JP5660422B2 - 残留農薬測定方法 - Google Patents

Description

本発明は、農作物中の残留農薬測定方法に関し、詳しくは、ネライストキシン系農薬の分析を被検農薬標準品の使用なしで、コリンオキシターゼ（酵素）を用いて簡便かつ迅速に分析する技術に関する。

ネライストキシン系農薬には、カルタップ、ベンスルタップ、チオシクラムがある。これらは、農作物への散布後、加水分解や酸化によりネライストキシン（イソメ毒）に変化する誘導体である。ネライストキシンは昆虫に強い麻酔作用を示す物質であり、神経細胞にあるアセチルコリン受容体に結合することで機能を阻害するといった殺虫作用がある。

従来、ネライストキシン系農薬の測定には、非特許文献１に記載されているように、ガスクロマトグラフやガスクロマトグラフ質量分析計等の精密分析装置を用いて行っている。しかしながら、このような分析装置を用いた検出方法は、サンプル中に含まれている成分を網羅的に、精度良く検出できるものの、測定装置が高価であり、測定操作が煩雑で熟練を要し、測定を短時間で行うことができない等の問題があった。また、測定毎に機器校正のため農薬を使用せざるを得ない等の問題もある。

ところで、農作物の残留農薬を簡便かつ迅速に検出する方法として、特許文献１に記載されている方法が知られている。この方法では、コリンエステラーゼに農薬が阻害影響を与えることを利用し、コリンエステラーゼを添加した測定試料に、コリンオキシターゼを加え、さらに、コリンエステラーゼの基質であるアセチルコリンを添加することで、生成される過酸化水素の量を過酸化水素センサによって電流値として検知し、該電流値を、農薬を含まない試料での電流値（活性）と比較して残留農薬の検出をしている。

しかし、農作物の中にはコリンエステラーゼを非特異的に妨害（阻害）する成分を多く含むものもある。このような農作物の場合、ネライストキシン系農薬の測定は困難であった。このため、農作物中のコリンエステラーゼ妨害（阻害）成分を除くための精製工程を設けることが考えられたが、この方法では、農薬成分の回収ロスが大きくなることから、農薬の測定が困難となってしまう。

前記非特異的な妨害（阻害）の原因については、酵素タンパク質の活性部位に直接影響を与えるのではなく、活性部位上に覆い被さって酵素活性を妨害したり、基質と反応して別のものに変化させ基質濃度を低下させてしまうことなどが考えられる。

「今月の農業」編集室編「改訂４版農薬登録保留基準ハンドブック作物・水質残留基準と試験法」化学工業日報社（２００３年） 特開２００４−１７０３９２号公報

本発明は上記問題点にかんがみて、高価で測定装置が煩雑な装置を使用することなく、特許文献１に記載されているような簡易で迅速な測定方法によって、農作物に残留するネライストキシン系農薬の測定を行えるようにすることを技術的課題とする。

上記課題を解決するため本発明は、被検農作物の抽出液を調製する前処理工程と、前記抽出液に基質となるコリン及びコリンオキシターゼを添加する添加工程と、前記添加工程後の抽出液中の過酸化水素の量を測定する工程と、前記過酸化水素が生成される反応速度を求める工程とを含み、前記反応速度によりネライストキシン系農薬の濃度を測定する、という技術的手段を講じた。

また、基質となるコリンには塩化コリンを使用することが望ましく、前記反応速度は過酸化水素センサ又は吸光度計により測定することが可能である。

さらに、前記反応速度として、被検農作物の抽出液における過酸化水素が生成される反応速度と、農薬を含有しない理想溶液における過酸化水素が生成される反応速度との比を用いることが望ましい。

そして、前記理想溶液には、前記前処理工程で使用される緩衝液を使用することができる。

本発明によれば、比較的安価な測定装置を使用して測定することが可能であり、また、測定のための操作が簡単であり、さらに、測定を短時間で行うことが可能である。

その上、機器校正のため被検農薬を使用せざるを得ないという従来あった課題の克服までも可能にする簡易な優れた測定方法である。

本発明の測定原理の概要を示した図である。 測定用の抽出液を調製するための前処理工程を示すフロー図である。 反応速度（コリンオキシターゼの活性）を測定した結果を示している 農薬濃度換算係数Ｆの求め方の一つを説明するための図である。 カルタップの濃度を測定した結果を示した図である。 ベンスルタップの濃度を測定した結果を示した図である。 チオシクラムの濃度を測定した結果を示した図である。

