CN115219579B - 一种基于交替光激发调控亚甲基蓝电子传递的电化学传感器的构建方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物传感器技术领域，具体涉及一种基于交替光激发调控亚甲基蓝电子传递的比率传感器的构建方法及其应用；以AFB1适配体为主链，与MB‑DNA1和MB‑DNA2进行互补配对，利用PCR技术合成含有三条链的复合物，记为MB‑Mix‑DNA；在预处理后的ITO电极上修饰金纳米粒子溶液后，将MB‑Mix‑DNA修饰在电极表面，孵育后即得到电化学传感器；设定λ1和λ2，在可见光激发下，两个的电化学信号，分别记为I1和I 2；根据获得的两个电流值的比值和AFB1浓度的对数关系构建标准曲线，实现对AFB1的高选择和准确性检测，检测范围为0.0005～50ng/mL，检测限为0.175pg/mL。
Description
技术领域
本发明属于生物传感器技术领域，具体涉及一种基于交替光激发调控亚甲基蓝电子传递的比率传感器的构建方法及其应用。
背景技术
黄曲霉毒素是一类具有强烈生物毒性的化学物质，主要由黄曲霉菌和寄生曲霉菌等霉菌产生，广泛存在于霉变农产品，其中尤以黄曲霉毒素B1(AFB1)毒性强、危害广。因此，实现AFB1精准、快速分析可为其霉变预警与质控提供技术支撑，对于农业健康发展具有重要意义。
光激发电化学传感方法具有灵敏度高，响应速度快的优势，近年来被广泛应用于分析化学领域。然而，目前使用的基本均是功率较强的全波长光，强全波长光的引入会破坏生物分子和电化学系统。因此，亟需克服此技术问题，通过引入一种单波长可见激光来降低此影响。
发明内容
本发明旨在发明了一种基于交替光激发调控亚甲基蓝电子传递的电化学传感器；提出了一种新型线性范围宽的比率电化学传感器，实现对AFB1的检测。
氧化铟锡(ITO)是导电性良好的半导体，可作为光激发电化学传感器的工作电极，负载信号探针。亚甲基蓝(MB)是一种对光有良好信号响应的电化学探针，可产生电化学信号与光电信号。
本发明构建了一种基于532nm与650nm激发光调控亚甲基蓝电子传递的电化学传感器；固定520nm具有光吸收的金纳米粒子(AuNPs)溶液与在650nm具有光吸收的MB于ITO表面，构建电化学传感器(ITO/AuNPs/MB-Mix-DNA)。基于比率策略(I532nm/I650nm)拓宽了电化学传感器对AFB1的线性范围。本发明突出了交替光激发对调节MB电子动力学的优越性，为AFB1的检测提供了一种新的策略。
为了实现本发明的技术目的，具体方案如下；
本发明首先提供一种基于交替光激发调控亚甲基蓝电子传递的电化学传感器的构建方法，步骤如下：
(1)将ITO电极在NaOH溶液中加热煮沸一段时间，然后分别在乙醇、水中超声清洗，获得清洗后的ITO电极；
(2)金纳米粒子(AuNPs)溶液修饰在步骤(1)清洗后的ITO电极表面，孵育后得到的材料记为AuNPs/ITO；
(3)以AFB1适配体为主链，MB标记的第一条互补DNA(MB-DNA1)和MB与巯基标记的第二条互补DNA(MB-DNA2)进行互补配对，利用多聚酶链式反应(PCR)技术合成含有三条链的复合物，记为MB-Mix-DNA；
(4)将MB-Mix-DNA修饰在步骤(2)得到的AuNPs/ITO表面，并在一定温度条件下孵育一夜，得到电化学传感器，记为MB-Mix-DNA/AuNPs/ITO；
优选的，步骤(1)中，所述ITO电极的直径为6mm，NaOH溶液浓度为0.3M，煮沸的一段时间为30min；在乙醇、水中超声时间均为10～15min。
优选的，步骤(2)中，所述孵育时间为30min，孵育温度为37℃，金纳米粒子溶液修饰的用量为6～8μL，所述金纳米粒子溶液的浓度为5nM。
优选的，步骤(3)中，所述AFB1适配体、MB-DNA1、MB-DNA2的浓度均为3μM；所述利用多聚酶链式反应(PCR)技术合成含有三条链的复合物的具体条件为：首先在95℃条件下变性2min，然后在4℃下退火10min。
优选的，步骤(4)中，所述MB-Mix-DNA的浓度为1μM；所述修饰的用量为6～8μL。
