CN111157744A - 一种载脂蛋白b检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种载脂蛋白B检测试剂盒,涉及生物医药技术领域,包括第一试剂,第一试剂包括第一缓冲液以及R‑1试剂,第一缓冲液包括如下成分:2‑4g/L的三羟甲基氨基甲烷、0.8‑1.2g/L的Proclin150、0.8‑1.2g/L的吐温80、8‑10g/L的叠氮钠,所述R‑1试剂包括如下成分:53‑57g/L的聚乙二醇、0.8‑1.2ml/L的曲拉通‑100,本发明提供一种改进型的载脂蛋白B检测试剂盒,灵敏度更高、重复性更好、准确性更高、稳定性更好。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域,更具体地说,它涉及一种载脂蛋白B检测试剂盒。
背景技术
载脂蛋白B是LDL颗粒中惟一的蛋白质成分。在正常血浆中存在两种APOB,即APOBl00和APOB48。APOBl00主要由肝脏合成,在VLDL的组装和分泌中起重要作用,APOBl00有以下四种主要功能:①合成、装配和分泌三酰甘油丰富的脂蛋白VLDL;②它可与脂质结合,是VLDL的结构蛋白;③与肝素及不同的糖蛋白结合,参与LDL与动脉粥样斑块的相互作用;④与LDL受体结合,调节LDL从血浆中的清除。载脂蛋白B是临床检验中常用的检测项目,被应用于冠心病、高血压、急性心肌梗死的诊断、治疗及监护,具有非常重要的临床意义。
由于载脂蛋白B的含量较低,其测定方法需要较高的灵敏度和特异性。临床上主要有免疫透射比浊法、免疫散射比浊法和免疫印迹法的检测。目前,免疫透射比浊法是最为普遍通用的方法,但是免疫透射比浊法存在灵敏度,精密度、准确性、线性范围等方面的问题,在临床应用上存在着差异性,因此,存在待改进之处。
发明内容
针对现有技术中所存在的不足,本发明目的在于提出一种载脂蛋白B检测试剂盒,具体方案如下:
一种载脂蛋白B检测试剂盒,包括第一试剂,所述第一试剂包括第一缓冲液以及R-1试剂,所述第一缓冲液包括如下成分:2-4g/L的三羟甲基氨基甲烷、0.8-1.2g/L的Proclin150、0.8-1.2g/L的吐温80、8-10g/L的叠氮钠,所述R-1试剂包括如下成分:53-57g/L的聚乙二醇、0.8-1.2ml/L的曲拉通-100。
进一步的,所述三羟甲基氨基甲烷、Proclin150、吐温80、叠氮钠在所述第一试剂中的含量分别为:3g/L、1g/L、1g/L、9g/L,所述聚乙二醇、曲拉通-100在所述第一试剂中的含量分别为:55g/L、1ml/L。
进一步的,还包括第二试剂,所述第二试剂包括第二缓冲液以及R-2试剂,所述第二缓冲液包括如下成分:2-4g/L的三羟甲基氨基甲烷、0.8-1.2g/L的Proclin150、0.8-1.2g/的吐温80、8-10g/L的叠氮钠、53-57g/L的聚乙二醇,所述R-2试剂包括如下成分:0.123-0.127L/L的抗APOB血清。
进一步的,所述三羟甲基氨基甲烷、Proclin150、吐温80、叠氮钠、聚乙二醇在所述第二试剂中的含量分别为:3g/L、1g/L、1g/L、9g/L、55g/L,所述抗APOB血清在所述第二试剂中的含量为0.125L/L。
进一步的,所述第一试剂的制作规程包括如下步骤:
S1:称量所述第一缓冲液、R-1试剂中的对应成分,
S2:于容器内加水0.8L,加入称量好的三羟甲基氨基甲烷,用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解,加入称量好的Proclin150,用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解,搅拌加入称量好的吐温80,用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解,加入称量好的叠氮钠,用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解,
S3:对所述S2中的溶液调整PH值至7.5,补充去离子水至1L,
S4:于容器内加第一缓冲液0.8L,用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解,加入称量好的聚乙二醇,用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解,加入称量好的曲拉通-100,用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解,
S5:对所述S4的溶液调整PH值至7.5,补充第一缓冲液至1L。
进一步的,在第一试剂的制作规程的所述S2中,搅拌时间为27-33min。
进一步的,所述第二试剂的制作规程包括如下步骤:
S1:称量所述第二缓冲液、R-2试剂中的对应成分,
S2:于容器内加水0.8L,加入称量好的三羟甲基氨基甲烷,用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解,加入称量好的Proclin150,用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解,搅拌加入称量好的吐温80,用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解,加入称量好的叠氮钠,用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解,加入称量好的聚乙二醇,用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解,
