CN102943066A

CN102943066A - 一种人载脂蛋白b100单克隆抗体及其化学发光免疫分析测定试剂盒

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Publication number: CN102943066A
Application number: CN2012103103725A
Authority: CN
Inventors: 蓝兴国; 李玉花; 张晓磊; 李春雷; 冯玥
Original assignee: DAQING BIOLOGICAL TECHNOLOGY RESEARCH INSTITUTE OF NORTHEAST FORESTRY UNIVERSITY; DAQING MABCOM BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: DAQING BIOLOGICAL TECHNOLOGY RESEARCH INSTITUTE OF NORTHEAST FORESTRY UNIVERSITY; DAQING MABCOM BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2012-03-13
Filing date: 2012-08-23
Publication date: 2013-02-27
Anticipated expiration: 2032-08-23
Also published as: CN102943066B

Abstract

本发明提供了一种人载脂蛋白B₁₀₀(ApoBl00)化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法。特别地，本发明提供了一种特异性识别人ApoB100的单克隆抗体，产生该单克隆抗体的杂交瘤，以及使用该单克隆抗体检测人ApoB100的高灵敏度的方法。本发明的试剂盒具有灵敏度高，检测范围宽，操作方便，同时生产成本低等特点。

Description

一种人载脂蛋白B100单克隆抗体及其化学发光免疫分析测定试剂盒

【技术领域】

本发明涉及识别人载脂蛋白B₁₀₀(Apo B₁₀₀)的单克隆抗体，产生该单克隆抗体的杂交瘤，学发光免疫分析定量测定(CLIA)试剂盒及其制备方法，本发明属于生物技术领域。

【背景技术】

心脑血管疾病是一种严重威胁人类，特别是50岁以上中老年人健康的常见病，全世界每年死于心脑血管疾病的人数高达1500万人，居各种死因首位。心脑血管疾病具有“发病率高、致残率高、死亡率高、复发率高，并发症多”即“四高一多”的特点，目前，我国心脑血管疾病患者已经超过2.7亿人！每年死于心脑血管疾病近300万人，占我国每年总死亡病因的51％。而幸存下来的患者75％不同程度丧失劳动能力，心脑血管疾病已成为人类死亡病因最高的头号杀手！

载脂蛋白B(Apolipoprotein B，Apo B)是血浆脂蛋白中蛋白质的一种，根据氨基酸组成和分布分为B100、B48、B74、B26和B50五种亚型。载脂蛋白B₁₀₀(Apo B₁₀₀)是低密度脂蛋白(Low density lipoprotein，LDL)、中密度脂蛋白(Intermediated density lipoprotein，IDL)和极低密度脂蛋白(Very low density lipoprotein，VLDL)颗粒上主要的载脂蛋白，由肝脏合成，含有4563个氨基酸残基，分子量约为510KDa。

ApoB作为动脉硬化、冠心病等的危险因子，其与动脉粥样硬化型心血管疾病之间有着密切关系，其功能之一是携带胆固醇，因此ApoB在血液中的含量可作为胆固醇等脂类的指标。患有急性心肌梗死、心脑疾病患者、动脉硬化症、高脂血症、糖尿病、慢性肾功能不全等疾病ApoB含量出现增高。

Apo B₁₀₀与载脂蛋白AI(Apolipoprotein AI)的比值(Apo B/AI)在临床上是心脑血管疾病检测的重要指标，与心肌梗塞、缺血性中风有紧密的联系，是微蛋白尿、糖尿病和新陈代谢综合症的独立风险因子。所以Apo B₁₀₀水平的检测对疾病的早期预测有一定的意义。

目前在临床实验室检测Apo B₁₀₀的方法主要是放射免疫分析(RIA)、免疫比浊法和酶联免疫吸附分析(ELISA)，其中RIA必须用放射性元素标记，检测设备复杂昂贵，其放射性元素的半衰期短，不能长期保存，检测结果不稳定，同时存在放射性污染也给实验操作人员带来了伤害；酶免疫分析法灵敏度低，影响因素较多，易造成假阴性和假阳性。