以下、図を参照して本発明によるネライストキシン系農薬の測定を実施する形態を説明する。図１は、本発明におけるネライストキシンの測定原理の概要を示している。本発明者らは、コリンオキシターゼとその基質であるコリンを使用し、ネライストキシンによるコリンオキシターゼの活性阻害を調べた。その結果、ネライストキシンがコリンオキシターゼの活性を阻害していることが確認された。つまり、ネライストキシンが存在しなければ、コリンオキシターゼの活性が阻害されないため、過酸化水素が生成される反応速度が速く、逆に、ネライストキシンが多く存在するほど、コリンオキシターゼの活性が阻害されるので、過酸化水素が生成される反応速度が遅くなるということになる。

この事実を踏まえ、本発明では、コリンオキシターゼの活性によりコリンから過酸化水素が生成される反応速度を過酸化水素定量可能な検出器（例えば、吸光度計や過酸化水素センサなど）にて測定することで、検査対象となる農作物（以下、「被検農作物」という）の残留農薬の濃度を測定（分析）することを特徴とする。

なお、前記反応速度を、吸光度を用いて測定する方法については、特開２００２−６２２６５、特開２００３−２９８等に記載されている方法を用いればよい。

まず、測定を行う前の抽出液の調製方法（前処理）を説明する。図２は、本発明による被検農作物からネライストキシン系の農薬成分を抽出・精製し、測定用の抽出液を調製するための前処理工程を示すフロー図である。

本実施例では、ホップ（ホップペレット（ナゲットビタータイプ９０））を、被検農作物とし、測定に、残留農薬の測定装置であるＡＣＡ２０００Ａ（サタケ社）を使用した場合について説明する。なお、被検農作物はホップに限定されるわけではなく、市場で流通している農作物が測定対象になる。また、前記測定装置についてもＡＣＡ２０００Ａに限定されるわけではなく、過酸化水素を定量可能な検出器、例えば吸光度計によっても測定可能である。

ステップＳ１は、被検農作物からの農薬成分の抽出速度、抽出効率を高めるために農作物の粉砕を行う工程である。本実施例において使用する測定装置（ＡＣＡ２０００Ａ）に対応させるために、前記ホップは６ｇ以上使用する。このホップをミキサーにより２０秒間程度粉砕する。

粉砕後、粉砕したホップを６ｇ秤量し、該ホップを三角フラスコに投入する（ステップＳ２）。そして、前記三角フラスコ内のホップから農薬を抽出するために、１％Ｌ−システイン塩酸塩含有０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸（以下、「塩酸」という）を前記三角フラスコに投入し、該三角フラスコを振とう台にのせて１５分間程度振とうする（ステップＳ３）。

振とう後、前記塩酸から粒子の大きい夾雑物を除去し、農薬を抽出した前記塩酸を回収するために濾過（ステップＳ４）を行う。前記濾過には、濾過鍾と桐山漏斗とを使用すればよく、洗浄済みの三角フラスコを濾過鍾に入れ、前記濾過鍾の上方に桐山漏斗を配置して、該桐山漏斗に濾紙をセットし、該濾紙を少量（１〜２ｍＬ）の塩酸で湿らせてから、前記濾紙上にセライト１０ｇ程度をまんべんなく水平に敷く。そして、アスピレータで吸引しながらステップＳ３で振とうした塩酸を投入し、該塩酸を濾過する。

なお、振とう時に使用した三角フラスコに残留している塩酸の残渣は、新たに追加した塩酸にて共洗いし、前記桐山漏斗に投入する。

前記濾過によって得られた濾液に含まれるネライストキシン系農薬であるカルタップ、ベンスルタップ又はチオシクラムをネライストキシンに変換するために、分液漏斗に、前記濾液、１２．５％−塩化ニッケル水溶液１ｍＬ及びアンモニア水５ｍＬを入れ、振とう器を使用して１０分間程度振とうする（ステップＳ５）。

前記振とう後、測定の防げとなる親水性成分を前記濾液から除去するためにカラム内液々分配を行う（ステップＳ６）。該液々分配では、１００ｍＬ保持用ケイソウ土カラムに前記濾過液を負荷し、該濾過液が全て浸透してから１０分間程度静置する。そして静置後にヘキサン２５０ｍＬを負荷して抽出液を回収する。

前記抽出液の回収後、前記抽出液からヘキサンを留去するために、ロータリーエバポレータを使用して、前記抽出液が１０ｍＬ程度になるまで減圧濃縮を行う（ステップＳ７）。なお、この減圧濃縮は１５０ｈＰａ以上、温度３０℃以下の環境で行う必要がある。

