CN109799356A - 一种测定高密度脂蛋白胆固醇的试剂盒及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种测定高密度脂蛋白胆固醇的试剂盒及方法；试剂盒包括第一试剂，第一试剂包括：MES、磷酸盐缓冲液、PEG6000、TODB、胆固醇氧化酶和过氧化物酶；方法包括以下步骤：1)按原料组分及含量分别溶解第一试剂和第二试剂；2)将溶解的第一试剂加入待测样品中；3)加入溶解的第二试剂；4)判断是否显色；本发明提供了精密度、准确性均较高且稳定的测定高密度脂蛋白胆固醇的试剂盒及方法。

Description

一种测定高密度脂蛋白胆固醇的试剂盒及方法

技术领域

本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种测定高密度脂蛋白胆固醇的试剂盒及方法。

背景技术

高密度脂蛋白与乳糜微粒、极低密度脂蛋白和低密度脂蛋白相比，高密度脂蛋白是密度最大的脂蛋白(d＝1.063～1.210kg/L)。其组分中蛋白质、磷脂、胆固醇和甘油三酯各约占50％、25％、20％和5％。高密度脂蛋白中主要是载脂蛋白AI和AII，胆固醇占总胆固醇的25％～35％，酯化胆固醇和游离胆固醇之比约为3∶1。HDL可通过酶和受体的作用，将周围组织的胆固醇移至肝脏降解处理，同时抑制细胞结合和摄取低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)，阻止胆固醇在动脉壁的沉积，故高密度脂蛋白被认为是AS的预防因子。

在众多的高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)检测试剂盒中，主要有以下几种方法： 1、直接法-选择抑制法：血清中乳糜微粒、低密度脂蛋白及极低密度脂蛋白在多聚阴离子及反应抑制剂作用下表面被遮蔽。HDL-C与表面活性剂、反应促进剂在胆固醇酶试剂作用下参与Trinder反应而显色，吸光度与标本中HDL-C浓度成正比；2、直接法-过氧化氢酶清除法：反应分两步进行，试剂1使HDL所含的胆固醇暴露，在胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶的催化反应下生成过氧化氢，过氧化氢被过氧化氢酶分解而被清除。试剂2中抑制了过氧化氢酶活性，另一表面活性剂使HDL颗粒中的胆固醇暴露，并与胆固醇酶试剂发生反应，通过Trinder反应可测定HDL-C；3、直接法-PEG修饰酶法：在镁离子的存在下，α-环糊精硫酸盐与CM、VLDL、LDL形成可溶性复合物。这些复合物能抵抗变构酶的作用；PEG6000或葡聚糖右旋糖苷与胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶共价结合，引起酶的变构，变构酶对脂蛋白的大小和/ 或电荷具有选择性，其顺序依次为LDL、VLDL、CM和HDL。而α-环糊精硫酸盐能限制CM、VLDL颗粒进入环状的环糊状结构，从而避免酶的催化作用，这种作用还与镁离子浓度有关。因此在镁离子及少量硫酸葡聚糖存在的前提下，通过Trinder 反应可测定HDL-C；直接法-抗体分离法：反应分两步进行，试剂Ⅰ中的抗人ApoB 脂蛋白抗体首先与血清中的CM、VLDL、LDL结合形成不溶性抗原-抗体复合物；加入试剂Ⅱ后，抗原-抗体复合物不与酶试剂起反应，只有HDL-C与酶试剂反应，生成过氧化氢，并通过Trinder反应可测定HDL-C含量。

但是，现有技术的4种方法中都存在着精密度、准确性、线性范围等方面的问题。

发明内容

针对上述技术问题，本发明提供了精密度、准确性均较高且稳定的测定高密度脂蛋白胆固醇的试剂盒及方法。

本发明的一个方面，提供了一种测定高密度脂蛋白胆固醇的试剂盒，包括第一试剂，所述第一试剂包括：MES、磷酸盐缓冲液、PEG6000、TODB、胆固醇氧化酶和过氧化物酶。

