CN108872582B - 一种基于DNAWalker的适配体传感器、制备方法及其应用 - Google Patents
一种基于DNAWalker的适配体传感器、制备方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种基于DNAWalker的适配体传感器、制备方法及其应用，可用于对黄曲霉毒素B1的检测，蔗糖酶与基底DNA的复合物修饰金电极，然后，利用DNA序列的互补配对，基底DNA与适配体DNA互补配对，得到双链修饰的金电极，再加入AFB1与适配体DNA特异性结合，夺走适配体DNA，留下的基底DNA，被Walker DNA和铅离子特定位点剪切，剪切之后得到DNA片段修饰的金电极，而蔗糖酶游离在溶液中，能够分解加入的蔗糖为葡萄糖。葡萄糖的量与AFB1的浓度有关。随着AFB1浓度的增加，葡萄糖的含量会随之增加，血糖仪的数值就会相应增大。因此，此传感器可对不同浓度的AFB1进行定量检测。
Description
技术领域
本发明属于生物传感器技术领域，具体涉及一种基于DNAWalker的适配体传感器、制备方法及其应用，可用于对黄曲霉毒素B1的检测。
背景技术
黄曲霉毒素B1(AFB1)，其中一个最强的致癌物质、致畸因子，产生于曲霉和烟曲霉，已广泛存在于许多农作物(如玉米、花生、棉花、种子、黄豆)和发霉的食品(面包、糕点、饼)。此外，接触到AFB1可能导致严重的疾病，如肝硬化、肿瘤等。
因此，开发一种便携式、简便、快速、灵敏的传感器在线检测AFB1的方法是至关重要的。迄今为止，报道了各种对AFB1检测的分析方法，在这些方法中，由于层析、高效液相色谱(HPLC)和液相色谱-质谱具有高的的精确度和灵敏度，所以这些方法经常被用来检测AFB1。
然而，这些技术不仅需要昂贵的仪器和熟练的操作人员，还有复杂的样品预处理(如固相萃取柱)，而且不适合多个样品的分析和现场检测，限制了它们的应用。
因此，开发一种简单的、选择性和灵敏度高的方法对AFB1现场检测仍然是非常令人期待的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于DNA Walker的适配体传感器及其制备方法，利用DNA序列的互补配对，适配体与目标物之间的特异性结合，DNA酶的特定位点剪切，制备适配体传感器。
本发明的目的还在于提供一种基于DNA Walker的适配体传感器的应用，实现对黄曲霉毒素B1的灵敏检测。
本发明提供的一种基于DNA Walker的适配体传感器的制备方法，包括以下步骤：
1)将抛光处理后的金电极浸入蔗糖酶与巯基标记的基底DNA复合物的缓冲溶液中，培养，然后取出，清洗，得到修饰了基底DNA的金电极；
2)将步骤1)得到的修饰了基底DNA的金电极浸入适配体DNA的缓冲溶液，培养，清洗，得到双链修饰的金电极；
3)将步骤2)得到的修饰双链的金电极浸入AFB1的缓冲溶液中，培养，清洗，得到修饰了基底DNA的金电极；
4)将步骤3)得到的修饰了基底DNA的金电极浸入Walker DNA缓冲溶液和铅离子溶液的混合液中，培养，得到含有蔗糖酶的溶液；
5)将步骤4)得到的含有蔗糖酶的溶液加入蔗糖溶液中，培养，得到含有葡萄糖的溶液；
6)将步骤5)得到的含有葡萄糖的溶液滴在血糖仪试纸上，得到代表葡萄糖含量的数值。
具体的，步骤1)为将购买的基底DNA溶解在磷酸盐PBS缓冲溶液得到浓度为100μM的DNA溶液，在4℃下保存备用；
进一步的，步骤1)中所述抛光处理后的金电极是指：金电极先依次用0.3mm和0.05mm的铝粉进行抛光处理，再依次放入体积比HNO3:H2O＝1:1的溶液、乙醇溶液和超纯水中，分别进行超声波清洗，超声清洗的时间分别为3-5min；
进一步的，步骤1)中蔗糖酶与巯基标记的基底DNA复合物的缓冲溶液是指：0.4mL20mg/mL蔗糖酶加入到含有20mM 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和5mM N-N-羟基琥珀酰亚胺的缓冲溶液中，4℃下培养1.5h-2h，再加入50μL 100μM氨基修饰的基底DNA缓冲溶液，在4℃下反应10h-12h，得到的蔗糖酶与基底DNA的复合物用Amicon-100K纯化，然后溶解在100μL PBS缓冲溶液，得到蔗糖酶与巯基标记的基底DNA复合物的缓冲溶液，备用。
