CN112280831B - 一种基于DNA walker的电化学生物传感器的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物传感器技术领域，涉及一种基于DNA walker的电化学生物传感器的制备方法及其应用；首先将DNA walker‑AFB1适配体与发夹DNA1、发夹DNA2混合，滴加到金电极表面，反应后再滴加MCH，经常温孵育得到电化学生物传感器；然后，在其表面修饰AFB1，锚定探针1、短链DNA1和短链DNA 2的混合液，浸入亚甲基蓝溶液，通过测定传感器电流值，与AFB1浓度构建得到标准曲线；最后通过测定未知样品的电流值，代入构建的标准曲线，即可实现未知样品中AFB1的检测；本发明以极少量的目标物AFB1可以进行双重信号放大，得到更大的亚甲基蓝电化学信号，检测选择性好、速度快、灵敏度高。
Description
技术领域
本发明属于生物传感器技术领域，具体涉及一种基于DNA walker的电化学生物传感器的制备方法及其应用，可用于对真菌毒素黄曲霉毒素B1(AFB1)检测。
背景技术
黄曲霉毒素(AFs)是呋喃环类毒素，广泛存在于农业生产，加工和运输中。由于真菌毒素(例如AFs)具有很高的肝毒性和对人致癌性，因此被分类为I类人类致癌物。许多国家和世界组织对自动对焦提出了严格的要求，例如食品中AF的最大残留限量为15ng mL-1。其中黄曲霉毒素B1(AFB1)已被证实是极其危险的。并开发了许多公认的先进分析技术来检测AFB1，例如高效液相色谱-荧光检测(HPLC-FL)和酶联免疫吸附测定(ELISA)。但是，这些方法操作复杂，成本高，准确性不足或受存在假阳性结果的限制。因此，开发一种高效、灵敏的电化学传感平台是很有必要的。
电化学方法以其简单，快速响应和低成本等优点而受到了广泛的关注。已经构建了用于灵敏检测AF的各种电化学传感器，例如用于AFB1分析的基于多功能DNA纳米管的电化学传感器，以及通过常规电化学方法相结合的双模式传感器；但是由于单信号输出容易受环境因素的影响，而且灵敏度和精确度不足。
为了顺应真菌毒素检测更灵敏更精准的宗旨，我们构建了一种基于DNA walker这种分子步行机器实现电化学信号放大的适配体传感器用于高灵敏检测黄曲霉毒素B1。
发明内容
本发明旨在提供一种检测速度快，灵敏度高的电化学检测器件，用于直接检测AFB1。本发明使用DNA链在电极表面的自组装过程，目标物的出现启动DNA链的自组装行走过程，并在第一次放大的基础上，进行杂交链式反应进行DNA链的扩增，扩增后的产物为长双链DNA，可以吸附大量的信号分子亚甲基蓝，通过交流循环伏安法进行分析检测，获取被两次放大后的电化学信号，用于检测黄曲霉毒素B1。
通过如下技术方案实现本发明的目的：
本发明首先提供一种基于DNA walker的电化学生物传感器的制备方法，步骤如下：
(1)首先将DNA walker溶液和AFB1适配体溶液混合，得到的混合溶液于一定温度的水浴条件下进行反应，水浴反应后冷却至室温，得到DNA walker-AFB1适配体溶液；
(2)取步骤(1)制备的DNA walker-AFB1适配体溶液与发夹DNA1溶液和发夹DNA2溶液混合，得到混合溶液，记为混合溶液A；取混合溶液A滴加到Au电极表面，固定反应一段时间；依靠DNA末端修饰的-SH，利用Au-S键结合作用力，将三种DNA链固定在电极表面；
然后再将巯基己醇(MCH)滴加到Au电极表面，常温孵育一段时间，得到基于DNAwalker的电化学生物传感器。
进一步地，步骤(1)中，所述DNA walker溶液的浓度为0.1μM，AFB1适配体溶液的浓度为0.15μM；所述水浴条件的温度为90-95℃，反应时间为5min。
进一步地，步骤(2)中，所述混合溶液A中DNA walker-AFB1的最终浓度为0.1μM，发夹DNA1的最终浓度为0.5-10μM、发夹DNA2的最终浓度为0.5-10μM。
优选的，所述发夹DNA1的最终浓度为5μM，发夹DNA2的最终浓度为5μM。
进一步地，步骤(2)中，所述混合溶液A滴加到Au电极表面的用量为6μL；所述固定反应一段时间为12h；所述巯基己醇的浓度为1mM，滴加到Au电极表面的用量为8μL；所述常温孵育一段时间为30-80min。