优选地，所述磷酸盐缓冲液在所述第一试剂中含量为0.3-0.5ml/L。

优选地，所述PEG6000在所述第一试剂中含量为0.03-0.06g/L。

优选地，还包括第二试剂，所述第二试剂包括：MES、磷酸盐缓冲液、4-氨基安替比林、胆固醇酯酶和叠氮钠。

优选地，所述磷酸盐缓冲液在所述第二试剂中含量为0.8-1.2％。

优选地，所述4-氨基安替比林在所述第二试剂中含量为0.5-2mmol/L。

本发明的第二个方面，提供了另一种测定高密度脂蛋白胆固醇的试剂盒，包括以下原料及含量：

第一试剂：20-25g/L MES、0.3-0.5ml/L磷酸盐缓冲液、0.03-0.06g/L PEG6000、0.1-0.3g/L TODB、900-1100U/L胆固醇氧化酶、1000-1300U/L过氧化物酶；

第二试剂：20-25g/L MES、0.3-0.5ml/L磷酸盐缓冲液、0.5-2mmol/L 4-氨基安替比林、1000-1500U/L胆固醇酯酶、0.8-1.2﹪叠氮钠。

进一步优选地，包括以下原料及含量：

第一试剂：21.3g/L MES、0.35ml/L磷酸盐缓冲液、0.042g/L PEG6000、0.2g/LTODB、1000U/L胆固醇氧化酶(20u/mg)、1200U/L过氧化物酶；

第二试剂：21.3g/L MES、0.35ml/L磷酸盐缓冲液、1mmol/L 4-氨基安替比林、1300U/L胆固醇酯酶(22.4u/mg)、1﹪叠氮钠。

本发明的第三个方面，提供了一种试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

1)按原料组分及含量分别溶解第一试剂和第二试剂；

2)将溶解的第一试剂加入待测样品中；

3)加入溶解的第二试剂；

4)判断是否显色。

优选地，所述第一试剂和所述第二试剂的溶解液的PH值为5.8-6.3。

本发明所述的MES为本领域常用的脂肪酸甲酯磺酸盐的缩写，TODB为本领域常用的二钠盐的缩写。

本发明的试剂盒原理包括以下内容：

1、第一试剂中磷酸盐缓冲液和PEG6000可以使HDL的胆固醇暴露，且磷酸盐缓冲液和PEG6000的相互配合，还能够促使后续的酶促反应的加速，使HDL的胆固醇暴露不受干扰、使试剂盒的灵敏度更高。

2、第二试剂中叠氮钠抑制了过氧化氢酶的活性，使过氧化氢、4-氨基安替比林反应显现紫红色，本发明采用叠氮钠作为过氧化氢酶的抑制剂是因为叠氮钠在磷酸盐缓冲液和PEG6000作为缓冲液和表面活性剂的条件下具有稳定清除过氧化氢酶而不影响其他酶促反应的特点，因此本发明的试剂盒在600nm吸光度为 0.0387-0.0443、产品稳定；更进一步，当叠氮钠的浓度为0.8-1.2﹪时，产品性能最佳，在本发明的体系中，叠氮钠的浓度小于0.8％时将无法全部清除过氧化氢酶，当叠氮钠的浓度大于1.2％时，叠氮钠对其他试剂的影响较大，阻碍了显色反应。

与现有技术相比，本发明的技术方案具有以下优点：本发明提供了精密度、准确性均较高且稳定的测定高密度脂蛋白胆固醇的试剂盒及方法；本发明使用方便、操作简单，参与偶联反应的成分都很稳定，不会引起内外源物质的干扰，稳定性好，可以长时间使用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明测定高密度脂蛋白胆固醇的试剂盒的制备流程图；

图2是本发明测定高密度脂蛋白胆固醇的试剂盒的原理图。

具体实施方式

以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。

实施例1

根据图1所示的流程制备试剂盒，大体包括以下步骤：

1、主要材料及仪器

第一试剂：MES、磷酸盐缓冲液、PEG6000、TODB、胆固醇氧化酶(20u/mg)、过氧化物酶。

第二试剂：MES、磷酸盐缓冲液、4-氨基安替比林、胆固醇酯酶(22.4u/mg)、叠氮钠。

仪器：AL104精密电子天平(灵敏度0.1mg)、TC30K型精密电子天平(灵敏度10mg)、T1000Y型电子天平(灵敏度10mg)、磁力搅拌器(99-1型)、精密酸度计(FE20)、电子秤(灵敏度20g)、玻璃烧杯、量筒。

