CN110702623B - 一种酶促反应底物浓度检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物化学检测领域，具体涉及一种酶促反应底物浓度检测方法，包括以下步骤：步骤一，在检测孔1滴加已知浓度底物溶液，在检测孔2滴加待测底物溶液，检测孔1和检测孔2所含试剂酶活一致；步骤二，设定反应时间，到设定时间后分别检测所述检测孔1和检测孔2的反射光度或颜色；步骤三，根据所述检测孔1检测结果和内置的不同酶活‑反应程度曲线得到试剂酶活；步骤四，根据所述步骤三得到的酶活调用内置的不同底物浓度‑反应程度曲线，根据所述检测孔2的检测结果得到待测底物的浓度。应用本发明酶促反应底物浓度检测方法可降低甚至消除酶活变化对底物浓度测定的影响。
Description
技术领域
本发明涉及生物化学检测领域，具体涉及一种酶促反应底物浓度检测方法。
背景技术
利用干化学酶法来测定底物浓度，操作简便，耗时短，适用于快速检验类项目。
在临床使用中我们发现，许多光电检测设备的干化学试剂，随着储存时间的增加（仍在保质期内）或保存条件不当（温度变化和湿度变化）等因素均会导致酶活下降，影响检测结果，造成误诊。
例如，干化学检测中一些以金属离子为活性中心的工具酶如多酚氧化酶、半乳糖氧化酶等本身的稳定性较差，其活性中心易受分子中硫醇基影响而失活。在实践中发现，正常保存条件下含半乳糖氧化酶的干化学试剂在保质期末（12个月）酶活下降约30%左右。
根据酶促反应的性质可知，酶活的变化会导致反应速度的变化，即酶活变化对底物浓度的测定有较大影响，造成检验结果不准确。临床迫切需要一种检测方法，消除酶活变化导致的检测误差。
发明内容
本发明提供一种酶促反应底物浓度检测方法，应用此检测方法可降低甚至消除酶活变化对底物浓度测定的影响。
本发明技术方案如下：
1.本发明为一种酶促反应底物浓度检测方法，其特点是包括以下步骤：步骤一，在检测孔1滴加已知浓度底物溶液，在检测孔2滴加待测底物溶液，检测孔1和检测孔2所含试剂酶活一致；步骤二，设定反应时间，到设定时间后分别检测所述检测孔1和检测孔2的反射光度或颜色；步骤三，根据所述检测孔1检测结果和内置的不同酶活-反应程度曲线得到试剂酶活；步骤四，根据所述步骤三得到的酶活调用内置的不同底物浓度-反应程度曲线，根据所述检测孔2的检测结果得到待测底物的浓度。
所述已知浓度底物的浓度是选取在检测孔1和检测孔2预制工具酶的检测范围内。
所述不同酶活-反应程度曲线是在已知底物浓度不变条件下制作。
所述不同底物浓度-反应程度曲线是根据所使用工具酶在保质期内活性变化对检测影响的程度确定。
所述不同底物浓度-反应程度曲线是在酶活不变条件下制作。
所述调用内置不同底物浓度-反应程度曲线是调用最接近酶活条件下不同底物浓度-反应程度曲线。
当底物浓度一致时，反应程度随酶活的降低而减小。当酶活下降程度太大会影响试剂的检测范围，即试剂不合格。因此测定试剂酶活后再调用相应酶活条件下的不同底物浓度-反应程度曲线，一方面能使待测底物浓度的检测结果更准确，另一方面当酶活下降程度超出下限还能提示试剂不合格。
不同的酶在其保质期内活性下降程度不同，根据酶活下降对反应的影响程度计算确定内置不同酶活条件下不同底物浓度-反应程度曲线。
当确定了酶活的下降程度和反应曲线，在各节点的酶活条件下分别制作推算不同底物浓度-反应程度的曲线。在测定酶活后调用最接近酶活条件下的不同底物浓度-反应程度曲线。
检测孔1在滴加已知浓度底物后与试剂反应一定时间，利用光电检测设备检测反应进程，根据设备内置的一定底物浓度条件下，不同酶活-反应程度的曲线可得到试剂上的酶活。
检测孔2底物浓度的计算方法如下：根据检测孔2的检测结果和检测孔1得到的酶活，调用最接近酶活条件下，不同底物浓度-反应程度的曲线，检测计算得到孔2中待测底物的浓度。
通过本发明酶促反应底物浓度检测方法可检测试剂卡检测孔的酶活，当酶活下降超出预设范围时，可提示试剂已失效。本法在每次测定时都能对酶活进行测定并调用相对应的不同底物浓度-反应程度曲线，可降低酶活变化对检测结果的干扰，即使试剂的保存条件有变化也不影响最终的实验结果。同时能屏蔽不同生产批次试剂上酶活的差异，消除检测误差。本方法适用于酶偶联检测系统。