优选的，所述常温孵育一段时间为60min。
本发明还涉及一种基于DNA walker的电化学生物传感器检测黄曲霉毒素B1的用途，步骤如下：
(1)取多个上述步骤中已经构建的电化学生物传感器，在其表面分别修饰不同浓度V1体积的AFB1溶液，常温孵育一段时间，得到已完成识别检测的电化学生物传感器界面；一个浓度的AFB1溶液对应修饰一个电化学生物传感器，浓度和电化学生物传感器呈一一对应关系；
(2)然后，将锚定探针1溶液、短链DNA1溶液、短链DNA 2溶液混合，得到混合溶液B，再取混合溶液B分别修饰到步骤(1)中已完成识别检测的电化学生物传感器表面进行反应；反应后，将电化学生物传感器分别浸泡在亚甲基蓝溶液中，浸泡一段时间，得到浸泡处理的电化学生物传感器；
(3)用三电极体系(Au工作电极，Pt对电极，Ag/AgCl参比电极)在CHI852D电化学工作站上选择交流伏安法(ACV)检测步骤(2)中浸泡处理的电化学生物传感器界面的电流，传感器表面由于吸附的大量亚甲基蓝，交流伏安法测量表面吸附的亚甲基蓝在氧化还原过程中产生的电流强度；电流强度与AFB1溶液的浓度正相关，每一个浓度的AFB1会对应一个电流值，根据电流值和AFB1浓度的对数构建得到标准曲线；
(4)样品中AFB1的检测：将样品处理后得到样品液，修饰V1体积的样品液于传感器表面，常温孵育后按照步骤(2)进行操作，然后测定电流值；将电流值代入步骤(3)构建的标准曲线，即可获知样品中AFB1的浓度；实现未知样品中黄曲霉毒素B1检测的用途。
进一步地，步骤(2)中，所述AFB1溶液的浓度为0.01-10pg mL-1，修饰的用量为6μL；所述常温孵育一段时间为30-80min。
优选的，所述常温孵育一段时间为60min。
进一步地，步骤(2)中，所述锚定探针1溶液、短链DNA1溶液和短链DNA 2溶液的体积比为1:1:1；所述混合溶液B中锚定探针1溶液最终浓度为0.1μM，短链DNA1溶液的最终浓度为5μM，短链DNA2溶液的最终浓度为5μM；所述混合溶液B修饰到电化学生物传感器表面的用量为8μL；所述反应的时间为60-120min。
优选的，所述反应的时间为100min。
进一步地，步骤(2)中，所述亚甲基蓝溶液的浓度为1μM；所述浸泡一段时间为10-20分钟。
进一步地，步骤(4)中，所述常温孵育的时间为30-80min。
进一步地，步骤(1)和(4)中V1修饰的体积为6μL。
本发明的有益效果：
(1)本发明的电化学生物传感器构筑简单，无毒。
(2)本发明利用DNA自组装过程高效，准确的特性构建了一个可以在电极表面依次进行DNA自组装行走和DNA杂交链式反应的传感器。
(3)本发明利用DNA双链可以高效吸附亚甲基蓝小分子这种电化学探针的特性，实现了电化学信号的双重放大，有效提高了检测的灵敏度。
附图说明
图1为本发明电化学生物传感器的检测机理图。
图2为本发明电化学生物传感器可行性验证的结果图。
图3中(A)图为DNA walker溶液浓度、发夹DNA溶液浓度比值与电流强度的关系图；(B)图为DNA walker行走时长与电流强度的关系图；(C)图为杂交链式反应时间与电流强度的关系图。
图4为本发明电化学生物传感器与AFB1浓度的线性关系图。
具体实施方式：
下面结合附图对本发明的实施例作详细说明：实施例在本发明的技术方案为前提下进行，给出了详细实施步骤和具体操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
本发明所提及的试剂：DNA walker溶液、AFB1适配体溶液、发夹DNA1溶液、发夹DNA2溶液、巯基己醇、AFB1溶液、锚定探针1溶液、短链DNA1溶液、短链DNA 2溶液均购买自上海生物工程公司。
本发明所用的电极体系基于传统三电极体系：1.金工作电极2.铂丝对电极3.银/氯化银参比电极；
(1)本发明制备的电化学生物传感器用于AFB1检测的可行性探究；
具体方法操作为：设置三组实验，分别为无目标物AFB1，有目标物AFB1但不加入杂交链式反应锚定探针1溶液,有目标物且加入锚定探针1溶液，此三组实验分别记为组A、组B、组C。