2、方法

1)在1L容器中加入0.8L工业用水，然后依次加入21.3g MES、0.35ml磷酸盐缓冲液、0.042g PEG6000、0.2gTODB、1000U胆固醇氧化酶(20u/mg)、1200U过氧化物酶；每次加入一个原料后用磁力搅拌器2-3档搅拌均匀，总共搅拌30min。

2)调整混合液PH值为6.0，并定容混合液为1L,且PH值保持6.0。

3)在1L容器中加入0.8L工业用水，然后依次加入21.3g MES、0.35ml磷酸盐缓冲液、1mmol 4-氨基安替比林、1300U胆固醇酯酶(22.4u/mg)、0.01L叠氮钠；每次加入一个原料后用磁力搅拌器2-3档搅拌均匀，总共搅拌30min。

4)调整混合液PH值为6.0，并定容混合液为1L,且PH值保持6.0。

5)分别分装第一试剂溶液和第二试剂溶液。

实施例2

采用实施例1制备的第一试剂和第二试剂检测人血方法简述如下：

1、将溶解的第一试剂加入血清中，30摄氏度、保温5min；

2、加入溶解的第二试剂，30摄氏度、保温5min；

3、判断是否显色。

若显示红紫色，则证明血清中含有HDL和HDL-C，若不显示红紫色，则证明血清中不含有HDL和HDL-C，反应原理如图2所示。

实施例3

分别制作不同批次的实施例1所述的试剂盒，根据批次命名，分别为样品1(20141104)、样品2(20140619)、样品3(20140506)，作为实验组；对照组包括：用于性能评估的校准品(日本协和株式会社高低密校准品，Lot:234ADD，标示值:1.94mmol/L)、用于准确度性能评估的参考物质(Cobas-C.f.a.s.Lipids， Lot:174327，标示值:1.95mmol/L)、质控品(BIO-RAD公司Liquichek Lipids Control，Lot:57281，target:0.900mmol/L，range:0.720-1.08mmol/L； Lot:57282，target:1.80mmol/L，range:1.39-2.22mmol/L)。

实验方法参照GB/T26124-2011《中华人民共和国国家标准-临床化学体外诊断试剂(盒)》。

实验仪器：西门子1200型全自动生化分析仪。

1、产品外观

样品1、样品2和样品3的溶液均为透明液体，无沉淀和絮状物。

2、试剂空白

以灭菌水为空白对照测试3个样品的600nm吸光度，结果如下表：

批号	吸光度A
		样品1	0.0443
样品2	0.0456
		样品3	0.0387

根据结果可知，3个样本600nm吸光度为0.0387-0.0443，均远小于A600nm≤ 0.08的临界值；600nm吸光度反应了样品内的各试剂相互作用导致的降解，从上述实验数据可以看出，本发明的试剂盒的各试剂间具有较稳定的协同作用，这也为本发明的试剂盒监测HDL-C的有效性奠定了基础。

3、灵敏度检测

用已知浓度的样品测试试剂盒，记录在试剂盒规定参数下产生的吸光度变化，本试验测定1.35mmol/L样品，吸光度变化要求>0.0100A；具体结果如下表所示：

批号	吸光度A
		样品1	0.0183
样品2	0.0176
		样品3	0.0167

从上表可知，三个批号的HDL-C试剂盒分别在西门子1200生化仪测定，实验结果表明测定理论值在1.35mmol/L样品时吸光度变化>0.0100A。

4、线性检测

用接近线性范围上限的高浓度样品和接近线性范围下限的低浓度样品，混合成 6个稀释浓度(x i)。分别测试试剂盒，每个稀释度测试3次，分别求测定均值 (yi)。以稀释浓度(x i)为自变量，以测定均值(yi)为因变量求出线性回归方程及相关系数(r)。按公式(1)计算相关系数(r)：

实验结果如下表所示：

依据上表可知，三个样本的试剂盒分别在西门子1200生化仪测定，实验结果表明在0mmol/L～2.6mmol/L测定范围内，线性误差均未出现线性异常状况,所有 R²值均大于行业普遍认可的0.990的标准，线性相对偏差均<±15％。