进一步的，步骤1)中基底DNA序列为：
5'-SH-GGGCCTAGCGArAGGGCACGAGACACAGAGAGACAACACGTGCCCAAC-NH2-3'；
进一步的，步骤1)中的培养是指：室温下培养10h-12h；
进一步的，步骤1)中的清洗是指：用超纯水淋洗。
具体的，步骤2)为：将购买的适配体DNA溶解在磷酸盐PBS缓冲溶液中，得到浓度为1μM的适配体DNA缓冲溶液，在4℃下保存备用；
进一步的，步骤2)中适配体DNA的序列为：
5'-GTTGGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCC-3'；
进一步的，步骤2)中适配体DNA的缓冲溶液的用量为20μL；
进一步的，步骤2)中的培养是指：室温下培养1.5h-2h；
进一步的，步骤2)中的清洗是指：用超纯水淋洗。
具体的，步骤3)为：将购买的AFB1溶解在缓冲溶液中得到AFB1溶液，在4℃保存备用；
进一步的，步骤3)中AFB1的缓冲溶液的用量是20μL；
进一步的，步骤3)中的培养是指：室温下培养1.5h-2h；
进一步的，步骤3)中的清洗是指：用超纯水淋洗。
具体的，步骤4)所述Walker DNA缓冲溶液和铅离子溶液的混合液制备方法为：将购买的Walker DNA溶解在缓冲溶液中，得到浓度为1μM的缓冲溶液，在4℃下保存备用；将5μL浓度为5μM的铅离子溶液与20μL制备的1μM的Walker DNA缓冲溶液混合，即得。
进一步的，步骤4)中Walker DNA的序列为：
5'-TGTCTTGTGCTCCGAGCCGGTCGAAATCGCTAGGC-3'；
进一步的，步骤4)中Walker DNA缓冲溶液和铅离子溶液的混合液的用量为20μL；
进一步的，步骤4)中的培养是指：室温下1.5h-2h；
具体的，步骤5)为：将购买的蔗糖溶解在水中得到1.0M的蔗糖溶液，保存备用；
进一步的，步骤5)中蔗糖溶液的用量为20μL；
进一步的，步骤5)中的培养是指：室温下20min。
具体的，步骤6)中用的血糖仪和血糖仪试纸购买于德国罗氏诊断有限公司。
上述制备过程中所用的缓冲溶液均为磷酸盐缓冲溶液的pH为7.4，浓度为0.1M。
上述制备过程中所有的清洗都是用超纯水清洗。
本发明提供的一种基于DNA Walker的适配体传感器，采用上述方法制备得到。
本发明还提供的一种基于DNA Walker的适配体传感器检测AFB1的应用，检测方法为：
在上述传感器制备过程中，通过改变AFB1的浓度，得到不同含量的蔗糖酶溶液，加入足量的蔗糖溶液中，得到不同浓度的葡萄糖溶液，取得到的葡萄糖溶液滴在血糖仪试纸上，用血糖仪检测葡萄糖含量，得到不同浓度的AFB1相应的血糖仪信号，构建线性关系。
进一步的，AFB1的浓度分别为0.02,0.03,0.04,0.05,0.1,0.5,1,5和10nM；
进一步的，所述足量的蔗糖溶液浓度为1.0M；
进一步的，血糖仪和血糖仪试纸购买于德国罗氏诊断有限公司。
本发明中，先标记蔗糖酶的特定基底DNA通过金硫键固定在金电极表面，然后AFB1的适配体DNA与基底DNA互补配对。加入AFB1，AFB1与适配体DNA特异性结合脱离电极表面。再加入Walker DNA和铅离子Pb2+，通过DNA酶的切割和DNA Walking机器过程后，使得蔗糖酶标记的DNA被切割，脱离电极表面，溶液中的蔗糖在蔗糖酶存在的情况下转化成葡萄糖，从而被血糖仪检测，以此达到检测AFB1的目的，并且具有高的灵敏度和选择性。由于葡萄糖是由蔗糖经过蔗糖酶催化转化而来，而蔗糖酶与AFB1的浓度相关，也就是葡萄糖的量与AFB1的浓度有关。随着AFB1浓度的增加，葡萄糖的含量会随之增加，血糖仪的数值就会相应增大。因此，此传感器可对不同浓度的AFB1进行定量检测。
与现有技术相比，本传感器的制备方法，利用DNA的互补配对和适配体与配子的特异性结合，选择性高；DNA酶的特定位点剪切，使传感器的灵敏度得到提高；重要的是，血糖仪的使用，不同浓度的AFB1都能够数字化显示，使此传感器能够现场检测。