本发明是在酶联免疫分析的基础上应用酶催化发光底物，通过发光底物产生的光信号来代替酶联免疫分析中的显色底物，其灵敏度有很大的提高，本发明操作简便，适用性强，可同时大批量的检测，成本低，更易在临床诊断和实验室推广使用。

【发明内容】

本发明的目地是建立一种简单且具高灵敏度的检测ApoB₁₀₀的方法。并将该方法应用于人类心脑血管疾病的检测。本发明获得了能够产生特异性识别ApoB₁₀₀的单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞株4-3-2与杂交瘤细胞株4-6-3，该细胞株已于2012年3月6日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是，中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC C201209与CCTCC C201210。此外，经过鉴定，两珠单克隆抗体分别识别ApoB₁₀₀的两个不同表位，通过4-3-2与4-6-3的结合建立了夹心酶联免疫反应方法，提供一种人载脂蛋白B₁₀₀化学发光免疫分析测定试剂盒以及该试剂盒的制备方法。利用该试剂盒分析检测灵敏度高、特异性强。其是一种高灵敏度及高通量的检测系统。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

1.单克隆抗体的制备方法，具体包括以下步骤：

(1)用蛋白量为50ug的人ApoB₁₀₀与弗氏完全佐剂混合；经15天后进行第二次相同剂量与弗氏不完全佐剂混合免疫；再15天后进行第三次相同剂量与弗氏完全佐剂混合免疫；10天后尾部取血用间接ELISA方法测血清滴度，用相同剂量的纯抗原不加佐剂加强免疫；3天后取脾细胞进行融合；

(2)将免疫小白鼠脾细胞与小白鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)按5-10∶1的比例，用50％PEG作为融合剂融合；

(3)用含HAT(次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶)的无血清培养基，在37℃，5％ CO₂的细胞培养箱中培养10天，常规间接ELISA方法筛选阳性孔。

(4)筛选出的特异性强阳性孔用常规的有限稀释法克隆，获得单抗细胞株进一步扩大培养；

(5)收集培养上清液。亲和层析法纯化单克隆抗体，即为可专一识别人ApoB₁₀₀的抗体；

(6)检测单克隆抗体的滴度，选取较好的一株进行标记(例如HRP)，并对标记好的单克隆抗体进行滴度测定；

(7)标记好的单克隆抗体与其他未标记的单克隆抗体进行竞争ELISA反应，选取没有竞争的一株进行夹心ELISA反应，确定最佳条件。

2.人载脂蛋白B₁₀₀化学发光免疫分析测定试剂盒的建立：

本发明的人载脂蛋白B₁₀₀化学发光免疫分析测定试剂盒包括：人载脂蛋白B₁₀₀单克隆抗体包被的不透明聚苯乙烯板；人载脂蛋白B₁₀₀系列标准品；酶标记的人载脂蛋白B₁₀₀另一株单克隆抗体；酶作用的发光底物A液和B液；洗涤液等。本发明提供了一种制备上述试剂盒的方法，包括以下步骤：

(1)标准品的配制和浓度的校正

将人载脂蛋白B₁₀₀纯品，加入标准品稀释液，配制一高浓度标准品浓液，采用逐低稀释的方法稀释到各浓度，配制成0、10、40、100、300、600ng/ml的系列标准品，标准品用国家标准校正。

(2)包被

采用0.5mol/L，pH值为9.5的碳酸盐缓冲液与适当浓度的人载脂蛋白B₁₀₀单抗混合成抗体浓度是1μg/mL包被液，以100μL/孔包被在不透明的聚苯乙烯板上，4℃孵育过夜；

