CN109470761B - 一种用于玉米赤霉烯酮zen检测的电化学dna适体传感器及检测zen的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种PEI‑MoS₂‑MWCNTs纳米复合材料和Pt@Au核‑壳微球颗粒，还公开了一种用于ZEN检测的电化学DNA适体传感器，由以下方法制备得到：1)用TES缓冲液处理ZEN适体备用；2)将金电极抛光成镜面，处理电极，干燥备用；3)将电极电化学活化，水冲洗，干燥；4)将PEI‑MoS₂‑MWCNTs溶液滴加到金电极表面上，干燥，将Tb溶液滴加到电极上；5)将Pt@Au核‑壳溶液滴加到电极表面，室温干燥；6)取ZEN结合适体滴加在电极上室温孵育；7)将MCH孵育在电极表面，即得。还公开了采用该传感器检测ZEN的方法。

Description

一种用于玉米赤霉烯酮ZEN检测的电化学DNA适体传感器及检 测ZEN的方法

技术领域

本发明涉及电化学检测技术领域，具体涉及一种纳米复合材料、ZEN电化学适体传感器的制备方法及检测方法。

背景技术

玉米赤霉烯酮(ZEN)是一种非甾体雌激素霉菌毒素，也被称为F-2毒素，是镰刀菌真菌的次级代谢产物。玉米，小麦，燕麦和大麦等作物在贮藏期间易受镰刀菌污染从而产生ZEN。 ZEN在食品或饲料加工过程中均不易被破坏，是世界上污染范围最广的镰刀菌毒素之一。研究发现ZEN还可以在某些谷物副产品中检测到，如面粉，啤酒，牛奶和婴儿食品。人们长时间食用含有玉米赤霉烯酮污染的食品，可能导致各种急慢性疾病，对人体健康造成威胁，引起生殖毒性，以及细胞毒性，免疫毒性和致癌的影响。在大多数国家和地区，对ZEN的最大残留水平有不同的规定。2007年欧盟规定了谷物和玉米中ZEN的含量分别不能超过0.1mg/kg和0.35mg/kg。我国颁布的《饲料卫生标准》(GB13078.2-2006)中规定玉米类饲料ZEN最大含量为500μg/kg《食品中真菌毒素限量》(GB2761-20110)中规定小麦中ZEN含量不得超过60μg/kg。

目前，常用的传统ZEN检测方法包括高效液相色谱(HPLC)，气相色谱质谱(GC-MS)，薄层色谱(TLC)和免疫学检测方法。但是这些方法所需设备价格昂贵，操作复杂，或信号响应时间较长，实验条件要求严苛等缺点限制其用来快速检测微量ZEN。因此，设计高选择性、准确、快速、便捷的方法检测ZEN十分必要。

适体(Aptamer)，是利用指数富集的配体系统进化(SELEX)技术从大量的核酸分子库中筛选得到的含有10-50个可变碱基的单链DNA(ssDNA)或RNA。与抗体相比，适体具有多种优势，如对广泛的靶标(如全细胞，蛋白质和低分子量有机或无机底物)具有高亲和力和高特异性，以及成本低，稳定性好，易于合成和被各种化学基团的修饰。因此，作为理想的识别元件，适体一直被用于电化学传感器构建中，得到的电化学适体传感器具有的高灵敏度、快响应、低成本的特点。

新型纳米材料的使用是一种传感器信号放大的有效策略，纳米复合物在维持碳纳米管原有优点的基础上，进一步增加其活性比表面积和导电性。羧化多壁碳纳米管(MWCNT)可与聚乙烯亚胺(PEI)功能化的MoS₂结合以形成均匀且稳定的复合物。一方面，PEI-MoS₂可有效抑制MWCNTs的团聚和缠结现象，从而增加MWCNTs的有效表面积，有利于充分发挥其优异的物理化学性能；另一方面，MWCNTs和MoS₂的协同效应可以进一步提高电子转移效率，使复合材料具有更好的电催化能力。

发明内容

针对上述问题，本发明一方面提供了一种PEI-MoS2-MWCNTs纳米复合材料，由如下步骤制备得到：1)制备PEI-MoS₂分散液；2)将羧基化多壁碳纳米管加入步骤1)制得的PEI-MoS₂分散液中，然后在室温下搅拌12h，离心、洗涤，再将沉淀物分散在超纯水中，即得到PEI-MoS₂-MWCNTs纳米复合材料溶液。

