS）黑暗中室温孵育1h;

b.取出玻片，放入卧式染缸用PBS在摇床上洗6次，每次10min;

7) 封片

用抗淬灭剂封片;

8)用Leica 激光共聚焦显微镜观察并拍照

比较分析各样品DBP含量时，显微镜的波长等参数应一致。

9） 图像软件分析荧光强度

使用IPP软件分析荧光强度的操作步骤

a. 双击IPP，下拉菜单“File（横1）”，用“Open”打开图形文件；

b. 左键单击下拉菜单“Edit（横2）”，用“Convert To”，选取“Gray Scale 8”，使图形文件灰化；

c. 左键单击下拉菜单“Enhance（横5）”，用“Invert Image”，使图形文件反色，生成文件“untitled001”；

d. 左键单击“照相机”图标（下排倒数第8个图标），生成拷贝文件“untitled002”

e. 左键单击下拉菜单“Edit（横2）”，用“Convert To”，选取“Gray Scale 8”，使图形文件再次灰化，出现“untitled003”；

f. 左键单击下拉菜单“Measure（横7）”，用“Calibration”，选取“intensity”，对图形文件进行校正；

g. 对“校正对话框”最小化；

h. 左键单击下拉菜单“Measure（横7）”，用左键单击“Count/Size”，跳出“Count/Size对话框”；

i. 左键单击“Count/Size对话框”中的“Select Colors…”，跳出“Segmentation对话框”；

j. 左键单击“Segmentation对话框”中的“Histogram Based”，将红色/或绿色调整合适的程度（很重要，例如将3x3后面的下限调至0；上限调至240）；下图为“肝脏_DBP”图片。

k. 左键单击“Segmentation对话框”中的“Close”按钮，关闭“Segmentation对话框”；

l. 回到“Count/Size对话框”，左键单击“Count”按钮，等一会，“untitled003”文件部分变红；

m. 在“Count/Size对话框”中，左键单击“View”，在下拉菜单中选择“Statistics”，

n. 自动跳出统计结果“Statistics表格/对话框”；

o. 在“Statistics表格/对话框”中，左键单击“File”，然后单击“Export Data”，输出“Excel”数据表。

p. 以以相对的IOD SUM作为DBP的相对含量。

Claims (2)

1.一种检测生物体内邻苯二甲酸二丁酯相对含量的方法，其特征在于：

（1）利用DBP结构类似物4-氨基邻苯二甲酸二丁酯作为半抗原连接载体蛋白OVA而制得人工抗原，用该人工抗原免疫小鼠所得脾细胞和瘤细胞杂交融合，而筛选得到能稳定分泌DBP单克隆抗体的细胞株，通过小鼠腹水法大量制备DBP单克隆抗体；

（2）取待测生物组织样品制成冰冻切片，用（1）所得DBP单克隆抗体与生物组织样品中的DBP结合，再通过荧光二抗标示DBP的分布；

（3）通过图像分析软件分析荧光强度，从单位面积荧光值计算DBP的相对含量。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）用人工抗原DBAP-OVA免疫小鼠，取免疫小鼠脾细胞与瘤细胞融合，筛选出阳性杂交瘤细胞并克隆化，通过小鼠腹水法大量制备单克隆抗体，再通过硫酸铵沉淀法纯化DBP单克隆抗体；

2）抗体效价检测；

3）载玻片预处理：将载玻片用王水浸泡过夜，大量流水冲洗干净并晾干，再在DEPC水配制的多聚赖氨酸溶液中浸泡30min，室温晾干备用；

4）生物组织材料切片和封闭：取待测生物组织样品用4%PFA固定1小时，再用液氮冰冻并用OCT包埋样品，用冰冻切片机在-20℃下将包埋样品切成5-10μL薄片，将冰冻切片贴于载玻片上在37℃烘干1h，冷却至室温，在卧式染缸中用PBS将载玻片洗3次，每次10min；用5%的溶于PBS的奶粉在室温下封闭1h；

5）DBP单克隆抗体结合DBP：用PBS冲洗载玻片洗去牛奶，加入DBP单克隆抗体孵育，每片加200μL 1%溶于PBS的奶粉，按1：100比例稀释DBP单克隆抗体，4℃孵育过夜;取出玻片，放入卧式染缸用PBST（PBS+0.1%Tween-20）在摇床上洗5次,每次10min;再用PBS在摇床上洗3次，每次10min;

6）二抗标记DBP单克隆抗体：加入二抗和PI孵育液（1:100稀释FITC-标记羊抗鼠血清，10μg/ml PI，2%正常羊血清，溶于PBS）黑暗中室温孵育1h;取出玻片，放入卧式染缸用PBS在摇床上洗6次，每次10min;

7）用抗淬灭剂封片，用激光共聚焦显微镜观察并拍照，使用图像软件分析荧光强度，从单位面积荧光值计算DBP的相对含量。

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