(3)洗板

用PBS-T洗液洗板孔2次；

(4)封闭

封闭液包含NaCl 8g，KCl 0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g，KH₂PO₄ 0.2g，蔗糖20.00g，proclin300 1.00ml，BSA 20.00g，封闭液的PH值为7.3-7.5，150μL/孔封闭，湿盒孵育2h；

(5)干燥

去除封闭液，过夜干燥。

(6)组装为成品

将聚苯乙烯板子放入铝箔袋中并放入干燥剂，密封保存。

本发明的单克隆抗体可直接用于检测样品中的人ApoB₁₀₀含量，通过大量培养单抗细胞株，即可获得大量的单克隆抗体，与多克隆抗体相比，具有纯度高，专一性强、重复性好等优点。

本发明针对临床实验室建立了一种既可以手工操作，又可以用于标准全自动检测仪器的检测手段，建立了检测人血清ApoB₁₀₀的定量检测方法。本发明的人载脂蛋白B₁₀₀定量检测试剂盒(CLIA)可以专一的检测出人血清中的ApoB₁₀₀的含量，具有简便、快速、灵敏、稳定的优点。本发明的试剂盒，包被的抗体与酶标记的抗体及被测样品中的人载脂蛋白B₁₀₀形成“包被抗体-抗原-抗体-酶”的夹心复合物结构，所以本发明采用的是“双抗夹心法”的反应模式。应用酶催化发光底物，通过检测发光底物产生的光信号代替酶联免疫分析中的显色底物，因而具有与酶联免疫分析同等的特异性，而灵敏度大大提高，比现今的酶联免疫吸附分析灵敏度提高约10倍，可为疾病的诊断提供更为特异、快速、可靠的依据。

本发明的试剂盒检测方法，具有灵敏度高，检测范围宽，操作方便、对实验人员无伤害，同时生产成本低，减轻了医患双方的负担，因此更有利于临床诊断的推广使用。

下文将就本发明通过下述实施方案给出更为具体的说明。

【附图说明】

图1是实施例二所制备的试剂盒的标准品线形图；

图2显示的是本发明中的杂交瘤所产生的抗-ApoB₁₀₀单克隆抗体在ELISA方法中滴度测量结果；

图3显示的是标记HRP的抗ApoB₁₀₀单克隆抗体滴度测量结果；

图4显示的是法夹心ELISA(S-ELISA)系统的检测灵敏度。

【具体实施方式】

实施例1：杂交瘤的制备

1.小鼠的免疫：免疫动物为8周龄大小的雄性Balb/C小白鼠，用蛋白量为50ug的人ApoB100与弗氏完全佐剂混合完全乳化后，采取背部多点，及腋下、腹股沟免疫；经15天后进行第二次相同剂量与弗氏不完全佐剂混合免疫；再15天后进行第三次相同剂量与弗氏完全佐剂混合免疫；10天后尾部取血用间接ELISA方法测血清滴度，用相同剂量的纯抗原不加佐剂加强免疫；3天后取脾细胞进行融合；

2.细胞融合：取处于对数生长期的Sp2/0细胞与脾细胞1∶10混和，通过聚乙二醇(PEG)法以获得杂交瘤细胞，命名为4-3-2和4-6-3。所获得的杂交瘤细胞悬浮在含有饲养细胞的HAT培养基中，然后加入到96孔板中，在37℃，5％CO₂的培养箱中封闭培养12天；

实施例2：单克隆抗体的筛选

从培养实施例1中所获得的杂交瘤细胞的孔格中回收培养基的上清液，选取在ELISA方法中与抗原多肽反应的单克隆抗体。

首先，将100uL浓度为0.2ug/ml的人ApoB₁₀₀到96孔板的每个孔格中，于4℃过夜后使其固定于固相，然后用150uL浓度为1％的牛血清白蛋白进行封闭2小时。将100uL杂交瘤细胞的培养基上清液加入到每个孔格中，于37℃反应2小时，然后加入稀释10000倍的辣根过氧化物酶偶联的抗-小鼠抗体于37℃反应1小时。使用四甲基联苯胺微孔过氧化物酶底物(TMB)作为底物进行显色。添加50uL浓度为0.2N的硫酸终止反应后，测量450的吸光度，选出吸光度大约为3的2C6及3E8，并通过有限稀释法进行亚克隆。