在上述技术方案中，所述步骤1)中PEI-MoS₂分散液的制备方法为：将20mg二硫化钼加入10mL乙醇中，超声分散均匀，在室温下搅拌，然后滴加20mL 1wt％PEI水溶液到二硫化钼分散液中，在室温下继续搅拌2h后，得到PEI-MoS₂分散液。

本发明另一方面提供了一种Pt@Au核-壳微球溶液，由如下步骤制备得到：

1)制备纳米金溶胶；

2)Pt@Au核-壳微球颗粒：将步骤1)制备的20mL纳米金溶胶加入30mL超纯水，加热至80℃，快速加入2.5mL 1％H₂PtCl₆溶液，剧烈搅拌，然后滴加抗坏血酸，得到黑色溶液，将混合溶液加热回流直到溶液颜色不变，冷却至室温，得到Pt@Au核-壳微球溶液。

在上述技术方案中，所述步骤1)制备纳米金溶胶的方法为：将100mL 0.01％HAuCl₄溶液加热至沸腾后，快速加入2.5mL 1％柠檬酸三钠溶液，溶液颜色将由蓝色变为红色，继续煮沸15min，冷却后用超纯水重新定容至原体积，得到透明的酒红色溶液纳米金溶胶。

本发明另一方面提供了一种用于ZEN检测的电化学DNA适体传感器，由以下方法制备得到，该方法包括以下步骤：

1)用TES缓冲液室温下处理巯基标记的ZEN结合适体，储存备用；

2)分别用0.3μm和0.05μm的Al₂O₃粉末将金电极抛光呈镜面，然后分别按超纯水、无水乙醇、超纯水的顺序超声处理电极，干燥备用；

3)将步骤2)得到的电极在0.5M H₂SO₄中进行电化学活化，然后用超纯水冲洗，干燥；

4)将18μL前述的PEI-MoS2-MWCNTs溶液滴加到步骤3)清洁的金电极表面上，室温干燥，然后将10μL Tb溶液滴加到电极上，在室温下避光孵育16h；

5)将3μL前述的Pt@Au核-壳微球溶液滴加到步骤4)得到的电极上，室温干燥；

6)将步骤1)制得的ZEN结合适体，滴加在步骤5)制备得到的电极上室温孵育16h；

7)将20μL 1mM MCH溶液滴加到步骤6)得到的电极上，在4℃下孵育50min，即得到用于ZEN检测的电化学DNA适体传感器。

本发明另一方面提供了一种利用电化学DNA适体传感器检测ZEN的方法，包括如下步骤：

1)向上述的适体传感器的电极上滴加不同浓度的目标物玉米赤霉烯酮；

2)将电极置于0.1M PBS溶液中进行表征，测量其电流变化值；

3)根据步骤2)所得电流变化值与ZEN浓度对数值的线性关系，绘制工作曲线；

4)将待测样品用上述的适体传感器检测，将得到的电流值通过步骤3)制得的工作曲线计算得到待测样品的ZEN浓度。

本发明首先制备了聚乙烯亚胺功能化二硫化钼掺杂多壁碳纳米管(PEI-MoS₂-MWCNTs) 复合纳米材料作为传感器的敏感界面，利用多壁碳纳米管和MoS₂较大的比表面积和较高的导电性特征在提高甲苯胺蓝(Tb)固载量的同时促进Tb与电极之间的电子传递；然后将铂金纳米核壳颗粒用于固载巯基标记的单链ZEN适体，最后通过适体与不同浓度目标物的特异性结合引起电化学信号的不同变化，来实现对ZEN的定量检测。所制备的电化学适体传感器成功用于ZEN的超灵敏检测。与传统的ZEN检测方法相比，本发明的优点在于灵敏度高，特异性强，检测迅速，操作方便，设备材料价格低廉，无污染，从而为玉米赤霉烯酮的检测提供了新的分析方法。

