JP4411586B2 - 残留農薬測定方法 - Google Patents
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(1)コリンエステラーゼ阻害性農薬の共存により変化するコリンエステラーゼ活性は、コリンエステラーゼとコリンオキシダーゼとの共役酵素反応によるコリンエステラーゼ特異性基質の分解に起因する過酸化水素を検出する方法で測定を行い、かつ測定溶液中に少なくともコリンエステラーゼ、コリンオキシダーゼ、緩衝溶液、及びコリンエステラーゼ特異性基質を含むことを特徴とするコリンエステラーゼ阻害性農薬の測定方法とした。
(2)過酸化水素の発色反応系を用いた吸光度測定などによる前記過酸化水素の検出を行うことによりコリンエステラーゼ阻害性農薬を定量する(1)記載の測定方法とした。
(3)前記コリンエステラーゼは、厳密には、アセチルコリンエステラーゼ、又はブチリルコリンエステラーゼであり、該酵素の由来は特に限定されないが、好適には電気ウナギ由来のアセチルコリンエステラーゼである(1)記載のコリンエステラーゼとした。
(4)アセチルコリンエステラーゼ、又はブチリルコリンエステラーゼに対して基質特異性を示すものならば、アセチルチオコリン及びブチリルチオコリンを選択しない限りにおいて、特に限定されないが、好適にはヨウ化アセチルコリンである(1)記載のコリンエステラーゼ特異性基質とした。
(5)被測定対象物質が、厳密には、アセチルコリンエステラーゼ、又はブチリルコリンエステラーゼに対して高い阻害能を有するN−メチルカルバメート系殺虫剤、ホスフェート型有機リン系殺虫剤、又はチオノ型有機リン系殺虫剤、ジチオ型有機リン系殺虫剤を酸化処理して得られるホスフェート型の酸化生成物である(1)記載のコリンエステラーゼ阻害性農薬とした。
(6)コリンオキシダーゼ、コリンエステラーゼおよび必要により過酸化水素量を測定するための反応試薬は順不同で先に添加し、一定時間経過後、最後に、コリンエステラーゼ特異性基質を添加する順序で行われる(1)記載の測定溶液中への酵素、基質の添加とした。
(7)コリンオキシダーゼ活性がコリンエステラーゼ活性と比較して大となるよう添加される(1)記載の該酵素の添加量とした。
(8)前記(6)の添加順序を踏むことにより測定溶液中へ混在する遊離コリンの過酸化水素への変換を行い、測定前段階における過酸化水素濃度を安定させ、コリンエステラーゼ特異性基質を添加した後の過酸化水素濃度の変化率(時間微分値)を捉え、同様の過程を踏み、理想溶液中で測定した値との比較からコリンエステラーゼ阻害性農薬による活性阻害率を算出する方法とした。
(9)前記(8)記載の活性阻害率と予め測定したコリンエステラーゼ阻害性農薬のコリンエステラーゼ阻害能を表す定数:Ki、のデータベースとをミカエリス−メンテンス型酵素の動力学的計算に代入することで、測定溶液中に含まれるコリンエステラーゼ阻害性農薬濃度の換算を行うことを特徴とするコリンエステラーゼ阻害性農薬の定量方法とした。
(10)前記(8)記載の理想溶液は、測定を行うために十分な酵素活性が得られ、かつ被測定対象物質を加水分解しないpHに保つための緩衝溶液と、イオン強度を調整するために添加する多量の無関係塩との組成とした。
(11)前記(1)記載の緩衝溶液は、前記(8)記載の理想溶液と同組成、かつ同量とした。
39の両端は光が通りかつ密閉するためのガラス窓35a,35bがあり、ランプ36の光がバンドパスフィルタ37、光ファイバー33a、ミラー34a及びガラス窓35aを介して溶液中に侵入し、溶液中を通過した光はガラス窓35b、ミラー34b及び光ファイバー33bを介してディテクタ38に受光される構造となっている。バンドパスフィルタは発色物質の最大吸収波長付近にピーク透過波長を持つもので、シリコンフォトダイオードなどの安価な素材で形成されるディテクタ38により透過光量が測定される。このセンサ5の迷光は装置全体を遮光することにより実現される。