组A操作为：将最终浓度为0.1μM的DNA walker，5μM的发夹DNA 1，5μM的发夹DNA2，混合溶液共6μL修饰到金电极表面在4℃孵育12h。然后，用8μL，1mM巯基己醇滴在电极表面，封闭Au活性位点。在室温下封闭1h。不加入目标物，加入8μL，1μM锚定探针1，5μM短链DNA1，5μM短链DNA2混合溶液用于进行杂交链式反应。反应时长为120min。杂交链式反应的电极浸入1μM亚甲基蓝溶液中，吸附亚甲基蓝分子20分钟。在CHI852D电化学工作站上选择交流伏安法(ACV)检测传感器界面的电流，传感器表面由于吸附的大量亚甲基蓝，交流伏安法测量表面吸附的亚甲基蓝在氧化还原过程中产生的电流强度，通过电流强度反映传感器界面反应的进行程度。
组B操作为：将最终浓度为0.1μM的DNA walker，5μM的发夹DNA1，5μM的发夹DNA 2，混合溶液共6μL修饰到金电极表面在4℃孵育12h。然后用8μL，1mM巯基己醇滴在电极表面，封闭Au活性位点。在室温下封闭1h。加入1pg mL-1目标物AFB1，加入8μL，5μM短链DNA1，5μM短链DNA2混合溶液用于进行杂交链式反应。反应时长为100min。杂交链式反应的电极浸入1μM亚甲基蓝溶液中，吸附亚甲基蓝分子20分钟。与组A同样检测电流强度。
组C的操作为：将最终浓度为0.1μM的DNA walker，5μM的发夹DNA 1，5μM的发夹DNA2,混合溶液共6μL修饰到金电极表面在4℃孵育12h。然后用8μL，1mM巯基己醇滴在电极表面，封闭Au活性位点。在室温下封闭1h。加入1pg mL-1目标物AFB1，加入8μL 1μM锚定探针1、5μM短链DNA1和5μM短链DNA2混合溶液用于进行杂交链式反应。反应时长为120min。杂交链式反应的电极浸入1μM亚甲基蓝溶液中，吸附亚甲基蓝分子20分钟。按组A、B同样方法获得电流。根据三组对照实验的结果通过图2可以看出有目标物且进行二次放大后MB信号相较无目标物和有目标物但不进行二次放大有显著增强，证明该传感器可以进行电化学信号的二次放大实现对AFB1的检测。
(2)DNA walker溶液浓度、发夹DNA溶液浓度比值；
优化DNA walker和发夹DNA1、2的浓度比，将浓度比为1:5、1:10、1:20、1:50、1:80、1:100DNA walker和发夹DNA1、2混合溶液共6μL修饰到金电极表面4℃孵育12h。然后用8μL，1mM巯基己醇滴在电极表面，封闭Au活性位点。在室温下封闭1h。加入1pg mL-1目标物AFB1，加入8μL 1μM锚定探针1，5μM短链DNA1，5μM短链DNA2混合溶液用于进行杂交链式反应。反应时长为120min。杂交链式反应的电极浸入1μM亚甲基蓝溶液中，吸附亚甲基蓝分子20分钟。在CHI852D电化学工作站上选择交流伏安法(ACV)检测传感器界面的电流，传感器表面由于吸附的大量亚甲基蓝，交流伏安法测量表面吸附的亚甲基蓝在氧化还原过程中产生的电流强度，通过电流强度反映传感器界面反应的进行程度。
通过图3中A图可以看出DNA walker和发夹DNA1、2的浓度比为1:50时电化学信号响应最强，因此选择1:50作为浓度比。
(3)DNA walker行走时长的优化；
优化DNA行走时长，将浓度比为1:50DNA walker和发夹DNA1、2混合溶液共6μL修饰到金电极表面4℃孵育12h。然后用8μL，1mM巯基己醇滴在电极表面，封闭Au活性位点。在室温下封闭1h。加入1pg mL-1目标物AFB1，加入8μL，1μM锚定探针1，5μM短链DNA1，5μM短链DNA2混合溶液用于进行杂交链式反应。反应时长为120min。杂交链式反应的电极浸入1μM亚甲基蓝溶液中，吸附亚甲基蓝分子20分钟。在CHI852D电化学工作站上选择交流伏安法(ACV)检测传感器界面的电流，传感器表面由于吸附的大量亚甲基蓝，交流伏安法测量表面吸附的亚甲基蓝在氧化还原过程中产生的电流强度，通过电流强度反映传感器界面反应的进行程度。加入待测AFB1后分别反应30、40、50…80分钟，再进行二次放大。