将亚克隆后的细胞用细胞培养转瓶进行扩大培养，约20天后，收集上清，用葡萄球菌A蛋白(Protein A)进行亲和层析纯化。

所选的两种mAb的滴度通过ELISA方法来测定。加入4-3-2或者4-6-3(10ug/mL)，在反应后，使用辣根过氧化物酶偶联的抗-小鼠抗体与TMB进行显色。结果如图1所示两种mAbs效价达到10^-9以上。

实施例3：单克隆抗体的标记

取单克隆抗体4-6-3按常规方法进行HRP标记。标记好的单克隆抗体的滴度通过下面的方法测定。将浓度为0.2ug/ml的人ApoB₁₀₀固定在96孔微板上(100uL/孔)。使用1％的牛血清白蛋白进行封闭2小时，加标记的单克隆抗(第一孔稀释100倍)，从第二孔开始做4倍稀释，于室温下反应2小时。添加TMB后，反应在室温下进行20分钟，用0.2N的硫酸中止反应。测量在450nm的吸光度，按实施例2中的方式获得针对固定在固相中的抗原的滴度。结果表明具有有效的滴度(图2)。

实施例4：夹心ELISA系统的建立

使用实施例2和3中的单克隆抗体构建了一个ELISA系统。0.5ug/ml的单克隆抗体4-3-2以100uL/孔的量加到微孔板土，于4℃孵育24小时固定于固相。孔格使用含有0.1％Tween 20的pH值为7.4的20mM PBS(PBST)以200uL/孔的量洗3次。以150uL/孔的量加入1％牛血清白蛋白进行封闭2小时。孔格用PBST以200uL/孔的量洗3次，加入由起始浓度10ug/ml连续4倍稀释的人ApoB₁₀₀，于室温温育2小时，然后加入标记HRP的4-6-3(1：3K；100uL/孔)并于室温温育2小时。添加TMB后，反应在室温下进行20分钟，加入0.2N的硫酸来中止反应并测量450nm的吸光度。结果表明检测的灵敏度很高(0.2～100ng/m1)(图3)

实施例5：制备本发明的人载脂蛋白B₁₀₀定量测定试剂盒(化学发光法)

(一)酶标抗体工作液的配制

(1)酶标稀释液的配制

按照标准配方准确称取三羟甲基氨基甲烷7.27g，加工艺用水800.0ml，搅拌使充分溶解后，加入浓盐酸适量，搅拌均匀，使用数显酸度计测量液体的pH值为7.1～7.3，再将称量好的其他配方组分依次加入上述溶液中，充分搅拌溶解后，定容至1200.0ml，过滤除菌，2～8℃保存备用。

检验合格的酶结合物缓冲液按照所用抗体的稀释比例添加抗-ApoB₁₀₀-HRP，顺时钟方向搅拌30分钟充分混合均匀后2～8℃保存备用。

(2)酶标抗体工作液的配制

经实施例3证明，酶标抗体的最佳工作浓度是1∶3000，用(1)所述的稀释液将酶标抗体稀释到所需要的工作浓度。

(二)标准品的配制

按照标准配方内容准确称取上述各组分，加入工艺用水800.0ml搅拌充分溶解后，使用数显酸度计测量液体的pH值应为7.1～7.3，用工艺用水定容至1000.0ml，混合均匀，将人载脂蛋白B₁₀₀纯品，加入标准品稀释液，配制一高浓度标准品浓液，采用逐低稀释的方法稀释到各浓度，配制成0、10、40、100、300、600ng/ml的系列标准品，2～8℃保存备用。检验合格的APOB₁₀₀标准品分装时，0.5ml/瓶，有效期18个月。

