CN105606677B - 一种银纳米花杂化的硫化钼多壁碳纳米管传感器的制备方法及应用 - Google Patents

一种银纳米花杂化的硫化钼多壁碳纳米管传感器的制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于免疫分析和生物传感技术领域，提供了一种鳞状细胞癌肿瘤标志物免疫传感器的制备方法及应用；采用银纳米花杂化的硫化钼多壁碳纳米管标记的电化学免疫传感器，实现了对鳞状细胞癌肿瘤标志物的检测，该方法具有特异性强，灵敏度高，检测限低，对鳞状细胞癌的检测具有重要的科学意义和应用价值。

Description

一种银纳米花杂化的硫化钼多壁碳纳米管传感器的制备方法 及应用
技术领域
本发明属于新型功能纳米材料、免疫分析和生物传感技术领域，提供了一种银纳米花杂化的硫化钼多壁碳纳米管免疫传感器的制备方法及应用。
背景技术
肿瘤标志物是肿瘤细胞产生和释放的以抗原、酶、激素等形式的代谢产物存在于肿瘤细胞内或宿主体液中，其在临床上对于随原发肿瘤的发现，肿瘤高危人群的筛选、良性和恶性肿瘤的鉴别诊断、肿瘤发展程度的判断，肿瘤的治疗效果的观察和评价及肿瘤复发和预后的预测产生极大的影响，引起人们的广泛关注。
鳞状细胞癌肿瘤标志物，对于子宫颈癌、肺鳞癌、食道癌、肛门癌、皮肤癌、口腔癌等鳞状上皮细胞癌的诊断监测都能起到一定的作用。电化学免疫传感器结合了高特异性的免疫分析技术和高灵敏的电化学分析技术，具有灵敏度高、制备简单、检测快速、成本低等优点，在临床检验、环境监测、食品安全控制、生物监测等领域都有重要的应用价值。
氨基化石墨烯纳米带具有大量的氨基，可以和金纳米粒子生成稳定的金氨键，从而在其表面可以固载大量的金纳米粒子。金纳米粒子的加入不仅可以增加材料的导电性，而且还可以牢固的将抗体固载在电极表面，从而提高该免疫传感器的灵敏度。
发明内容
本发明提供了一种银纳米花杂化的硫化钼多壁碳纳米管传感器的制备方法及应用，实现了对鳞状细胞癌肿瘤标志物的超灵敏检测。
本发明的目的之一是提供一种银纳米花杂化的硫化钼多壁碳纳米管免疫传感器的制备方法。
本发明的目的之二是将所制备的银纳米花杂化的硫化钼多壁碳纳米管免疫传感器，用于检测鳞状细胞癌肿瘤标志物。
本发明的技术方案，包括以下步骤。
1.一种银纳米花杂化的硫化钼多壁碳纳米管传感器的制备方法，步骤如下：
（1）将直径为3 ~ 5mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨，超纯水清洗干净；
（2）取6µL、0.5 ~ 2mg/mL的负载金纳米粒子的石墨烯纳米带滴加到电极表面，室温下晾干，超纯水冲洗电极表面，晾干；
（3）继续将6µL、8 ~ 12µg/mL的鳞状细胞癌肿瘤标志物捕获抗体滴加到电极表面，超纯水冲洗，4 oC冰箱中干燥；
（4）继续将3µL、0.5 ~ 1.5mg/mL的BSA溶液滴加到电极表面，用以封闭电极表面上非特异性活性位点，超纯水冲洗电极表面，4 oC冰箱中晾干；
（5）继续滴加6µL、0.001 ~ 20ng/mL的一系列不同浓度的鳞状细胞癌肿瘤标志物抗原溶液，超纯水冲洗电极表面，4oC冰箱中干燥；
（6）将6µL、1 ~ 3mg/mL的银纳米花杂化的硫化钼多壁碳纳米管检测抗体孵化物溶液，滴涂于电极表面上，置于4oC冰箱中晾干，制得一种银纳米花杂化的硫化钼多壁碳纳米管传感器。
2.负载金纳米粒子的石墨烯纳米带的制备，步骤如下：
（1）金纳米粒子的制备