由于便携式、易操作、成本低等优点，本发明提供的方法可以使用在家庭食品污染方面的检测，对此，做了实样检测，结果令人满意。甚至改变识别元件，此传感器可以检测其他的分析物，所以本方法提供了一个分析平台用于检测离子、生物分子、生物标记物等。
附图说明
图1为基于DNA Walker的适配体传感器检测AFB1的示意图；
图2A为电极组装过程的电化学阻抗表征；
a为裸金电极；
b为基底DNA修饰的金电极；
c为双链DNA修饰的金电极；
d为基底DNA修饰的金电极；
e为剪切之后DNA片段修饰的金电极；
图2B为电极组装过程的循环伏安表征；
a线为裸金电极；
b线为双链DNA修饰的金电极；
c线为基底DNA修饰的金电极；
d线为剪切之后DNA片段修饰的金电极；
图2C为剪切过程的阻抗表征；
图2D为在存在和不存在AFB1的情况下血糖仪的响应图；
a线为存在AFB1；
b线为不存在AFB1；
图3为不同情况下血糖仪的响应图；
a栏为没有AFB1；
b栏为没有蔗糖酶；
c栏为没有Walker DNA；
d栏没有铅离子；
e栏全都有；
图4A为DNA酶剪切时间的优化图；
图4B为铅离子浓度的优化图；
图4C为AFB1培养时间的优化图；
图4D为缓冲溶液pH的优化图；
图5A为不同浓度的AFB1相应的血糖仪信号图；
图5B为不同浓度AFB1的对数相应的的血糖仪信号图；
图5C为不同干扰物相应的血糖仪信号图；
图5D为随时间变化相应的血糖仪信号图；
图6为发霉的(a,b,c)与干净的(d,e,f)三种面包图和相应的提取液。
具体实施方式
实施例1
一种基于DNA Walker的适配体传感器的制备方法，包括以下步骤：
(1)、配置0.1M，pH＝7.4的磷酸盐缓冲溶液，用于溶解DNA，蔗糖和蔗糖酶等。
(2)、将购买的基底DNA序列
(5'-SH-GGGCCTAGCGArAGGGCACGAGACACAGAGAGACAACACGTGCCCAAC-NH2-3')溶解在配制的0.1M磷酸盐缓冲溶液(pH 7.4)中得到浓度为100μM的基底DNA缓冲溶液，并在4℃下保存备用；将购买的适配体DNA
(5’-GTTGGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCC-3’)溶解在0.1M磷酸盐缓冲溶液(pH 7.4)中得到浓度为1μM的适配体DNA缓冲溶液，在4℃下保存备用；将购买的Walker DNA(5’-TGTCTTGTGCTCCGAGCCGGTCGAAATCGCTAGGC-3’)溶解在0.1M pH＝7.4磷酸盐缓冲溶液中得到浓度为1μM的Walker DNA缓冲溶液，并在4℃下保存备用。
(3)、金电极先依次用0.3和0.5mm的铝粉进行抛光处理，再依次放入体积比HNO3:H2O＝1:1溶液、乙醇溶液和超纯水中，分别进行超声波清洗，超声清洗的时间分别为3～5min，将抛光后的金电极浸泡在20μL蔗糖酶与巯基标记的基底DNA复合物的缓冲溶液，室温下培养10h，通过金硫键使基底DNA结合到电极表面；
所述蔗糖酶与巯基标记的基底DNA复合物的缓冲溶液制备方法为：0.4mL 20mg/mL蔗糖酶加入到含有20mM 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和5mM N-N-羟基琥珀酰亚胺的缓冲溶液中，4℃下培养1.5h-2h，再加入50μL 100μM氨基修饰的基底DNA缓冲溶液，在4℃下反应10h-12h，得到的蔗糖酶与基底DNA的复合物用Amicon-100K纯化，然后溶解在100μL PBS缓冲溶液，得到蔗糖酶与巯基标记的基底DNA复合物的缓冲溶液，备用。
(4)、将修饰了基底DNA的金电极浸泡在20μL浓度为1μM的适配体DNA缓冲溶液中，在室温下培养2h，得到双链修饰的金电极；
(5)、将得到的修饰双链的金电极浸入含有20μL 1μM AFB1的缓冲溶液中，室温下培养2h，用超纯水清洗，得到修饰了基底DNA的金电极；
(6)、将得到的修饰了基底DNA的金电极浸入含有20μL Walker DNA缓冲溶液和铅离子溶液混合液中，室温下培养2h，得到含有蔗糖酶的溶液；