そして、該センサ5の検出部の他端側には、センサ5を支持するセンサ固定体4が設けられ、該センサ固定体4は垂直方向に移動するセンサ昇降装置3に支持されている。該センサ昇降装置3は、ステップモータなどの駆動源と、センサ5の位置センサ12とにより形成され、ステップモータの正・逆回転によりセンサ5を液面に浸漬することと、センサ5を液面から引き上げることとを制御することができる。また、前記センサ昇降装置3には、前記センサ固定体4を水平方向に移動するために、回転アーム2の一端が接続されている。該回転アーム2の他端には、回転アーム2を平面視で所定角度回転させるアーム回転モータ1と、回転アーム2の水平位置センサ14が設けられている。該アーム回転モータ1のステップ状の正・逆回転及び水平位置センサ14により、反応槽9、洗浄槽16及び比較反応槽15の上方にセンサ5を随時移動することができる。
2 回転アーム
3 センサー昇降装置
4 センサー固定体
5 センサー
6 ノズル支持棒
7 試薬添加ノズル
8 チューブ
9 反応槽
10 反応液
11 攪拌回転子
12 位置センサー
13 ノズル支持体
14 水平位置センサー
15 比較反応槽
16 洗浄槽
17 洗浄水導入管
18 洗浄水排出管
19 洗浄水
23 パソコン
24 プリンター
25 信号処理回路
26 測定器本体
27 測定部
28 ウォーターポンプ
29 分注器
30 コントローラー
31 試薬類供給チューブ
32 洗浄水供給管
33 光ファイバー
34 ミラー
35 ガラス窓
36 ランプ
37 バンドパスフィルター
38 ディテクタ
39 溝
Claims (7)
- コリンエステラーゼの活性阻害を利用した農作物中に含まれるコリンエステラーゼ阻害性農薬を測定する方法において、農薬を含む試料溶液中に、コリンエステラーゼ、コリンオキシダーゼ及び発色試薬などの反応量を把握するための試薬をあらかじめ添加して、酵素の安定化及び試料中に既に含まれている妨害物質を分解すべく、コリンエステラーゼに対して特異性を示す基質及び遊離コリンを過酸化水素に変換するに十分な時間をかけてインキュベートを行った後、コリンエステラーゼに対して特異性を示す基質溶液を添加し、その後、添加基質のコリンエステラーゼによって加水分解される量を測定した結果と、理想溶液中で同様のシーケンスに従って測定した結果との比較から、試料溶液中に含まれる残留農薬濃度を算出することを特徴とする残留農薬測定方法。
- 前記インキュベートにおける前記コリンオキシダーゼの添加量は、比活性測定でヨウ化アセチルチオコリンがアセチルコリンエステラーゼにより分解される量(α)と比活性測定で塩化コリンがコリンオキシダーゼにより分解される量(β)とのモル比(β/α)が50乃至100となるように、前記コリンエステラーゼの添加量よりも過剰に添加してなる請求項1記載の残留農薬測定方法。
- 前記コリンエステラーゼに対して特異性を示す基質は、酵素がアセチルコリンエステラーゼである場合にはヨウ化アセチルコリンとしてなる請求項1又は2記載の残留農薬測定方法。
- 前記コリンエステラーゼに対して特異性を示す基質は、酵素がブチリルコリンエステラーゼである場合にはヨウ化ブチリルコリンとしてなる請求項1又は2に記載の残留農薬測定方法。
- 前記ヨウ化アセチルコリンの最終濃度が0.1〜0.3mMである請求項3記載の残留農薬測定方法。
- 測定系におけるpHをコリンエステラーゼ活性の至適pHに調整するための緩衝液と、試料に当初から含まれるイオン種が測定系に混入した場合のイオン強度変化の影響を緩和するための多量の電解質と、を含む理想溶液を使用してなる請求項1又は2記載の残留農薬測定方法。
- 試料の抽出乾固成分を、pH6程度の弱酸性溶液で溶解した後、前記理想溶液中に含まれる成分を最終濃度で同じになるように調整した請求項6記載の残留農薬測定方法。
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