S3:对所述S2中的溶液调整PH值至7.5,补充去离子水定容至1L,
S4:于容器内加入第一缓冲液0.25L,用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解,加入称量好的抗APOB血清,用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解,加入第二缓冲液0.5L,用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解,加入第一缓冲液0.125L,用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解,补充去离子水定容至1L。
进一步的,在第二试剂的制作规程的所述S4中,对定容后的溶液用磁力搅拌器2-3档搅拌2h。
与现有技术相比,本发明的有益效果如下:
本发明提供一种改进型的载脂蛋白B检测试剂盒,灵敏度更高、重复性更好、准确性更高、稳定性更好,叠氮钠作为防腐剂,提高第一试剂、第二试剂的使用时间,使得载脂蛋白B检测试剂盒可以长时间使用,满足临床实际需要。
具体实施方式
下面结合实施例及对本发明作进一步的详细说明,但本发明的实施方式不仅限于此。
制备例
1、主要材料以及仪器
第一试剂:三羟甲基氨基甲烷、Proclin150、吐温80、的叠氮钠,聚乙二醇、曲拉通-100。
第二试剂:三羟甲基氨基甲烷、Proclin150、吐温80、的叠氮钠,聚乙二醇、抗APOB血清。
仪器:AL104精密电子天平:灵敏度0.1mg,用于称量工序;
TC30K型精密电子天平:灵敏度10mg,用于称量工序;
T1000Y型电子天平:灵敏度10mg,用于称量工序;
磁力搅拌器:99-1型,用于溶解工序。
精密酸度计:FE20,用于PH工序。
电子秤:灵敏度20g,用于定容工序。
玻璃烧杯等玻璃器皿;
定量加量器:1ml、100-1000ul、20-200ul;
移液管:10ml、5ml。
2、制备步骤
2.1第一试剂的制作规程
S1:使用AL104精密电子天平、TC30K型精密电子天平、T1000Y型电子天平、定量加量器或者移液管称量第一缓冲液的对应成分以及取用R-1试剂中的对应成分,3g的三羟甲基氨基甲烷、1g的Proclin150、1g的吐温80、9g的叠氮钠、55g的聚乙二醇、1ml的曲拉通-100。
S2:于容器内加水0.8L,加入称量好的三羟甲基氨基甲烷,用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解,加入称量好的Proclin150,用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解,搅拌加入称量好的吐温80,用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解,加入称量好的叠氮钠,用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解,搅拌时间为27-33min。
S3:对S2中的溶液调整PH值至7.5,补充去离子水至1L,
S4:于容器内加第一缓冲液0.8L,用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解,加入称量好的聚乙二醇,用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解,加入称量好的曲拉通-100,用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解,
S5:对S4的溶液调整PH值至7.5,补充第一缓冲液至1L。
2.2第二试剂的制作规程
S1:使用AL104精密电子天平、TC30K型精密电子天平、T1000Y型电子天平、定量加量器或者移液管称量第二缓冲液、R-2试剂中的对应成分,3g的三羟甲基氨基甲烷、1g的Proclin150、1g的吐温80、9g的叠氮钠、55g的聚乙二醇、0.125L的抗APOB血清。
S2:于容器内加水0.8L,加入称量好的三羟甲基氨基甲烷,用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解,加入称量好的Proclin150,用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解,搅拌加入称量好的吐温80,用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解,加入称量好的叠氮钠,用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解,加入称量好的聚乙二醇,用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解,
S3:对S2中的溶液调整PH值至7.5,补充去离子水定容至1L,
S4:于容器内加入第一缓冲液0.25L,用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解,加入称量好的抗APOB血清,用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解,加入第二缓冲液0.5L,用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解,加入第一缓冲液0.125L,用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解,补充去离子水定容至1L,对定容后的溶液用磁力搅拌器2-3档搅拌2h。