そして、ステップ７で減圧濃縮された抽出液に３ｍＬの塩化カリウム含リン酸緩衝液（０．２Ｍ−リン酸緩衝液及び０．１Ｍ−塩化カリウム ｐＨ７．５）を入れ、引き続きロータリーエバポレータによりヘキサンの留去を行い（ステップＳ８）、測定目的とする成分（ネライストキシン）を前記緩衝液に溶かし込ませる。なお、ステップＳ８での減圧濃縮（転溶）も１５０ｈＰａ以上、温度３０℃以下の環境で行う必要がある。ステップＳ８での減圧濃縮（転溶）によって、被検農作物から被検農薬成分を抽出した測定用の抽出液が調製されることになる。

次に、前記抽出液を使用して、被検農作物の残留農薬を前記測定装置（ＡＣＡ２０００Ａ）により測定する方法について説明する。

ところで、本実施例の測定は下記の数式１を用いる。

数式１におけるＲ．Ａ．は、相対活性値（Ｒｅｌａｔｉｖｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ）である。相対活性値は、被検農作物の抽出成分を溶解した抽出液（農薬有り）と、理想溶液（農薬無し）とでコリンコリンオキシターゼの活性を、前記測定装置でそれぞれ反応速度として測定し、それら反応速度の比により求める。なお、相対活性値（Ｒ．Ａ．）は下記の数式２により計算する。

数式２における「抽出液（農薬有り）反応速度」とは、被検農作物の抽出液の反応速度のことであり、「理想溶液（農薬無し）反応速度」とは、前記前処理工程のステップＳ８において使用する緩衝液の反応速度である。

抽出液（農薬有り）反応速度及び理想溶液（農薬無し）反応速度は、前記測定装置にて求める。ここで、前記測定装置によるコリンオキシターゼの活性の測定方法について説明する。

まず、前記前処理工程で調製された測定用の抽出液（２．５ｍＬ）を回転子が入った測定用カップに入れ、該測定用カップにさらに基質（５ｍＭ−塩化コリン）０．５ｍＬを添加する（ステップＳ９）。

添加後、前記測定用カップを前記測定装置にセットし、該測定装置で測定を開始する。測定開始後、０．０６Ｕ／ｍＬのコリンオキシターゼを含むコリンオキシターゼ溶液（２０ｍＭ−リン酸緩衝液及び１０ｍＭ−塩化カリウム ｐＨ７．５）２ｍＬが分注器により添加され、コリンオキシターゼの活性が測定される。なお、理想溶液の反応速度も前記抽出液と同様に、前記基質０．５ｍＬと前記コリンオキシターゼ溶液２ｍＬとを添加して測定する。

図３は、それら反応速度を前記測定装置で測定した結果を示している。図３は、横軸を時間（秒）、縦軸を電流値（ｎＡ）としている。ここでいう反応速度とは、図３で示す、電流値による変化として示される直線の傾きのことである。本発明では９０秒から２７０秒の間の情報から前記傾きを求めている。

図３において、６０秒後に急激に電流値が変化しているが、これはコリンオキシターゼ溶液が投入された６０秒後に測定装置のセンサが投入されるからである。ちなみに、図３の情報から求めた抽出液（農薬有り）反応速度は、６．１３［ｎＡ／３０ｓｅｃ］であり、理想溶液（農薬無し）反応速度は、１４．７［ｎＡ／３０ｓｅｃ］であった。

また、数式１における補正係数αは、下記の数式３により求める。

補正係数αは、数式１におけるバイアス補正のための補正係数である。この補正係数αは、ネライストキシン系農薬を含有しないことが事前の検査によって確認されている農作物の抽出液（農薬無し）反応速度と、理想溶液（農薬無し）反応速度との比で求める。

なお、前記抽出液（農薬無し）反応速度は、ネライストキシン系農薬を含有しないことが事前の検査によって確認されている農作物を使用して前記前処理工程にて調製した抽出液を測定して求めればよい。

数式１のＦは、農薬濃度換算係数であり、コリンオキシターゼの活性の反応速度を、残留農薬の濃度に換算するための係数である。この係数Ｆは、事前に求めておく必要があり、その求め方について説明する。