(三)包被

(1)将0.05mol/L，pH 9.5的碳酸盐溶液和适当浓度的人载脂蛋白B₁₀₀单克隆抗体混合制成包被液，将其包被于聚苯乙烯板上，4℃过夜：

(2)洗涤：用PBS-T洗液洗板孔2次；

(3)封闭：

封闭液的配制：

按照标准配方内容准确称取上述各组分，搅拌均匀，使用数显酸度计测量液体的pH值为7.3～7.5，再将称量好的其他配方组分依次加入上述溶液中，充分搅拌溶解后，定容至1000.0ml，2～8℃保存备用，有效期15天。使用时每孔加入150μL，湿盒孵育2h，甩掉封闭液，在干净的吸水纸上拍干；

(4)干燥：将聚苯乙烯板放置在干燥间过夜；

(5)真空封袋，贴签后置2-8℃保存。

(四)化学发光底物液

本发明所使用的辣根过氧化酶(HRP)的化学发光底物液的配制方法：

(1)化学发光底物A的配制方法：

准确称取上述各组分，加入工艺用水600.0ml，搅拌充分溶解后定容至700.0ml，测定溶液的pH应为9.1～9.4，2～8℃避光保存备用。

按检验合格后按96人份：6.0ml/瓶分装，有效期18个月。

(2)化学发光底物B的配制方法：

准确称取上述各组分，加入工艺用水600.0ml，搅拌充分溶解后定容至700.0ml，测定溶液的pH应为9.1～9.4，2～8℃保存备用。

检验合格后按96人份：6.0ml/瓶分装，有效期18个月。

使用方法：使用前将A液和B液按1∶1比例混合使用。

(五)洗涤液

准确称取上述各组分，加入工艺用水800.0ml，搅拌充分溶解后，定容至1000.0ml，测定溶液的pH应为7.1～7.4，室温保存备用。

检验合格后按照96人份，30.0ml/瓶分装，有效期18个月。

(六)半成品及成品的组成

上述步骤所得的各种半成品组成及产品说明书等各种附件组成ApoB₁₀₀定量测定试剂盒(化学发光法).

试剂盒中的固相抗体是提前包被好的，不需要现场包被，使用方便且节时；校准品是液体；酶标记物是已经稀释到工作浓度的液体，也可以直接使用。

实施例6：人载脂蛋白B₁₀₀定量测定试剂盒(CLIA)操作方法如下：

(一)样品准备

标本无需特殊处理，采用常规医用技术收集全血标本，离心分离后吸取血清用于检测，待测血清如在24小时之内使用，可于2-8℃保存，若需长期存放应保存在-20℃以下，并避免反复冻融。

操作方法：

1、将所需要量的已包被的板条放置在支架上；

2、在包被孔中分别加入10μL的标准品和血样

3、每孔加入100μL的酶标记物，稍微振荡使其混合均匀；湿盒孵育1h；

4、弃去孔内液体，用稀释后的洗涤液，自动洗板机或者手工洗板4次，在干净的吸水纸上拍干；

5、将发光底物A、B等比例混合至本次所用的体积，每孔加入混合后的发光底物100μL，稍微振荡使其混合均匀，避光室温反应2min，

6、化学发光仪检测相对发光值(RLU)，测量时间是0.1-1秒/孔。

7、分别对标准品浓度和相对发光值(RLU)取值，建立标准曲线(参见附图4)，以待测血清RLU的值在标准曲线查出血清中ApoB₁₀₀的浓度值，计算检测结果。

8、统计分析检测结果

以本发明的上述试剂盒按照上述步骤进行测定所用的时间短、仅需要一个多小时就可全部完成，方便快速。

实施例7：本发明的试剂盒测定时的方法学指标如下：

1、检测范围：0-600ng/ml；

2、灵敏度：最小检出限是0.5ng/ml；

3、精密度：分析内精密度(检测低、中、高三组样品(n＝10)均小于5％，分析间的精密度(检测低、中、高三组样品(n＝10)均小于15％，高于国家标准，说明本发明的试剂盒在检测试验中具有良好的重复性；