5、精密度检测

用质控品(BIO-RAD公司Liquichek Lipids Control，Lot:57281，target:0.900mmol/L，range:0.720-1.08mmol/L；Lot:57282，target:1.80mmol/L， range:1.39-2.22mmol/L)测试样本1、样本2和样本3试剂盒。重复测试10次，分别计算测量值的平均值和标准差，按公式计算变异系数(CV)：

实验结果如下表所示：

3个样本经过10次重复，在高低两个不同浓度水平的质控血清测试下，测得的批内不精密度为1.40％-4.03％，均小于5％的临界值。可见，本发明的试剂盒测试结果非常准确，具有临床参考价值。

用质控品分别测试3个样本的试剂盒。每个样本测试3次，分别计算每个样本的3次检测的均值(i＝1,2,3)，以及总计9次的均值，按公式(计算相对偏差(R)：

实验结果如下表所示：

从上表可以看出3个样本相对偏差为4.57％，小于临界值6％。可见，本发明的试剂盒的试剂间以及生产方法具有稳定性，使本发明的试剂盒能够得到稳定的结果，且结果的准确性高，具有重要的临床参考价值。

6、准确度检测

以Cobas-C.f.a.s.Lipids，Lot:174327，标示值:1.95mmol/L，为对照组，用HDL-CCobas-C.f.a.s.Lipids测定3次，计算3次结果平均值为标准值，用3 个样本进行检测，并按照公式计算：

式中：

---测试结果均值；

X靶---有证参考物质的标示值。

结果如下表所示：

根据上表可见，本发明样本的相对偏差为-1.88％--3.25％，远小于临界值15％，可见，本发明的试剂盒的检测结果具有较高的准确性。

综上所述，本发明实施例部分采用大量的试验证明本发明试剂盒的产品性能稳定、检测结果准确性强，在西门子1200型全自动生化仪上检测试剂空白、分析灵敏度、线性范围、重复性、批间差、准确度等各项指标，符合该产品预设的产品技术要求，能够满足临床实际需要。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (9)

1.一种测定高密度脂蛋白胆固醇的试剂盒，其特征在于，包括第一试剂，所述第一试剂包括：MES、磷酸盐缓冲液、PEG6000、TODB、胆固醇氧化酶和过氧化物酶。

2.如权利要求1所述的测定高密度脂蛋白胆固醇的试剂盒，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液在所述第一试剂中含量为0.3-0.5ml/L。

3.如权利要求1所述的测定高密度脂蛋白胆固醇的试剂盒，其特征在于，所述PEG6000在所述第一试剂中含量为0.03-0.06g/L。

4.如权利要求1所述的测定高密度脂蛋白胆固醇的试剂盒，其特征在于，还包括第二试剂，所述第二试剂包括：MES、磷酸盐缓冲液、4-氨基安替比林、胆固醇酯酶和叠氮钠。

5.如权利要求4所述的测定高密度脂蛋白胆固醇的试剂盒，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液在所述第二试剂中含量为0.8-1.2％。

6.如权利要求4所述的测定高密度脂蛋白胆固醇的试剂盒，其特征在于，所述4-氨基安替比林在所述第二试剂中含量为0.5-2mmol/L。

7.一种测定高密度脂蛋白胆固醇的试剂盒，其特征在于，包括以下原料及含量：

第一试剂：20-25g/L MES、0.3-0.5ml/L磷酸盐缓冲液、0.03-0.06g/L PEG6000、0.1-0.3g/L TODB、900-1100U/L胆固醇氧化酶、1000-1300U/L过氧化物酶；

第二试剂：20-25g/L MES、0.3-0.5ml/L磷酸盐缓冲液、0.5-2mmol/L 4-氨基安替比林、1000-1500U/L胆固醇酯酶、0.8-1.2﹪叠氮钠。

8.如权利要求1-7任意一项所述的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

1)按原料组分及含量分别溶解第一试剂和第二试剂；

2)将溶解的第一试剂加入待测样品中；

3)加入溶解的第二试剂；

4)判断是否显色。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述第一试剂和所述第二试剂的溶解液的PH值为5.8-6.3。