まず、ネライストキシン系農薬が残留していないことが確認されている農作物を用意し、前記前処理工程により測定用の抽出液を調製する。その際、前記前処理工程のステップＳ３（振とう）の直前に所定量のネライストキシン系農薬を添加し、ネライストキシン系農薬の濃度が明確な抽出液とする。そして、該抽出液のコリンオキシターゼの活性に係る反応速度を前記測定装置で求める。さらに、前記反応速度と理想溶液（農薬無し）反応速度との比の相対活性値を求める。この方法によって、農薬濃度の異なる複数の抽出液の相対活性値を求める。

次に、農薬濃度及び相対活性値を求めた複数の情報を用いて、農薬濃度を説明変数、相対活性値の逆数を目的変数とした回帰式を求める。そして、前記回帰式の傾きの逆数を農薬濃度換算係数とする。逆数とするのは、反応速度から濃度を換算することによる。

農薬濃度換算係数の求め方は、前述の方法に限定されるわけではなく、例えば０ｐｐｍ及び５ｐｐｍの２つの農薬濃度の抽出液を調製し、それぞれの濃度での相対活性値を求めた場合には、図４に示すように、横軸（Ｘ軸）に添加した農薬の濃度、縦軸（Ｙ軸）に相対活性値の逆数をとったグラフを作成し、２つの濃度での情報から直線（一次式）の式を求め、該直線の傾きの逆数を農薬濃度換算係数としてもよい。

上記の方法により予め用意しておいた農薬濃度を算出するための数式１に、被検農作物を測定して得た相対活性値を代入することで、前記被検農作物の残留農薬の濃度を計算により求めることができる。

なお、数式１を使用せず、農薬濃度及び相対活性値を求めた複数の情報を用いて、農薬濃度を目的変数、相対活性値の逆数を説明変数とした回帰式を求め、該回帰式を、農薬濃度を算出するための数式として使用してもよい。

ここで、本発明によってネライストキシン系農薬を測定した結果を示す。本実施例では、ネライストキシン系農薬が残留していないことが確認されている農作物を用意し、前記前処理工程により測定用の７つの抽出液を調製した。その際、前記前処理工程のステップＳ３（振とう）の直前に、第１の抽出液には該抽出液のカルタップの濃度が２．５ｐｐｍとなるようにカルタップを添加し、第２の抽出液には該抽出液のカルタップの濃度が５．０ｐｐｍとなるようにカルタップを添加し、第３の抽出液には該抽出液のカルタップの濃度が７．５ｐｐｍとなるようにカルタップを添加し、第４の抽出液には該抽出液のカルタップの濃度が１０．０ｐｐｍとなるようにカルタップを添加し、第５の抽出液には該抽出液のカルタップの濃度が１２．５ｐｐｍとなるようにカルタップを添加し、第６の抽出液には該抽出液のカルタップの濃度が１５．０ｐｐｍとなるようにカルタップを添加し、そして第７の抽出液には該抽出液のカルタップの濃度が０ｐｐｍとなるようにカルタップを添加せず、カルタップの濃度が明確な抽出液それぞれ調製した。

なお、抽出液のカルタップの濃度が５．０ｐｐｍとなるようにするために添加したカルタップの量は３０μｇである。

そして、それぞれ濃度が異なる７つの前記抽出液の反応速度（コリンオキシターゼの活性）を本発明の方法で測定し、それぞれの抽出液毎にカルタップの濃度を算出した。その結果を図５に示している。図５は、横軸に添加したカルタップの濃度、縦軸に前記数式１で算出したカルタップの濃度を示している。なお、カルタップは添加後、ネライストキシンに変換されるので、カルタップに換算した値を縦軸に用いている。

図５で示すように、本発明の測定方法により、農作物に添加したカルタップを十分に測定できることが確認された。

次に、ベンスルタップの場合についても確認を行った。確認方法は、実施例１で示したカルタップの場合と同一であり、ネライストキシン系農薬が残留していないことが確認されている農作物を用意し、前記前処理工程により測定用の７つの抽出液を調製した。その際、前記前処理工程のステップＳ３（振とう）の直前に、第１の抽出液には該抽出液のベンスルタップの濃度が２．５ｐｐｍとなるようにベンスルタップを添加し、第２の抽出液には該抽出液のベンスルタップの濃度が５．０ｐｐｍとなるようにベンスルタップを添加し、第３の抽出液には該抽出液のベンスルタップの濃度が７．５ｐｐｍとなるようにベンスルタップを添加し、第４の抽出液には該抽出液のベンスルタップの濃度が１０．０ｐｐｍとなるようにベンスルタップを添加し、第５の抽出液には該抽出液のベンスルタップの濃度が１２．５ｐｐｍとなるようにベンスルタップを添加し、第６の抽出液には該抽出液のベンスルタップの濃度が１５．０ｐｐｍとなるようにベンスルタップを添加し、そして第７の抽出液には該抽出液のベンスルタップの濃度が０ｐｐｍとなるようにベンスルタップを添加せず、ベンスルタップの濃度が明確な抽出液それぞれ調製した。