本发明的有益效果是：

1)通过聚乙烯亚胺功能化的MoS₂掺杂MWCNTs，极大地改善了MWCNTs的水溶性，使复合纳米材料均匀地铺展在电极表面。

2)利用MWCNTs和MoS₂较大的比表面积和较高的导电性特征在提高甲苯胺蓝(Tb)固载量的同时促进Tb与电极之间的电子传递，电化学传感器信号放大，提高检测灵敏度。

3)适体用于目标物的识别具有高度的特异性，可提高传感器的选择性，从而为微量ZEN 的检测提供了新的研究方向和分析方法。

4)涉及的材料均可在实验室条件下合成，操作简单，原材料价格低廉，每次使用量极少，降低了实验成本。

5)整个检测分析方法步骤清晰简便，灵敏度高，信号响应迅速。

6)本方法制备的电化学适体传感器可为玉米赤霉烯酮的检测提供新方法；该发明所制备的电化学适体传感器也可应用于临床疾病诊断、生物样本测定、食品药品的分析检测和环境的监测等方面。

附图说明

图1是本发明电化学适体传感器构建和检测原理示意图。

图2是不同修饰电极在0.1M PBS(pH 7.0)中以100mV/s的扫描速率得到的循环伏安表征图。

图3是不同浓度的ZEN通过本发明传感器检测的结果，其中，图A为在0.1M PBS(pH7.0)中传感器分别对0，0.0005，0.005，0.05，0.5，5和50ng/mL的ZEN扫描的循环伏安图；图B为传感器电流响应值与不同浓度ZEN对数值的校准曲线。

图4是0.5ng/mL ZEN孵育的传感器在连续扫描60圈循环伏安曲线后得到的稳定性检测图。

图5是ZEN适体传感器的特异性检测图，其中，干扰物为0.5ng/mL的α-ZAL，β-ZAL，β-ZOL，OTA and aflatoxin mixture。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，但并不因此而限制本发明。

本发明实施例中用到的主要化学试剂如下：

玉米赤霉烯酮(ZEN)，甲苯胺蓝(Tb)，抗坏血酸(AA)和6-氯-1-己醇(MCH)购自J&KScientific Ltd(中国北京)。α-玉米赤霉醇(α-ZAL)，β-玉米赤霉醇(β-ZAL)，β- 玉米赤霉烯醇(β-ZOL)的标准品购自Dr.Ehrenstorfer GmbH(德国奥格斯堡)。赭曲霉毒素 A(OTA)和黄曲霉毒素混合物的标准品购自o2si smart solutions Co(USA)。多壁碳纳米管 (MWCNT)购自南京先锋纳米有限公司(中国南京)。二硫化钼(MoS₂)，氯金酸(HAuCl₄)，氯铂酸(H₂PtCl₆)购自Sigma(USA)。聚乙烯亚胺(PEI)购自Alfa Aesar Co(USA)。

ZEN结合适体(ZBA)的DNA寡核苷酸序列：5’-TCATCTATCTATGGTACATTACTATCTGTAATGTGATATG-(CH₂)6-SH-3’由上海生工有限公司合成。

所用设备及技术参数：

仪器：用CHI 660E电化学工作站(中国上海辰华仪器)进行循环伏安法(CV)测定。电化学检测采用三电极系统：修饰后的金电极(直径4mm)作为工作电极，铂丝作为对电极，饱和甘汞电极(SCE)作为参比电极。pH计监测pH值(MP 230，Mettler-Toledo，瑞士)。三电极系统0.1M PBS(PH 7.0)中以100mV/s的扫描速率从-0.6～0.2V的循环伏安法(CV)。

实施例1制备PEI-MoS₂-MWCNTs纳米复合材料

按照如下步骤操作：

1)将20mg二硫化钼加入10mL乙醇中，超声分散均匀，在室温下搅拌，然后滴加20mL1wt％聚乙烯亚胺水溶液到二硫化钼分散液中，在室温下继续搅拌2h后，得到PEI-MoS₂分散液。

2)将羧基化多壁碳纳米管加入步骤1)制得的PEI-MoS₂分散液中，然后在室温下搅12h，最后以10000r/min离心、水洗3次后，再将沉淀物分散在5mL超纯水中，即得到2mg/mLPEI-MoS₂-MWCNTs纳米复合材料溶液。