具体实施方式
以下实施例旨在加深对本发明的理解，并不代表本发明的全部内容。本发明包括但不限于以下实施例。
实施例1
尿半乳糖检测方法（双酶检测系统）
尿半乳糖检测设备包括进样单元、检测单元、运算单元和显示单元，其中检测单元含有两个检测头，检测目标为试剂卡的反射光度，检测试剂卡含有两个检测孔。尿半乳糖检测设备内部内置1条1mmol/L半乳糖浓度时不同半乳糖氧化酶浓度-反射光度的曲线，用于检测试剂的酶活。根据试验获得半乳糖氧化酶试剂在保质期内酶活衰减对检测结果的影响程度，酶活每衰减6%制作一条不同半乳糖浓度-反射光度曲线，酶活衰减30%试剂失效。因此检测仪还内置有6条不同半乳糖氧化酶浓度条件下的不同半乳糖浓度-反射光度的曲线，用于检测底物的浓度。尿半乳糖检测设备测定浓度线性范围为0.4mmol/L-1.4mmol/L，检测设备还配有一瓶1mmol/L半乳糖水溶液和尿液除干扰过滤器。
在测定待测尿液时先用尿液除干扰过滤器过滤尿液，然后将1mmol/L半乳糖水溶液和过滤后的尿液同时分别滴20μL于试剂卡的孔1、孔2。待反应10min后用尿半乳糖检测仪测定孔1和孔2的反射光度，根据孔1中1mmol/L半乳糖水溶液的反射光度和内置1mmol/L半乳糖时不同半乳糖氧化酶活-反射光度的曲线求得试剂卡中半乳糖氧化酶的酶活。再根据求得的酶活，机器调用最接近酶活下不同半乳糖浓度-反射光度的曲线，通过孔2的反射光度得到待测尿液中半乳糖的浓度。
实施例2
甘油三酯测定方法（三酶检测系统）
甘油三酯检测设备包括进样单元、检测单元、运算单元和显示单元，其中检测单元含有两个检测头，检测目标为试剂卡的灰度，检测试剂卡含有两个检测孔。甘油三酯检测设备内部内置1条0.9mmol/L甘油三酯浓度下不同脂肪酶浓度-灰度的曲线，用于测定试剂上脂肪酶浓度。甘油三酯测定设备还备有一瓶0.9mmol/L甘油三酯。甘油三酯检测设备测定浓度的线性范围为0.5-1.4mmol/L。根据试验获得脂肪酶试剂在保质期内酶活衰减对检测结果的影响程度，酶活衰减25%试剂失效，酶活每衰减6%制作一条不同甘油三酯浓度-灰度曲线，并将其内置于检测仪中，用于检测底物浓度。
在测定血清甘油三酯含量时，将0.9mmol/L甘油三酯和待测血清分别滴加10μL于试剂卡孔1、孔2。待反应12min后用甘油三酯检测仪测定反应的颜色变化，并将其转为灰度值。根据孔1灰度和0.9mmol/L甘油三酯浓度下不同脂肪酶浓度-灰度的曲线得到脂肪酶的酶活，检测仪调用最接近脂肪酶的酶活条件下的不同甘油三酯浓度-灰度曲线并根据孔2的灰度计算得到待测血清中甘油三酯的含量。
Claims (6)
1.一种酶促反应底物浓度检测方法，其特征是包括以下步骤：步骤一，在检测孔1滴加已知浓度底物溶液，在检测孔2滴加待测底物溶液，检测孔1和检测孔2所含试剂酶活一致；步骤二，设定反应时间，到设定时间后分别检测所述检测孔1和检测孔2的反射光度或颜色；步骤三，根据所述检测孔1检测结果和内置的不同酶活-反应程度曲线得到试剂酶活；步骤四，根据所述步骤三得到的酶活调用内置的不同底物浓度-反应程度曲线，根据所述检测孔2的检测结果得到待测底物的浓度。
2.根据权利要求1所述的酶促反应底物浓度检测方法，其特征是所述已知浓度底物的浓度选取在检测孔1和检测孔2预制工具酶的检测范围内。
3.根据权利要求1所述的酶促反应底物浓度检测方法，其特征是所述不同酶活-反应程度曲线是在已知底物浓度不变条件下制作。
4.根据权利要求1所述的酶促反应底物浓度检测方法，其特征是所述不同底物浓度-反应程度曲线是根据所使用工具酶在保质期内活性变化对检测影响的程度确定。
5.根据权利要求1所述的酶促反应底物浓度检测方法，其特征是所述不同底物浓度-反应程度曲线是在酶活不变条件下制作。
6.根据权利要求1所述的酶促反应底物浓度检测方法，其特征是所述调用内置不同底物浓度-反应程度曲线是调用最接近酶活条件下不同底物浓度-反应程度的曲线。
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