通过图3中B图可以看出DNA行走时长为60分钟时电化学信号响应已达到饱和，因此选择60分钟作为DNA自组装过程的时长。
(4)杂交链式反应时间的优化；
优化杂交链式反应时长，将浓度比为1:50DNA walker和发夹DNA1、2混合溶液共6μL修饰到金电极表面4℃孵育12h。然后用8μL，1mM巯基己醇滴在电极表面，封闭Au活性位点。在室温下封闭1h。加入1pg mL-1目标物AFB1，加入8μL 1μM锚定探针1，5μM短链DNA1，5μM短链DNA2混合溶液用于进行杂交链式反应。反应时长分别为40、60、80…140min。杂交链式反应的电极浸入1μM亚甲基蓝溶液中，吸附亚甲基蓝分子20分钟。在CHI852D电化学工作站上选择交流伏安法(ACV)检测传感器界面的电流，传感器表面由于吸附的大量亚甲基蓝，交流伏安法测量表面吸附的亚甲基蓝在氧化还原过程中产生的电流强度，通过电流强度反映传感器界面反应的进行程度。
通过图3中C图可以看出杂交链式反应时长为100分钟时杂交链长度已达到饱和，因此选择100分钟作为DNA杂交链式反应过程的时长。
实施例1：
(1)将浓度为0.1μM的DNA walker溶液，5μM的发夹DNA1溶液，5μM的发夹DNA2溶液，得到的混合溶液在95℃水浴条件下反应时间为5min，水浴反应后冷却至室温，得到DNAwalker-AFB1适配体溶液；
(2)然后将DNA walker-AFB1适配体溶液与发夹DNA1溶液和发夹DNA2溶液混合，得到混合溶液A；再将混合溶液A共6μL修饰到金电极表面在4℃孵育12h；用浓度为1mM巯基己醇(MCH)共8μL滴加到Au电极表面，封闭未与步骤一中DNA链结合的Au活性位点，在室温下封闭1h，得到基于DNA walker的电化学生物传感器；
(3)取4个上述步骤中已经构建的电化学生物传感器，在其表面分别修饰浓度为0.01pg mL-1,0.1pg mL-1,1pg mL-1,10pg mL-1AFB1溶液，常温孵育60min，得到已完成识别检测的电化学生物传感器界面；一个浓度的AFB1溶液对应修饰一个电化学生物传感器，浓度和电化学生物传感器呈一一对应关系；
(4)然后，将锚定探针1溶液、短链DNA1溶液、短链DNA2溶液按体积比为1:1:1混合，得到混合溶液B，混合溶液B中锚定探针1溶液最终浓度为0.1μM，短链DNA1溶液的最终浓度为5μM，短链DNA2溶液的最终浓度为5μM；
再取混合溶液B分别修饰到步骤(3)中已完成识别检测的电化学生物传感器表面进行反应100min；反应后，将电化学生物传感器分别浸泡在浓度为1μM亚甲基蓝溶液中，浸泡20分钟，得到浸泡处理的电化学生物传感器；
(5)用三电极体系(Au工作电极，Pt对电极，Ag/AgCl参比电极)在CHI852D电化学工作站上选择交流伏安法(ACV)检测步骤(4)中浸泡处理的电化学生物传感器界面的电流，传感器表面由于步骤三中吸附的大量亚甲基蓝，交流伏安法测量表面吸附的亚甲基蓝在氧化还原过程中产生的电流强度；电流强度与AFB1溶液的浓度正相关，每一个浓度的AFB1会对应一个电流值，根据电流值和AFB1浓度的对数构建得到标准曲线；
计算标准液中AFB1浓度CAFB1与电流强度IMB的线性回归方程，方程公式为IMB＝3.04422+0.18661LogCAFB1作为实际检测中的线性方程。
通过图4可以看出提出的传感策略，针对AFB1检测的线性范围为0.01pg mL-1到10pg mL-1，跨越3个数量级。
(6)花生样品检测：将5g花生样品磨碎浸泡在含有5mL甲醇，15mL超纯水的混合溶液中，震荡1.5小时，之后在6000转离心10分钟，取上清液作为花生样品提取液。加入1pgmL-1AFB1进行检测，并代入图四中的线性回归方程中，获得其检测回收率，具体如表1所示。
表1：花生样品中AFB1的检测回收率
通过表1可以看出，本实施例进行双重放大的电化学信号可以灵敏定量检测待测样品中的AFB1，不需要专业培训，操作简便。
说明：以上实施例仅用以说明本发明而并非限制本发明所描述的技术方案；因此，尽管本说明书参照上述的各个实施例对本发明已进行了详细的说明，但是本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换；而一切不脱离本发明的精神和范围的技术方案及其改进，其均应涵盖在本发明的权利要求范围内。