实施例2制备Pt@Au核-壳微球溶胶

按照如下步骤操作：

1)纳米金溶胶(AuNPs，直径约13nm)，制备方法如下：将100mL 0.01％HAuCl₄溶液加热至沸腾后，快速加入2.5mL 1％柠檬酸三钠溶液，溶液颜色将由蓝色变为红色，继续煮沸 15min。冷却至室温后，用超纯水重新定容至原体积，得到透明的酒红色纳米金溶胶。

2)Pt@Au核-壳微球颗粒(Pt@AuNPs)：将上述制备的纳米金溶胶20mL加入30mL超纯水中，加热至80℃，快速加入2.5mL 1％H₂PtCl₆溶液，然后滴加1.75mL 1％抗坏血酸(AA)，然后溶液迅速变黑。将混合溶液加热回流直到溶液颜色不变，然后冷却至室温，得到Pt@Au核-壳微球溶液。

实施例3制备用于ZEN检测的电化学DNA适体传感器

按照如下步骤操作：(构建原理如图1所示)

1)用10mM的TES溶液室温下处理巯基标记的ZEN结合适体(ZBA)的DNA单链，置于4℃下备用。

2)分别用0.3μm和0.05μm的Al₂O₃粉末将金电极(AuE)抛光成镜面，然后分别按超纯水、无水乙醇、超纯水的顺序超声处理电极各5min，室温干燥备用。

3)将步骤2)得到的电极在0.5M H₂SO₄中进行电化学活化，电位扫描为0.2～1.6V，直至获得可稳定的循环伏安图，然后再次用超纯水冲洗并在空气中干燥。

4)将18μL实施例1中制备得到的PEI-MoS₂-MWCNTs溶液滴加到步骤3)清洁的金电极表面上，并在室温下空气干燥；然后，将10μL Tb溶液滴加到电极上，避光室温下孵育16h。

5)将3μL实施例2中制备得到的Pt@Au核-壳微球溶液滴到步骤4)得到的电极表面上，用于固载与玉米赤霉烯酮结合的适体(ZBA)，室温干燥。

6)取20μL步骤1)制得的2μM的ZBA滴加在步骤5)制备得到的电极上室温孵育16h。

7)将20μL 1mM MCH溶液滴加到步骤6)得到的电极上，在4℃下孵育50min，以封闭剩余的非特异性结合位点，即得到用于ZEN检测的电化学DNA适体传感器。所得到的适体传感器和所有材料及试剂在不使用时储存于4℃。

实施例4利用电化学DNA适体传感器检测ZEN

利用实施例3构建的电化学DNA适体传感器检测ZEN，按照如下步骤操作：

一、绘制工作曲线

1)将实施例3步骤3)至步骤7)的修饰电极分别置于含0.1M Na₂HPO₄，0.1M KH₂PO₄，10 mM KCl和2mM MgCl₂的0.1M PBS中进行表征，测量其电化学响应信号，结果如图2所示：(a)裸AuE；(b)滴加PEI-MoS2-MWCNTs；(c)孵育Tb；(d)滴加Pt@Au核-壳微球； (e)与ZBA结合；(f)MCH封闭。

2)向实施例3制得的适体传感器的电极上滴加20μL不同浓度的目标物玉米赤霉烯酮，分别测定其电流变化情况。

3)根据所得电流变化值与玉米赤霉烯酮浓度对数值的线性关系，绘制工作曲线(如图3B所示)。测定结果表明电流响应值与玉米赤霉烯酮在500fg/mL-50ng/mL浓度对数值范围内呈良好的线性关系，线性相关系数为0.9989，检测限为180fg/mL；结果如图3所示。

二、传感器的稳定性测试：将实施例3制得的传感器于4℃保存，每间隔5天检测传感器一次，储存25天后电流响应仍为初始电流的87.2％，表明传感器具有良好的稳定性。取上述传感器在最佳条件下连续进行60圈CV测量后，其响应电流仅降低约2.64％，如图4所示。

三、传感器特异性测试：为了研究提出的适应传感器的特异性，采用几种潜在的干扰真菌毒素：α-玉米赤霉醇(α-ZAL)，β-玉米赤霉醇(β-ZAL)，β-玉米赤霉烯醇(β-ZOL)，赭曲霉毒素A(OTA)和黄曲霉毒素混合物在相同浓度及条件下测定的不同干扰物质在O.1M PBS中电流响应值。结果表明(如图5所示)，提出的基于ZEN-ZBA的高特异性反应的适体传感器具有令人满意的特异性。