なお、抽出液のベンスルタップの濃度が７．５ｐｐｍとなるようにするために添加したベンスルタップの量は４５μｇである。

そして、それぞれ濃度が異なる７つの前記抽出液の反応速度（コリンオキシターゼの活性）を本発明の方法で測定し、それぞれの抽出液毎にベンスルタップの濃度を算出した。その結果を図６に示している。図６は、横軸に添加したベンスルタップの濃度、縦軸に前記数式１で算出したベンスルタップの濃度を示している。なお、ベンスルタップは添加後、ネライストキシンに変換されるので、ベンスルタップに換算した値を縦軸に用いている。

図６で示すように、本発明の測定方法により、農作物に添加したベンスルタップを十分に測定できることが確認された。

さらに、チオシクラムの場合についても確認を行った。確認方法は、実施例１で示したカルタップの場合と同一であり、ネライストキシン系農薬が残留していないことが確認されている農作物を用意し、前記前処理工程により測定用の７つの抽出液を調製した。その際、前記前処理工程のステップＳ３（振とう）の直前に、第１の抽出液には該抽出液のチオシクラムの濃度が２．５ｐｐｍとなるようにチオシクラムを添加し、第２の抽出液には該抽出液のチオシクラムの濃度が５．０ｐｐｍとなるようにチオシクラムを添加し、第３の抽出液には該抽出液のチオシクラムの濃度が７．５ｐｐｍとなるようにチオシクラムを添加し、第４の抽出液には該抽出液のチオシクラムの濃度が１０．０ｐｐｍとなるようにチオシクラムを添加し、第５の抽出液には該抽出液のチオシクラムの濃度が１２．５ｐｐｍとなるようにチオシクラムを添加し、第６の抽出液には該抽出液のチオシクラムの濃度が１５．０ｐｐｍとなるようにチオシクラムを添加し、そして第７の抽出液には該抽出液のチオシクラムの濃度が０ｐｐｍとなるようにチオシクラムを添加せず、チオシクラムの濃度が明確な抽出液それぞれ調製した。

なお、抽出液のチオシクラムの濃度が１０．０ｐｐｍとなるようにするために添加したチオシクラムの量は６０μｇである。

そして、それぞれ濃度が異なる７つの前記抽出液の反応速度（コリンオキシターゼの活性）を本発明の方法で測定し、それぞれの抽出液毎にチオシクラムの濃度を算出した。その結果を図７に示している。図７は、横軸に添加したチオシクラムの濃度、縦軸に前記数式１で算出したチオシクラムの濃度を示している。なお、チオシクラムは添加後、ネライストキシンに変換されるので、チオシクラムに換算した値を縦軸に用いている。

図７で示すように、本発明の測定方法により、農作物に添加したチオシクラムを十分に測定できることが確認された。

本発明によれば、農作物に限定されず、ネライストキシンを含有する物を測定対象とすることが可能である。

１ 前処理工程のフロー図である。

Claims (5)

1. 被検農作物の抽出液を調製する前処理工程と、
   前記抽出液に基質となるコリン及びコリンオキシターゼを添加する添加工程と、
   前記添加工程後の抽出液中の過酸化水素の量を測定する工程と、
   前記過酸化水素が生成される反応速度を求める工程とを含み、
   前記反応速度によりネライストキシン系農薬の濃度を測定することを特徴とする農作物における残留農薬の測定方法。
2. 基質となる前記コリンが塩化コリンであることを特徴とする請求項１に記載の残留農薬の測定方法。
3. 前記反応速度を過酸化水素センサ又は吸光度計により測定することを特徴とする請求項１又は２に記載の残留農薬の測定方法。
4. 前記反応速度が、
   被検農作物の抽出液における過酸化水素が生成される反応速度と、
   農薬を含有しない理想溶液における過酸化水素が生成される反応速度との比であることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか一項に記載の残留農薬の測定方法。
5. 前記理想溶液が、前記前処理工程で使用される緩衝液であることを特徴とする請求項４に記載の残留農薬の測定方法。