将4.0~4.3mL、质量分数为1%的氯金酸和95.8mL超纯水加入到250mL三口烧瓶中，加热至沸腾，在磁力搅拌下加入10mL、38.8mmol·L-1的柠檬酸钠溶液 ，持续搅拌并回流15min，直至溶液变为酒红色不再改变，离心分离，弃去沉淀，得到的上清液即为金纳米粒子溶液；
（2）氨基化石墨烯纳米带的制备
将30 ~ 50mg 多壁碳纳米管超声分散在30mL的浓硫酸中活化10 ~ 14h，然后加入150 ~ 250mg 高锰酸钾，室温下搅拌1h，然后在55oC的水浴锅里加热30min，后将水浴锅温度升高至65oC，继续加热4h，后将水浴锅温度升高至70oC，继续加热10 ~ 20min，冷却至室温；将得到的悬浊液倒入400mL超纯水结成的冰中，搅拌下加入5 ~ 9mL、30%的双氧水，待冰完全融化后，离心除去上清液，所得固体即为石墨烯纳米带，用超纯水和乙醚分别洗涤三次，60oC恒温干燥12~16h，冷却至室温备用；
将80 ~ 120mg石墨烯纳米带分散在40mL乙二醇中，超声分散30min，然后加入1mL的浓氨水，反应至悬浊液变为棕黑色后，将其转移到聚四氟乙烯反应釜中， 180oC下反应10~ 12h，冷却至室温，离心分离，所得固体用超纯水和乙醇分别洗涤三次，60oC恒温干燥12h，得到氨基化石墨烯纳米带；
（3）负载金纳米粒子的石墨烯纳米带的制备
将8~12mg上述步骤（2）制备的氨基化石墨烯纳米带加入到上述步骤（1）所制得的金纳米粒子溶液中，磁力搅拌3h，离心除去上清液，所得固体用超纯水和乙醇分别洗涤三次， 60oC恒温干燥12h，得到负载金纳米粒子的石墨烯纳米带。
3.银纳米花杂化的硫化钼多壁碳纳米管检测抗体孵化物溶液的制备，步骤如下：
（1）银纳米花杂化的硫化钼多壁碳纳米管的制备
①氨基化硫化钼多壁碳纳米管的制备
将35 ~ 40mg硫粉、90 ~ 95mg钼酸铵、100 ~120mg多壁碳纳米管加入到13mL乙醇和14mL辛胺的混合溶液中，搅拌20min后转移至聚四氟乙烯的反应釜中， 200oC下反应24h，冷却至室温，离心弃去上清液，所得固体用乙醇和超纯水分别洗涤三次，60oC恒温干燥10 ~12h，得到硫化钼多壁碳纳米管；
将80 ~ 120mg硫化钼多壁碳纳米管分散在40mL乙二醇中，超声分散30min，然后加入1mL的浓氨水，搅拌均匀后将其转移至聚四氟乙烯反应釜中，180oC下反应10h；冷却至室温，离心弃去上清液，用超纯水和乙醇各洗涤三次，60oC恒温干燥12h，得到氨基化硫化钼多壁碳纳米管；
②银纳米花杂化的硫化钼多壁碳纳米管的制备
将8 ~ 12mg氨基化硫化钼多壁碳纳米管分散在100mL、1 mmol/L的硝酸银溶液中，搅拌30min，然后加入1 ~ 3mL、15mmol/L的芸香苷，搅拌30min，离心分离弃去上清液，60oC恒温干燥12h，得到银纳米花杂化的硫化钼多壁碳纳米管；
（2）银纳米花杂化的硫化钼多壁碳纳米管检测抗体孵化物溶液的制备
将2 ~ 6mg的银纳米花杂化的硫化钼多壁碳纳米管分散到1 mL超纯水中，加入100µL、80~120µg/mL的鳞状细胞癌肿瘤标志物检测抗体溶液和900µL、50 mmol/L的pH 7.4磷酸盐缓冲溶液，4oC恒温振荡培养箱中振荡孵化12 h；在4oC下，6000 rpm转速下离心15 min，得到下层沉淀，加入1 mL、50 mmol/L 的pH 7.4磷酸盐缓冲溶液离心洗涤1次，得下层沉淀，最后加入1 mL、50 mmol/L 的pH 7.4磷酸盐缓冲溶液，制得银纳米花杂化的硫化钼多壁碳纳米管检测抗体孵化物溶液，4oC下保存备用。
4.制备的一种银纳米花杂化的硫化钼多壁碳纳米管传感器，用于鳞状细胞癌肿瘤标志物的检测，检测步骤如下：