Claims (6)
1. 一种基于DNA walker的电化学生物传感器检测黄曲霉毒素B1的用途，其特征在于，步骤如下：
（1）首先将DNA walker溶液和 AFB1适配体溶液混合，得到的混合溶液于一定温度的水浴条件下进行反应，水浴反应后冷却至室温，得到DNA walker-AFB1适配体溶液；所述DNAwalker溶液的浓度为0.1μM，AFB1适配体溶液的浓度为0.15μM；所述水浴条件的温度为90-95℃，反应时间为5min；
（2）取步骤（1）制备的 DNA walker-AFB1适配体溶液与发夹DNA1溶液和发夹DNA2 溶液混合，得到混合溶液，记为混合溶液A，混合溶液A中DNA walker-AFB1的最终浓度为0.1μM，所述发夹DNA1的最终浓度为5μM，发夹DNA2的最终浓度为5μM；取混合溶液A滴加到Au电极表面，固定反应一段时间；依靠DNA末端修饰的-SH，利用Au-S键结合作用力，将三种DNA链固定在电极表面；
然后再将巯基己醇滴加到Au电极表面，常温孵育一段时间，得到基于DNA walker的电化学生物传感器；
（3）取多个上述步骤中已经构建的电化学生物传感器，在其表面分别修饰不同浓度V1体积的AFB1溶液，常温孵育一段时间，得到已完成识别检测的电化学生物传感器界面；一个浓度的AFB1溶液对应修饰一个电化学生物传感器，浓度和电化学生物传感器呈一一对应关系；
（4）然后，将锚定探针1溶液、短链DNA1溶液、短链DNA 2溶液混合，得到混合溶液B，再取混合溶液B分别修饰到步骤（3）中已完成识别检测的电化学生物传感器表面进行反应；反应后，将电化学生物传感器分别浸泡在亚甲基蓝溶液中，浸泡一段时间，得到浸泡处理的电化学生物传感器；
（5）用三电极体系：Au工作电极，Pt对电极，Ag/AgCl参比电极，在CHI852D电化学工作站上选择交流伏安法检测步骤（4）中浸泡处理的电化学生物传感器界面的电流，传感器表面由于吸附的大量亚甲基蓝，交流伏安法测量表面吸附的亚甲基蓝在氧化还原过程中产生的电流强度；电流强度与AFB1溶液的浓度正相关，每一个浓度的AFB1会对应一个电流值，根据电流值和AFB1浓度的对数构建得到标准曲线；
（6）样品中AFB1的检测：将样品处理后得到样品液，修饰V1体积的样品液于传感器表面，常温孵育后按照步骤（4）进行操作，然后测定电流值；将电流值代入步骤（5）构建的标准曲线，即可获知样品中AFB1的浓度；实现未知样品中黄曲霉毒素B1检测的用途。
2. 根据权利要求1所述的用途，其特征在于，步骤（2）中，所述混合溶液A滴加到Au电极表面的用量为6μL，所述固定反应一段时间为12h，所述巯基己醇的浓度为1mM，滴加到Au电极表面的用量为8μL，所述常温孵育一段时间为30-80 min。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，步骤（2）中，所述常温孵育一段时间为60min。
4. 根据权利要求1所述的用途，其特征在于，步骤（3）中，所述AFB1溶液的浓度为0.01-10 pg mL-1，所述常温孵育一段时间为30-80 min；步骤（4）中，所述锚定探针1溶液、短链DNA1溶液和短链DNA 2溶液的体积比为1:1:1，所述混合溶液B中锚定探针1溶液最终浓度为0.1μM，短链DNA1溶液的最终浓度为5μM，短链DNA2溶液的最终浓度为5μM，所述混合溶液B修饰到电化学生物传感器表面的用量为8μL，所述反应的时间为60-120min，所述亚甲基蓝溶液的浓度为1μM，所述浸泡一段时间为10-20分钟。
5. 根据权利要求4所述的用途，其特征在于，步骤（3）中，所述常温孵育一段时间为60min；步骤（4）中，所述反应的时间为100 min。
6. 根据权利要求1所述的用途，其特征在于，步骤（6）中，所述常温孵育的时间为30-80min；步骤（3）和（6）中V1修饰的体积为6 μL。
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