所述Walker DNA缓冲溶液和铅离子溶液的混合液制备方法为：将购买的WalkerDNA溶解在缓冲溶液中，得到浓度为1μM的缓冲溶液，在4℃下保存备用；将5μL浓度为5μM的铅离子溶液与20μL制备的1μM的Walker DNA缓冲溶液混合，即得。
(7)、将得到的含有蔗糖酶的溶液加入20μL蔗糖溶液中，培养20min，得到含有葡萄糖的溶液；
(8)、将得到的含有葡萄糖的溶液滴在血糖仪试纸上，得到代表葡萄糖含量的数值。
实施例2
制备的基于DNA Walker适配体传感器用于检测AFB1可行性研究：
将实施例1中AFB1缓冲溶液的浓度定为0和0.3nM后，用血糖仪检测结果液，得到代表葡萄糖含量的数值。
组装过程中，电极表面分别用电化学阻抗(图2A)和循环伏安法表征(图2B),证明组装过程是成功的。剪切过程的电化学阻抗值的变化(图2C)和血糖仪响应信号(图2D)说明该实验是可行的。
实施例3
制备的适配体传感器检测AFB1控制实验：
在实施例1制备的传感器方法中，分别不加以下物质：a.AFB1；b.蔗糖酶；c.WalkerDNA；d.铅离子；e.全都有。其他条件相同，检测葡萄糖含量。
如图3，只有所以因子都存在的情况下，传感器才能检测AFB1。
实施例4
制备的适配体传感器检测AFB1优化条件：
在实施例1制备的适配体传感器方法中，改变DNA酶剪切的时间分别为20、40、60、80、100、120、140、160min，其他条件相同，检测葡萄糖含量。
在实施例1制备的适配体传感器方法中，改变铅离子浓度分别为1，2,3,4,5,6,7,8μM，其他条件相同，检测葡萄糖含量。
在实施例1制备的适配体传感器方法中，改变AFB1反应的时间分别为20、40、60、80、100、120、140、160min，其他条件相同，检测葡萄糖含量。
在实施例1制备的适配体传感器方法中，改变溶液的pH分别为5.4、5.9、6.4、6.9、7.4、7.9、8.4、8.9，其他条件相同，检测葡萄糖含量。
结果如图4A、4B、4C、4D所示，所以最有条件为：DNA酶剪切的时间是120min，铅离子浓度是5μM，AFB1反应的时间是120min，溶液的pH是7.4。
实施例5
根据实施例4探索的最优实验条件，改变实施例1中AFB1的浓度分别为0.02,0.03,0.04,0.05,0.1,0.5,1,5,10nM，分别检测结果液中的葡萄糖含量。如图5A,图5B，构建线性关系，实现对AFB1的检测。
实施例6
根据实施例4探索的最优试验条件，将实施例1中的AFB1分别替换为AFB2，AFG1，AFG2，AFM,DON,ZON等干扰物和AFB1与干扰物的混合物，检测结果液中的葡萄糖含量。另外，将传感器放置1,2,3,4,5,6,7,8,9,10天后，检测结果液中的葡萄糖含量。如图5C,5D,说明传感器具有很好的选择性和稳定性。相比于其他的检测方法，如表1，此传感器表现出有意的性能。
表1为不同方法检测AFB1的对比表
| 方法 | 线性范围 | 检测限 | 参考文献 |
| 荧光法 | 16pM-6.4nM | 16pM | 40 |
| 均相免疫传感法 | 190pM-16.01nM | 130pM | 41 |
| 电化学传感法 | 22.4pM-1.6nM | 6.4pM | 42 |
| 光学传感法 | 1600pM-64nM | 512pM | 43 |
| 荧光免疫法 | 32pM-16nM | 25.6pM | 44 |
| 电化学免疫传感法 | 320pM-3.2nM | 192pM | 45 |
| 电化学免疫传感法 | 320pM-38.4nM | 160pM | 46 |
| 竞争免疫法 | 32pM-64nM | 10.6pM | 47 |
| 适配体传感 | 20pM-10nM | 10pM | 本发明 |
实施例7
根据实施例4探索的最优试验条件，将实施例1中的AFB1分别替换为发霉的三种面包和干净的三种面包的提取液，采用标准加入法检测结果液中的葡萄糖含量。如图6和表2，说明传感器能灵敏的检测食品样品中的AFB1。表2为检测结果(干净的三种面包的提取液不含AFB1，故表2展示了发霉的三种面包)。