（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的传感器为工作电极，在10 mL、50 mmol/L的pH 5.10 ~ 7.98磷酸盐缓冲溶液中进行测试；
（2）用时间-电流法对分析物进行检测，输入电压为-0.5 V，取样间隔 0.1 s，运行时间400 s；
（3）当背景电流趋于稳定后，每隔50 s向10 mL、50 mmol/L的pH 7.4磷酸盐缓冲溶液中注入10µL、5 mol/L的双氧水溶液，记录电流变化。
所述的肿瘤标志物为鳞状细胞癌肿瘤标志物
本发明所用原材料均可在化学试剂公司或生物制药公司购买。
本发明的有益成果
（1）本发明使用了金纳米粒子修饰的氨基化石墨烯纳米带，氨基化石墨烯纳米带有大的比表面积，可增加金纳米粒子的结合位点，金纳米粒子的加入不仅可以增加材料的导电性还可以固载更多的抗体从而提高电化学免疫分析的灵敏度；
（2）采用银纳米花杂化的硫化钼多壁碳纳米管作为检测抗体标记物，多壁碳纳米管具有极高的强度和良好的导电性， 硫化钼和银纳米花对过氧化氢有很强的催化作用，因此，银纳米花杂化的硫化钼多壁碳纳米管对过氧化氢的催化作用呈双重的放大作用，从而提高了传感器的灵敏度，降低了检测限；
（3）一种银纳米花杂化的硫化钼多壁碳纳米管免疫传感器对肿瘤标志物的检测，其线性范围0.1pg/mL～20 ng/mL，检测限最低0.03pg/mL，表明一种银纳米花杂化的硫化钼多壁碳纳米管免疫传感器可以达到准确测定的目的。
具体实施方式
现将本发明通过具体实施方式进一步说明，但不限于此
实施例1一种银纳米花杂化的硫化钼多壁碳纳米管传感器的制备
（1）将直径为3mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨，超纯水清洗干净；
（2）取6µL、0.5mg/mL的负载金纳米粒子的石墨烯纳米带滴加到电极表面，室温下晾干，超纯水冲洗电极表面，晾干；
（3）继续将6 µL、8µg/mL的鳞状细胞癌肿瘤标志物捕获抗体滴加到电极表面，超纯水冲洗，4 oC冰箱中干燥；
（4）继续将3µL、0.5mg/mL的BSA溶液滴加到电极表面，用以封闭电极表面上非特异性活性位点，超纯水冲洗电极表面，4 oC冰箱中晾干；
（5）继续滴加6µL、0.001 ~ 20ng/mL的一系列不同浓度的鳞状细胞癌肿瘤标志物抗原溶液，超纯水冲洗电极表面，4oC冰箱中干燥；
（6）将6µL、1mg/mL的银纳米花杂化的硫化钼多壁碳纳米管检测抗体孵化物溶液，滴涂于电极表面上，置于4oC冰箱中晾干，制得一种银纳米花杂化的硫化钼多壁碳纳米管传感器。
实施例2一种银纳米花杂化的硫化钼多壁碳纳米管传感器的制备
（1）将直径为4mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨，超纯水清洗干净；
（2）取6µL、1.5mg/mL的负载金纳米粒子的石墨烯纳米带滴加到电极表面，室温下晾干，超纯水冲洗电极表面，晾干；
（3）继续将6µL、10µg/mL的鳞状细胞癌肿瘤标志物捕获抗体滴加到电极表面，超纯水冲洗，4 oC冰箱中干燥；
（4）继续将3µL、1.0 mg/mL的BSA溶液滴加到电极表面，用以封闭电极表面上非特异性活性位点，超纯水冲洗电极表面，4 oC冰箱中晾干；
（5）继续滴加6µL、0.001 ~ 20ng/mL的一系列不同浓度的鳞状细胞癌肿瘤标志物抗原溶液，超纯水冲洗电极表面，4oC冰箱中干燥；
（6）将6µL、2mg/mL的银纳米花杂化的硫化钼多壁碳纳米管检测抗体孵化物溶液，滴涂于电极表面上，置于4oC冰箱中晾干，制得一种银纳米花杂化的硫化钼多壁碳纳米管传感器。