实施例
3、性能测试
3.1APOB试剂盒批号和规格
分别制作不同批次的前述的制备例中的试剂盒,根据批次命名,分别为样品1、样品2、样品3,本产品共有8种包装规格,只是大小包装不同,对性能评估结果没有影响,因此只对其中一种最常用规格进行了测定,规格采用60ml(第一试剂:1×45ml,第二试剂:1×15ml)。第一试剂和第二试剂为透明液体,不得有沉淀和絮状物。
3.2校准品和质控品
用于性能评估的校准品:上海科华校准品,Lot:20141112,标示值:0.50、0.85、1.22、2.06g/L;
用于准确度性能评估的参考物质:Cobas-C.f.a.s.Lipids,Lot:174327,标示值:1.27g/L;
质控品为:BIO-RAD公司Liquichek Lipids Control,Lot:57281,target:0.862g/L,range:0.689-1.03g/L;Lot:57282,target:1.42g/L,range:1.14-1.71g/L。
3.3实验仪器以及原理
实验仪器:西门子1200型全自动生化分析仪。
实验原理:血清中的ApoB与试剂中特异性的ApoB抗体结合,形成抗原抗体复合物而产生浊度,其浊度高低与血清中ApoB成正比。通过测定特定波长的吸光度值,参照校准曲线即可计算出血清中ApoB的含量。
3.4试剂空白检测
产品技术要求:
试剂空白吸光度:A340nm(1.0cm)≤0.3
用纯水测试样品1、样品2、样品3在主波长340nm下,记录测试启动时的吸光度(A1)和约5分钟(T)后的吸光度(A2),A2测试结果即为试剂空白吸光度测定值,实验结果如下表:
结论:样品1、样品2、样品3的试剂空白吸光度测定值范围为1.1288-0.1441,实验结果符合试剂空白吸光度:A340nm(1.0cm)≤0.3。
3.5灵敏度检测
用已知浓度的人血样品分别测试样品1、样品2、样品3中的试剂盒,记录在试剂盒规定参数下产生的吸光度变化,本试验测定1.16g/L样品,吸光度变化要求>0.4A,
采用样品1、样品2、样品3中第一试剂和第二试剂检测人血样品的方法简述如下:
1、将溶解的第一试剂加入待测样品中;
2、加入溶解的第二试剂;
3、测定溶液中在340nm波长处比色,得到吸光度。
实验结果如下:
结论:样品1、样品2、样品3的APOB试剂盒分别在西门子1200生化仪测定,吸光度变化要求均大于0.4A。
3、6线性范围
用接近线性范围上限的高浓度样品和接近线性范围下限的低浓度样品,混合成6个稀释浓度(xi)。分别测试试剂盒,每个稀释度测试3次,分别求测定均值(yi)。以稀释浓度(xi)为自变量,以测定均值(yi)为因变量求出线性回归方程及相关系数(r)。按如下公式计算相关系数(r)。
用上述方法中稀释浓度xi代入线性回归方程,计算yi的估算值与yi的线性偏差,应符合如下产品技术要求的规定。
产品技术要求:
要求试剂盒在样本浓度0.30g/L~2.00g/L范围内,整个反应呈线性,r≥0.990,线性相对偏差<±15%。
实验结果如下:
结论:样品1、样品2、样品3的APOB试剂盒分别在西门子1200生化仪测定,实验结果表明在0.30g/L~2.00g/L测定范围内,线性误差均未出现线性异常状况,所有R2值均大于行业普遍认可的0.990的标准,线性相对偏差均<±15%。
3.7精密度检测
在重现性条件下,用前述的质控品测试样品1、样品2、样品3的试剂盒,测试10次,分别计算测量值的平均值和标准差,按以下公式计算变异系数(CV),应符合产品技术要求。
产品技术要求:
批内精密度:CV≤5.0%
实验结果如下:
结论:在高低两个不同浓度水平的质控血清测试下,使用西门子1200生化分析仪测得的批内不精密度均小于5%,可见,本发明的试剂盒测试结果准确高,具有临床参考价值。
产品技术要求:
批间相对偏差≤8.0%
实验结果如下:
结论:用质控品分别测试样品1、样品2、样品3的试剂盒,使用西门子1200生化分析仪测得的批间相对偏差小于8%,本发明的试剂盒的试剂间以及生产方法具有稳定性,使本发明的试剂盒能够得到稳定的结果,且结果的准确性高,具有重要的临床参考价值。
3.8准确度检测
测定APOB Cobas-C.f.a.s.Lipids 3次,计算3次结果平均值,按如下公式计算相对偏差,结果应符合产品技术要求:
产品技术要求:与有证参考物质的相对偏差不超过±15%。
实验结果如下:
结论:使用西门子1200生化分析仪测得的相对偏差均小于±15%,本发明的试剂盒的检测结果具有较高的准确性。
综上所述,本发明实施例部分采用大量的试验证明本发明试剂盒的产品性能,载脂蛋白B检测试剂盒(免疫比浊法)在西门子1200型全自动生化仪上检测试剂空白、灵敏度、线性范围、重复性、批间差、准确度等各项指标,符合该产品拟定的产品技术要求,能够满足临床实际需要。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例,凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种载脂蛋白B检测试剂盒,其特征在于,包括第一试剂,所述第一试剂包括第一缓冲液以及R-1试剂,所述第一缓冲液包括如下成分:2-4g/L的三羟甲基氨基甲烷、0.8-1.2g/L的Proclin150、0.8-1.2g/L的吐温80、8-10g/L的叠氮钠,所述R-1试剂包括如下成分:53-57g/L的聚乙二醇、0.8-1.2ml/L的曲拉通-100。