四、实际样品分析应用

为了评估提出的适配体传感器的实际适用性和准确性，将稀释100倍的啤酒样品中加入各种浓度的ZEN(如表1所示)，然后用所制备的电化学适体传感器进行检测。检测结果如表1所示，相对标准偏差范围为1.86％至11.89％，回收率为84.00％至107.4％。结果表明，本发明制得的适配体传感器对于检测ZEN是可行的，可以满足实际分析的需要。

表1采用本发明制备的电化学适配体传感器测定啤酒样品中的ZEN(n＝3)

Claims (4)

1.一种用于玉米赤霉烯酮ZEN检测的电化学DNA适体传感器，其特征在于，由以下方法制备得到，该方法包括以下步骤：

1)用TES缓冲液室温下处理巯基标记的ZEN结合适体，储存备用；

2)分别用0.3μm和0.05μm的Al₂O₃粉末将金电极抛光成镜面，然后分别按超纯水、无水乙醇、超纯水的顺序超声处理电极，干燥备用；

3)将步骤2)得到的电极进行电化学活化，然后用超纯水冲洗，干燥；

4)将18μL PEI-MoS₂-MWCNTs纳米复合材料溶液滴加到步骤3)处理后的金电极表面上，室温干燥，然后将10μL Tb溶液滴加到电极上，在室温下避光孵育16h；所述PEI-MoS₂-MWCNTs纳米复合材料溶液由如下步骤制备得到：先制备PEI-MoS₂分散液；然后将羧基化多壁碳纳米管加入到制得的PEI-MoS₂分散液中，在室温下搅拌12h，离心、洗涤，再将沉淀物分散在超纯水中，即得PEI-MoS₂-MWCNTs纳米复合材料溶液；

5)将3μL Pt@Au核-壳微球溶液滴加到步骤4)得到的电极上，室温干燥；所述Pt@Au核-壳微球溶液由如下步骤制备得到：先制备纳米金溶胶；然后将制备的纳米金溶胶20mL加入30mL超纯水，加热至80℃，加入2.5mL 1％H₂PtCl₆溶液，剧烈搅拌，然后滴加抗坏血酸，得到黑色溶液，将黑色溶液加热回流直到溶液颜色不变，冷却至室温，即得Pt@Au核-壳微球溶液；

6)将步骤1)制得的ZEN结合适体，滴加在步骤5)制备得到的电极上室温孵育16h；

7)将20μL 1mM MCH溶液滴加到步骤6)得到的电极上，在4℃下孵育50min，即得到用于ZEN检测的电化学DNA适体传感器。

2.如权利要求1所述的电化学DNA适体传感器，其特征在于，所述步骤4)中PEI-MoS₂分散液的制备方法为：将20mg二硫化钼加入10mL乙醇中，超声分散均匀，在室温下搅拌，然后滴加20mL 1wt％聚乙烯亚胺水溶液到二硫化钼分散液中，在室温下继续搅拌2h后，即得PEI-MoS₂分散液。

3.如权利要求1所述的电化学DNA适体传感器，其特征在于，所述步骤5)制备纳米金溶胶的方法为：将100mL 0.01％HAuCl₄溶液加热至沸腾后，加入2.5mL 1％柠檬酸三钠溶液，溶液颜色将由蓝色变为红色，继续煮沸15min，冷却后用超纯水重新定容至原体积，得到透明的酒红色纳米金溶胶。

4.一种利用权利要求1-3任一项所述的电化学DNA适体传感器检测ZEN的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)向所述的电化学DNA适体传感器的电极上滴加不同浓度的目标物玉米赤霉烯酮；

2)将电极置于0.1M PBS溶液中进行表征，测量其电流变化值；

3)根据步骤2)所得电流变化值与ZEN浓度对数值的线性关系，绘制工作曲线；

4)将待测样品用所述的电化学DNA适体传感器检测，将得到的电流值通过步骤3)制得的工作曲线计算得到待测样品的ZEN浓度。

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