实施例3一种银纳米花杂化的硫化钼多壁碳纳米管传感器的制备
（1）将直径为5mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨，超纯水清洗干净；
（2）取6µL、2mg/mL的负载金纳米粒子的石墨烯纳米带滴加到电极表面，室温下晾干，超纯水冲洗电极表面，晾干；
（3）继续将6µL、12µg/mL的鳞状细胞癌肿瘤标志物捕获抗体滴加到电极表面，超纯水冲洗，4 oC冰箱中干燥；
（4）继续将3µL、1.5mg/mL的BSA溶液滴加到电极表面，用以封闭电极表面上非特异性活性位点，超纯水冲洗电极表面，4oC冰箱中晾干；
（5）继续滴加6µL、0.001 ~ 20ng/mL的一系列不同浓度的鳞状细胞癌肿瘤标志物抗原溶液，超纯水冲洗电极表面，4oC冰箱中干燥；
（6）将6µL、3mg/mL的银纳米花杂化的硫化钼多壁碳纳米管检测抗体孵化物溶液，滴涂于电极表面上，置于4oC冰箱中晾干，制得一种银纳米花杂化的硫化钼多壁碳纳米管传感器。
实施例4负载金纳米粒子的石墨烯纳米带的制备
（1）金纳米粒子的制备
将4.0mL、质量分数为1%的氯金酸和95.8mL超纯水加入到250mL三口烧瓶中，加热至沸腾，在磁力搅拌下加入10mL、38.8mmol·L-1的柠檬酸钠溶液 ，持续搅拌并回流15min，直至溶液变为酒红色不再改变，离心分离，弃去沉淀，得到的上清液即为金纳米粒子溶液；
（2）氨基化石墨烯纳米带的制备
将30mg 多壁碳纳米管超声分散在30mL的浓硫酸中活化10h，然后加入150mg 高锰酸钾，室温下搅拌1h，然后在55oC的水浴锅里加热30min，后将水浴锅温度升高至65oC，继续加热4h，后将水浴锅温度升高至70oC，继续加热10min，冷却至室温；将得到的悬浊液倒入400mL超纯水结成的冰中，搅拌下加入5mL、30%的双氧水，待冰完全融化后，离心除去上清液，所得固体即为石墨烯纳米带，用超纯水和乙醚分别洗涤三次，60oC恒温干燥12h，冷却至室温备用；
将80mg石墨烯纳米带分散在40mL乙二醇中，超声分散30min，然后加入1mL的浓氨水，反应至悬浊液变为棕黑色后，将其转移到聚四氟乙烯反应釜中， 180oC下反应10h，冷却至室温，离心分离，所得固体用超纯水和乙醇分别洗涤三次，60oC恒温干燥12h，得到氨基化石墨烯纳米带；
（3）负载金纳米粒子的石墨烯纳米带的制备
将8mg上述步骤（2）制备的氨基化石墨烯纳米带加入到上述步骤（1）所制得的金纳米粒子溶液中，磁力搅拌3h，离心除去上清液，所得固体用超纯水和乙醇分别洗涤三次，60oC恒温干燥12h，得到负载金纳米粒子的石墨烯纳米带。
实施例5负载金纳米粒子的石墨烯纳米带的制备
（1）金纳米粒子的制备
将4.1mL、质量分数为1%的氯金酸和95.8mL超纯水加入到250mL三口烧瓶中，加热至沸腾，在磁力搅拌下加入10mL、38.8mmol·L-1的柠檬酸钠溶液 ，持续搅拌并回流15min，直至溶液变为酒红色不再改变，离心分离，弃去沉淀，得到的上清液即为金纳米粒子溶液；
（2）氨基化石墨烯纳米带的制备
将40mg 多壁碳纳米管超声分散在30mL的浓硫酸中活化12h，然后加入200mg 高锰酸钾，室温下搅拌1h，然后在55oC的水浴锅里加热30min，后将水浴锅温度升高至65oC，继续加热4h，后将水浴锅温度升高至70oC，继续加热15min，冷却至室温；将得到的悬浊液倒入400mL超纯水结成的冰中，搅拌下加入7mL、30%的双氧水，待冰完全融化后，离心除去上清液，所得固体即为石墨烯纳米带，用超纯水和乙醚分别洗涤三次，60oC恒温干燥14h，冷却至室温备用；