发霉面包的提取液提取方法：2g的面包样品浸入2mL甲醇中，震荡30min后，以3000rpm离心5min，经三次重复上面的提取过程中，所有的萃取剂进行收集并转移到5mL的离心管中，随后，溶液用甲醇稀释。
表2
本发明制备的传感器的灵敏度高；而且，利用血糖仪，不同浓度的AFB1都能够数字化显示，能够现场检测，更方便。
Claims (9)
1.一种基于DNA Walker的适配体传感器的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
1)将抛光处理后的金电极浸入蔗糖酶与巯基标记的基底DNA复合物的缓冲溶液中，培养，然后取出，清洗，得到修饰了基底DNA的金电极；
2)将步骤1)得到的修饰了基底DNA的金电极浸入适配体DNA的缓冲溶液，培养，清洗，得到双链修饰的金电极；
3)将步骤2)得到的修饰双链的金电极浸入AFB1的缓冲溶液中，培养，清洗，得到修饰了基底DNA的金电极；
4)将步骤3)得到的修饰了基底DNA的金电极浸入Walker DNA缓冲溶液和铅离子溶液的混合液中，培养，得到含有蔗糖酶的溶液；
5)将步骤4)得到的含有蔗糖酶的溶液加入蔗糖溶液中，培养，得到含有葡萄糖的溶液；
6)将步骤5)得到的含有葡萄糖的溶液滴在血糖仪试纸上，得到代表葡萄糖含量的数值；
步骤1)中蔗糖酶与巯基标记的基底DNA复合物的缓冲溶液是指：0.4mL 20mg/mL蔗糖酶加入到含有20mM 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和5mM N-N-羟基琥珀酰亚胺的缓冲溶液中，4℃下培养1.5h-2h，再加入50μL 100μM氨基修饰的基底DNA缓冲溶液，在4℃下反应10h-12h，得到的蔗糖酶与基底DNA的复合物用Amicon-100K纯化，然后溶解在100μL PBS缓冲溶液，得到蔗糖酶与巯基标记的基底DNA复合物的缓冲溶液，备用；
步骤1)中基底DNA序列为：
5'-SH-GGGCCTAGCGArAGGGCACGAGACACAGAGAGACAACACGTGCCCAAC-NH2-3'。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中适配体DNA的序列为：
5'-GTTGGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCC-3'。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤4)所述Walker DNA缓冲溶液和铅离子溶液的混合液制备方法为：将购买的Walker DNA溶解在缓冲溶液中，得到浓度为1μM的缓冲溶液，在4℃下保存备用；将5μL浓度为5μM的铅离子溶液与20μL制备的1μM的Walker DNA缓冲溶液混合，即得。
4.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤4)中Walker DNA的序列为：
5’-TGTCTTGTGCTCCGAGCCGGTCGAAATCGCTAGGC-3’。
5.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤4)中的培养是指：室温下1.5h-2h。
6.一种权利要求1-5任一项所制备的基于DNA Walker的适配体传感器。
7.一种权利要求6所述的基于DNA Walker的适配体传感器的应用，其特征在于，用于检测AFB1。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，检测方法为：
在传感器制备过程中，通过改变AFB1的浓度，得到不同含量的蔗糖酶溶液，加入足量的蔗糖溶液中，得到不同浓度的葡萄糖溶液，取得到的葡萄糖溶液滴在血糖仪试纸上，用血糖仪检测葡萄糖含量，得到不同浓度的AFB1相应的血糖仪信号，构建线性关系。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，AFB1的浓度分别为0.02,0.03,0.04,0.05,0.1,0.5,1,5和10nM。
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