4、线性：R≥0.99；

本发明的试剂盒所用的血清量少，只需要10μL，体外检测对患者没有任何的副作用；同时本发明用的是化学发光免疫分析方法，各项指标也优于酶联免疫吸附分析方法(ELISA)，因此本发明为临床检测ApoB₁₀₀提供了一种更简便、快速、准确的方法，能满足临床上的需求。

实施例8：本发明的试剂盒临床血样测值比较：

取用医院临床收集病人血清标本50份，用本发明的试剂盒进行临床检测，其测值如下：

标记	计算浓度	标准品浓度	相对发光值
				S0	0.00	0.00	100856
S1	9.68	10.00	677680
				S2	41.21	40.00	1336317
S3	99.35	100.00	3485334
				S4	301.192	300.00	8656840
S5	599.04	600.00	15224010

首先对上表中标准品浓度和相对发光值(RLU)取对数值，建立标准曲线，标准曲线相关系数R值是0.99，并以待测血清RLU的值在标准曲线中查出血清中t-PSA的浓度值，统计分析检测结果，与临床病例比较，符合率达到99％。

综上所述，本发明的试剂盒具有操作简单、价格便宜、对患者无副作用、快速、准确率高等优点，更适于推广使用。

Claims

1.一种能产生特异性识别人ApoB100的单克隆抗体的杂交瘤，其保藏号分别为CCTCCC201209和CCTCC C201210，分别命名为4-3-2和4-6-3。

2.一种单克隆抗体，它可以识别由权利要求1所述的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体所识别的表位，并特异性地识别ApoB100。

3.一种体外特异性检测样品中ApoB100的方法，其特征在于使用权利要求2所述的单克隆抗体。

4.一种人载脂蛋白B₁₀₀化学发光免疫分析测定试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

1)人载脂蛋白B₁₀₀校准品；

2)包被有人载脂蛋白B₁₀₀单克隆抗体的固相载体；

3)辣根过氧化物酶标记的人载脂蛋白B₁₀₀单克隆抗体；

4)上述酶所作用的化学发光底物。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述固相载体为不透明的聚苯乙烯板。

6.如权利要求4所述的试剂盒其特征在于，所述化学发光底物为鲁米诺或鲁米诺的衍生物。

7.一种制备权利要求4所述试剂盒的方法，其特征在于包括以下步骤：

1)以人载脂蛋白B₁₀₀纯品配制人载脂蛋白B₁₀₀校准品；

2)以人载脂蛋白B₁₀₀单克隆抗体包被固相载体；

3)以辣根过氧化物酶标记人载脂蛋白B₁₀₀单克隆抗体；

4)配制化学发光底物；

5)分装上述人载脂蛋白B₁₀₀校准品、辣根过氧化物酶标记的人载脂蛋白B₁₀₀单克隆抗体和该酶所作用的化学发光底物；

6)组装为成品。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述包被固相载体的步骤采用以下方法：

1)包被

采用0.5mol/L，pH值为9.5的碳酸盐缓冲液与适当浓度的人载脂蛋白B₁₀₀单抗混合成抗体浓度是1μg/mL包被液，以100μL/孔包被在不透明的聚苯乙烯板上；

2)用PBS-T洗液洗板；

3)封闭

封闭液包含NaCl 8g，KCl 0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g，KH₂PO₄ 0.2g，蔗糖20.00g，proclin300 1.00ml，BSA 20.00g，封闭液的PH值为7.3-7.5，150μL/孔封闭，湿盒孵育2h。

9.如权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述固相栽体为不透明的聚苯乙烯板。

10.如权利要求4-9所述的方法，其特征在于，所述化学发光底物为鲁米诺或鲁米诺的衍生物。