将100mg石墨烯纳米带分散在40mL乙二醇中，超声分散30min，然后加入1mL的浓氨水，反应至悬浊液变为棕黑色后，将其转移到聚四氟乙烯反应釜中， 180oC下反应11h，冷却至室温，离心分离，所得固体用超纯水和乙醇分别洗涤三次，60oC恒温干燥12h，得到氨基化石墨烯纳米带；
（3）负载金纳米粒子的石墨烯纳米带的制备
将10mg上述步骤（2）制备的氨基化石墨烯纳米带加入到上述步骤（1）所制得的金纳米粒子溶液中，磁力搅拌3h，离心除去上清液，所得固体用超纯水和乙醇分别洗涤三次，60oC恒温干燥12h，得到负载金纳米粒子的石墨烯纳米带。
实施例6负载金纳米粒子的石墨烯纳米带的制备
（1）金纳米粒子的制备
将4.3mL、质量分数为1%的氯金酸和95.8mL超纯水加入到250mL三口烧瓶中，加热至沸腾，在磁力搅拌下加入10mL、38.8mmol·L-1的柠檬酸钠溶液 ，持续搅拌并回流15min，直至溶液变为酒红色不再改变，离心分离，弃去沉淀，得到的上清液即为金纳米粒子溶液；
（2）氨基化石墨烯纳米带的制备
将50mg 多壁碳纳米管超声分散在30mL的浓硫酸中活化14h，然后加入250mg 高锰酸钾，室温下搅拌1h，然后在55oC的水浴锅里加热30min，后将水浴锅温度升高至65oC，继续加热4h，后将水浴锅温度升高至70oC，继续加热20min，冷却至室温；将得到的悬浊液倒入400mL超纯水结成的冰中，搅拌下加入9 mL、30%的双氧水，待冰完全融化后，离心除去上清液，所得固体即为石墨烯纳米带，用超纯水和乙醚分别洗涤三次，60oC恒温干燥16h，冷却至室温备用；
将120mg石墨烯纳米带分散在40mL乙二醇中，超声分散30min，然后加入1mL的浓氨水，反应至悬浊液变为棕黑色后，将其转移到聚四氟乙烯反应釜中， 180oC下反应12h，冷却至室温，离心分离，所得固体用超纯水和乙醇分别洗涤三次，60oC恒温干燥12h，得到氨基化石墨烯纳米带；
（3）负载金纳米粒子的石墨烯纳米带的制备
将12mg上述步骤（2）制备的氨基化石墨烯纳米带加入到上述步骤（1）所制得的金纳米粒子溶液中，磁力搅拌3h，离心除去上清液，所得固体用超纯水和乙醇分别洗涤三次，60oC恒温干燥12h，得到负载金纳米粒子的石墨烯纳米带。
实施例7银纳米花杂化的硫化钼多壁碳纳米管检测抗体孵化物溶液的制备
（1）银纳米花杂化的硫化钼多壁碳纳米管的制备
①氨基化硫化钼多壁碳纳米管的制备
将35mg硫粉、90mg钼酸铵、100mg多壁碳纳米管加入到13mL乙醇和14mL辛胺的混合溶液中，搅拌20min后转移至聚四氟乙烯的反应釜中， 200oC下反应24h，冷却至室温，离心弃去上清液，所得固体用乙醇和超纯水分别洗涤三次，60oC恒温干燥10h，得到硫化钼多壁碳纳米管；
将80mg硫化钼多壁碳纳米管分散在40mL乙二醇中，超声分散30min，然后加入1mL的浓氨水，搅拌均匀后将其转移至聚四氟乙烯反应釜中，180oC下反应10h；冷却至室温，离心弃去上清液，用超纯水和乙醇各洗涤三次，60oC恒温干燥12h，得到氨基化硫化钼多壁碳纳米管；
②银纳米花杂化的硫化钼多壁碳纳米管的制备
将8mg氨基化硫化钼多壁碳纳米管分散在100mL、1mmol/L的硝酸银溶液中，搅拌30min，然后加入1mL、15mmol/L的芸香苷，搅拌30min，离心分离弃去上清液，60oC恒温干燥12h，得到银纳米花杂化的硫化钼多壁碳纳米管；
（2）银纳米花杂化的硫化钼多壁碳纳米管检测抗体孵化物溶液的制备