2.根据权利要求1所述的载脂蛋白B检测试剂盒,其特征在于,所述三羟甲基氨基甲烷、Proclin150、吐温80、叠氮钠在所述第一试剂中的含量分别为:3g/L、1g/L、1g/L、9g/L,所述聚乙二醇、曲拉通-100在所述第一试剂中的含量分别为:55g/L、1ml/L。
3.根据权利要求1所述的载脂蛋白B检测试剂盒,其特征在于,还包括第二试剂,所述第二试剂包括第二缓冲液以及R-2试剂,所述第二缓冲液包括如下成分:2-4g/L的三羟甲基氨基甲烷、0.8-1.2g/L的Proclin150、0.8-1.2g/的吐温80、8-10g/L的叠氮钠、53-57g/L的聚乙二醇,所述R-2试剂包括如下成分:0.123-0.127L/L的抗APOB血清。
4.根据权利要求3所述的载脂蛋白B检测试剂盒,其特征在于,所述三羟甲基氨基甲烷、Proclin150、吐温80、叠氮钠、聚乙二醇在所述第二试剂中的含量分别为:3g/L、1g/L、1g/L、9g/L、55g/L,所述抗APOB血清在所述第二试剂中的含量为0.125L/L。
5.根据权利要求2所述的载脂蛋白B检测试剂盒,其特征在于,所述第一试剂的制作规程包括如下步骤:
S1:称量所述第一缓冲液、R-1试剂中的对应成分,
S2:于容器内加水0.8L,加入称量好的三羟甲基氨基甲烷,用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解,加入称量好的Proclin150,用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解,搅拌加入称量好的吐温80,用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解,加入称量好的叠氮钠,用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解,
S3:对所述S2中的溶液调整PH值至7.5,补充去离子水至1L,
S4:于容器内加第一缓冲液0.8L,用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解,加入称量好的聚乙二醇,用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解,加入称量好的曲拉通-100,用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解,
S5:对所述S4的溶液调整PH值至7.5,补充第一缓冲液至1L。
6.根据权利要求5所述的载脂蛋白B检测试剂盒,其特征在于,在第一试剂的制作规程的所述S2中,搅拌时间为27-33min。
7.根据权利要求3所述的载脂蛋白B检测试剂盒,其特征在于,所述第二试剂的制作规程包括如下步骤:
S1:称量所述第二缓冲液、R-2试剂中的对应成分,
S2:于容器内加水0.8L,加入称量好的三羟甲基氨基甲烷,用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解,加入称量好的Proclin150,用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解,搅拌加入称量好的吐温80,用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解,加入称量好的叠氮钠,用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解,加入称量好的聚乙二醇,用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解,
S3:对所述S2中的溶液调整PH值至7.5,补充去离子水定容至1L,
S4:于容器内加入第一缓冲液0.25L,用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解,加入称量好的抗APOB血清,用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解,加入第二缓冲液0.5L,用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解,加入第一缓冲液0.125L,用磁力搅拌器2-3档搅拌至溶解,补充去离子水定容至1L。
8.根据权利要求7所述的载脂蛋白B检测试剂盒,其特征在于,在第二试剂的制作规程的所述S4中,对定容后的溶液用磁力搅拌器2-3档搅拌2h。
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Title |
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山东省药品监督管理局: "山东博科生物产业有限公司载脂蛋白B检测试剂盒(免疫透射比浊法)(鲁械注准20172401144)换发公告", 《HTTP://MPA.SHANDONG.GOV.CN/ART/2017/11/16/ART_101753_7577604.HTML》 * |
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