将2mg的银纳米花杂化的硫化钼多壁碳纳米管分散到1mL超纯水中，加入100µL、80µg/mL的鳞状细胞癌肿瘤标志物检测抗体溶液和900µL、50mmol/L的pH 7.4磷酸盐缓冲溶液，4oC恒温振荡培养箱中振荡孵化12h；在4oC下，6000rpm转速下离心15min，得到下层沉淀，加入1 mL、50 mmol/L 的pH 7.4磷酸盐缓冲溶液离心洗涤1次，得下层沉淀，最后加入1 mL、50 mmol/L 的pH 7.4磷酸盐缓冲溶液，制得银纳米花杂化的硫化钼多壁碳纳米管检测抗体孵化物溶液，4oC下保存备用。
实施例8 银纳米花杂化的硫化钼多壁碳纳米管检测抗体孵化物溶液的制备
（1）银纳米花杂化的硫化钼多壁碳纳米管的制备
①氨基化硫化钼多壁碳纳米管的制备
将37.5mg硫粉、92.5mg钼酸铵、110mg多壁碳纳米管加入到13mL乙醇和14mL辛胺的混合溶液中，搅拌20min后转移至聚四氟乙烯的反应釜中， 200oC下反应24h，冷却至室温，离心弃去上清液，所得固体用乙醇和超纯水分别洗涤三次，60oC恒温干燥11h，得到硫化钼多壁碳纳米管；
将100mg硫化钼多壁碳纳米管分散在40mL乙二醇中，超声分散30min，然后加入1mL的浓氨水，搅拌均匀后将其转移至聚四氟乙烯反应釜中，180oC下反应10h；冷却至室温，离心弃去上清液，用超纯水和乙醇各洗涤三次，60oC恒温干燥12h，得到氨基化硫化钼多壁碳纳米管；
②银纳米花杂化的硫化钼多壁碳纳米管的制备
将10mg氨基化硫化钼多壁碳纳米管分散在100mL、1 mmol/L的硝酸银溶液中，搅拌30min，然后加入2mL、15 mmol/L的芸香苷，搅拌30min，离心分离弃去上清液，60oC恒温干燥12h，得到银纳米花杂化的硫化钼多壁碳纳米管；
（2）银纳米花杂化的硫化钼多壁碳纳米管检测抗体孵化物溶液的制备
将4mg的银纳米花杂化的硫化钼多壁碳纳米管分散到1mL超纯水中，加入100µL、80~120µg/mL的鳞状细胞癌肿瘤标志物检测抗体溶液和900µL、50mmol/L的pH 7.4磷酸盐缓冲溶液，4oC恒温振荡培养箱中振荡孵化12 h；在4oC下，6000rpm转速下离心15 min，得到下层沉淀，加入1 mL、50mmol/L 的pH 7.4磷酸盐缓冲溶液离心洗涤1次，得下层沉淀，最后加入1mL、50mmol/L 的pH 7.4磷酸盐缓冲溶液，制得银纳米花杂化的硫化钼多壁碳纳米管检测抗体孵化物溶液，4oC下保存备用。
实施例9 银纳米花杂化的硫化钼多壁碳纳米管检测抗体孵化物溶液的制备
（1）银纳米花杂化的硫化钼多壁碳纳米管的制备
①氨基化硫化钼多壁碳纳米管的制备
将40mg硫粉、95mg钼酸铵、120mg多壁碳纳米管加入到13mL乙醇和14mL辛胺的混合溶液中，搅拌20min后转移至聚四氟乙烯的反应釜中， 200oC下反应24h，冷却至室温，离心弃去上清液，所得固体用乙醇和超纯水分别洗涤三次，60oC恒温干燥12h，得到硫化钼多壁碳纳米管；
将120mg硫化钼多壁碳纳米管分散在40mL乙二醇中，超声分散30min，然后加入1mL的浓氨水，搅拌均匀后将其转移至聚四氟乙烯反应釜中，180oC下反应10h；冷却至室温，离心弃去上清液，用超纯水和乙醇各洗涤三次，60oC恒温干燥12h，得到氨基化硫化钼多壁碳纳米管；
②银纳米花杂化的硫化钼多壁碳纳米管的制备
将12mg氨基化硫化钼多壁碳纳米管分散在100mL、1 mmol/L的硝酸银溶液中，搅拌30min，然后加入3mL、15mmol/L的芸香苷，搅拌30min，离心分离弃去上清液，60oC恒温干燥12h，得到银纳米花杂化的硫化钼多壁碳纳米管；
（2）银纳米花杂化的硫化钼多壁碳纳米管检测抗体孵化物溶液的制备
将6 mg的银纳米花杂化的硫化钼多壁碳纳米管分散到1mL超纯水中，加入100µL、80~120µg/mL的鳞状细胞癌肿瘤标志物检测抗体溶液和900µL、50mmol/L的pH 7.4磷酸盐缓冲溶液，4oC恒温振荡培养箱中振荡孵化12h；在4oC下，6000 rpm转速下离心15 min，得到下层沉淀，加入1mL、50mmol/L 的pH 7.4磷酸盐缓冲溶液离心洗涤1次，得下层沉淀，最后加入1mL、50mmol/L 的pH 7.4磷酸盐缓冲溶液，制得银纳米花杂化的硫化钼多壁碳纳米管检测抗体孵化物溶液，4oC下保存备用。
实施例10鳞状细胞癌肿瘤标志物的检测
（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的传感器为工作电极，在10 mL、50mmol/L的pH 5.10 ~ 7.98磷酸盐缓冲溶液中进行测试；
（2）用时间-电流法对分析物进行检测，输入电压为-0.5V，取样间隔 0.1 s，运行时间400 s；
（3）当背景电流趋于稳定后，每隔50s向10mL、50mmol/L的pH7.4磷酸盐缓冲溶液中注入10µL、5 mol/L的双氧水溶液，记录电流变化；
（4）测定样品中鳞状细胞癌肿瘤标志物的线性范围为0.1pg/mL～20 ng/mL，检测限最低0.03 pg/mL。

Claims (3)

1.一种银纳米花杂化的硫化钼多壁碳纳米管传感器的制备方法，其特征在于，步骤如下：
（1）将直径为3 ~ 5mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨，超纯水清洗干净；
（2）取6µL、0.5 ~ 2mg/mL的负载金纳米粒子的石墨烯纳米带滴加到电极表面，室温下晾干，超纯水冲洗电极表面，晾干；
（3）继续将6µL、8 ~ 12µg/mL的鳞状细胞癌肿瘤标志物捕获抗体滴加到电极表面，超纯水冲洗，4oC冰箱中干燥；
（4）继续将3µL、0.5 ~ 1.5mg/mL的BSA溶液滴加到电极表面，用以封闭电极表面上非特异性活性位点，超纯水冲洗电极表面，4 oC冰箱中晾干；
（5）继续滴加6µL、0.001 ~ 20ng/mL的一系列不同浓度的鳞状细胞癌肿瘤标志物抗原溶液，超纯水冲洗电极表面，4oC冰箱中干燥；
（6）将6µL、1 ~ 3mg/mL的银纳米花杂化的硫化钼多壁碳纳米管检测抗体孵化物溶液，滴涂于电极表面上，置于4oC冰箱中晾干，制得一种银纳米花杂化的硫化钼多壁碳纳米管传感器；
所述负载金纳米粒子的石墨烯纳米带的制备，步骤如下：
①金纳米粒子的制备
将4.0 ~ 4.3mL、质量分数为1%的氯金酸和95.8mL超纯水加入到250mL三口烧瓶中，加热至沸腾，在磁力搅拌下加入10mL、38.8mmol·L-1的柠檬酸钠溶液，持续搅拌并回流15min，直至溶液变为酒红色不再改变，离心分离，弃去沉淀，得到的上清液即为金纳米粒子溶液；
②氨基化石墨烯纳米带的制备
将30 ~ 50mg 多壁碳纳米管超声分散在30mL的浓硫酸中活化10 ~ 14h，然后加入150~ 250mg 高锰酸钾，室温下搅拌1h，然后在55oC的水浴锅里加热30min，后将水浴锅温度升高至65oC，继续加热4h，后将水浴锅温度升高至70oC，继续加热10 ~ 20min，冷却至室温；将得到的悬浊液倒入400mL超纯水结成的冰中，搅拌下加入5 ~ 9mL、30%的双氧水，待冰完全融化后，离心除去上清液，所得固体即为石墨烯纳米带，用超纯水和乙醚分别洗涤三次，60oC恒温干燥12 ~ 16h，冷却至室温备用；
将80 ~ 120mg石墨烯纳米带分散在40mL乙二醇中，超声分散30min，然后加入1mL的浓氨水，反应至悬浊液变为棕黑色后，将其转移到聚四氟乙烯反应釜中，180oC下反应10 ~12h，冷却至室温，离心分离，所得固体用超纯水和乙醇分别洗涤三次，60oC恒温干燥12h，得到氨基化石墨烯纳米带；
③负载金纳米粒子的石墨烯纳米带的制备
将8 ~ 12mg上述步骤（2）制备的氨基化石墨烯纳米带加入到上述步骤（1）所制得的金纳米粒子溶液中，磁力搅拌3h，离心除去上清液，所得固体用超纯水和乙醇分别洗涤三次，60oC恒温干燥12h，得到负载金纳米粒子的石墨烯纳米带。
2.如权利要求1所述的一种银纳米花杂化的硫化钼多壁碳纳米管传感器的制备方法，所述银纳米花杂化的硫化钼多壁碳纳米管检测抗体孵化物溶液的制备，其特征在于，制备步骤如下：
（1）银纳米花杂化的硫化钼多壁碳纳米管的制备
①氨基化硫化钼多壁碳纳米管的制备
将35 ~ 40mg硫粉、90 ~ 95mg钼酸铵、100 ~120mg多壁碳纳米管加入到13mL乙醇和14mL辛胺的混合溶液中，搅拌20min后转移至聚四氟乙烯的反应釜中， 200oC下反应24h，冷却至室温，离心弃去上清液，所得固体用乙醇和超纯水分别洗涤三次，60oC恒温干燥10 ~12h，得到硫化钼多壁碳纳米管；
将80 ~ 120mg硫化钼多壁碳纳米管分散在40mL乙二醇中，超声分散30min，然后加入1mL的浓氨水，搅拌均匀后将其转移至聚四氟乙烯反应釜中，180oC下反应10h；冷却至室温，离心弃去上清液，用超纯水和乙醇各洗涤三次，60oC恒温干燥12h，得到氨基化硫化钼多壁碳纳米管；
②银纳米花杂化的硫化钼多壁碳纳米管的制备
将8 ~ 12mg氨基化硫化钼多壁碳纳米管分散在100mL、1 mmol/L的硝酸银溶液中，搅拌30min，然后加入1 ~ 3mL、15mmol/L的芸香苷，搅拌30min，离心分离弃去上清液，60oC恒温干燥12h，得到银纳米花杂化的硫化钼多壁碳纳米管；
（2）银纳米花杂化的硫化钼多壁碳纳米管检测抗体孵化物溶液的制备
将2 ~ 6mg的银纳米花杂化的硫化钼多壁碳纳米管分散到1 mL超纯水中，加入100µL、80~120µg/mL的鳞状细胞癌肿瘤标志物检测抗体溶液和900µL、50 mmol/L的pH 7.4磷酸盐缓冲溶液，4oC恒温振荡培养箱中振荡孵化12 h；在4oC下，6000 rpm转速下离心15 min，得到下层沉淀，加入1mL、50 mmol/L 的pH 7.4磷酸盐缓冲溶液离心洗涤1次，得下层沉淀，最后加入1mL、50mmol/L 的pH 7.4磷酸盐缓冲溶液，制得银纳米花杂化的硫化钼多壁碳纳米管检测抗体孵化物溶液，4oC下保存备用。
3.如权利要求1所述的一种银纳米花杂化的硫化钼多壁碳纳米管传感器的制备方法，所述的一种银纳米花杂化的硫化钼多壁碳纳米管传感器用于鳞状细胞癌肿瘤标志物的检测，其特征在于，检测步骤如下：
（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的传感器为工作电极，在10mL、50mmol/L的pH 5.10 ~ 7.98磷酸盐缓冲溶液中进行测试；
（2）用时间-电流法对分析物进行检测，输入电压为-0.5V，取样间隔 0.1s，运行时间400s；
（3）当背景电流趋于稳定后，每隔50s向10mL、50mmol/L的pH 7.4磷酸盐缓冲溶液中注入10µL、5 mol/L的双氧水溶液，记录电流变化。
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