本发明还涉及一种基于交替光激发调控亚甲基蓝电子传递的电化学传感方法检测AFB1的用途，步骤如下：
(1)首先配制不同浓度的AFB1溶液，然后在上述制得的MB-Mix-DNA/AuNPs/ITO电化学传感器表面依次修饰一定量且浓度呈梯度变化的AFB1溶液，室温下孵育，用Tris-HCl(pH＝7.4)溶液对电极进行清洗，得到修饰AFB1的电化学传感器，其中每个浓度的AFB1溶液对应修饰每个电化学传感器；
(2)构建标准曲线：以步骤(1)修饰后的电化学传感器为工作电极，饱和Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为对电极，利用外界光源，设定激发波长为λ1和λ2，对电化学传感界面激发，并在激发过程中进行电化学测试，每一个浓度的AFB1修饰的电极对应获得两个的电化学信号，分别记为I1和I 2；根据获得的两个电流值的比值和AFB1浓度的对数关系构建标准曲线；
(3)样品中AFB1的检测：首先获取样品液，修饰一定量的样品液于电化学传感器表面，利用激发波长分别为λ1和λ2的激光器对工作界面激发，在激发过程中通过电化学测试得到I1和I 2；将两者的比值代入步骤(2)构建的标准曲线，即可获知样品中AFB1的浓度；实现未知样品中AFB1检测的用途。
优选的，步骤(1)中，所述AFB1溶液的浓度为0.5～50000pg mL-1；所述孵育时间为40～120min；所述电化学传感器表面修饰AFB1溶液的用量为6μL。
优选的，步骤(2)中所述电化学检测由型号为Autolab PGSTAT 302N的电化学工作站记录、检测；所述检测条件为在0.1M、pH＝7.4的PBS缓冲溶液中进行测试，扫描电压范围为-0.4～0V，振幅为0.025V，频率为25Hz；
优选的，步骤(2)中所述外界光源功率为70mW/cm2，λ1和λ2分别为532nm和650nm，距离工作电极的垂直距离为3cm。
优选的，步骤(3)中所述样品液于传感器表面的用量为6μL；所述外界光源功率为70mW/cm2，λ1和λ2分别为532nm和650nm，距离工作电极的垂直距离为3cm。
本发明的有益效果：
(1)本发明的基于交替光激发调控亚甲基蓝电子传递的电化学传感器灵敏度高，线性范围宽。
(2)本发明引入具有高特异性的识别元件AFB1的适配体，将AFB1适配体为主链、MB-DNA1和MB-DNA2一步合成，过程简单，提高传感器构建效率、提高了构建的电化学传感器的选择性，降低了与AFB1同时存在的其他真菌毒素的干扰，实现了对AFB1的高选择分析。
(3)本发明构建的基于交替光激发调控亚甲基蓝电子传递的电化学传感器对AFB1的检测范围为0.0005～50ng/mL，检测限为0.175pg/mL。
附图说明
图1中(A)为电化学传感器对不同浓度AFB1(0.5,1,5,50,500,1000,5000,50000pgmL-1)的响应图；(B)为AFB1浓度取对数与IMB 532nm/IMB 650nm的变量关系图。
图2中(A)为电化学传感器对其他真菌毒素(FB1、AFB2、OTA、FB1+AFB2+OTA、AFB1、FB1+AFB2+OTA+AFB1)的响应图；(B)为电化学传感器平行测试的重现性；(C)为电化学传感器的稳定性测试。
具体实施方式：
下面结合附图对本发明的实施例作详细说明：实施例以本发明的技术方案为前提进行，给出了详细实施步骤和具体操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
其中AFB1的适配体(apt)：
5′-GTTGGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCCACA-3′；
MB标记的第一条互补DNA(MB-DNA1)：
3’-MB-CGTGCCCAACTTTGGGCCC-(CH2)6-SH-5’；
MB与巯基标记的第二条互补DNA(MB-DNA2)：
5’-MB-ATCCGGGTGTTTTCCCGGG-3’；
上述试剂均购自生工生物工程(上海)股份有限公司。
实施例1：
(1)直径d＝6mm的ITO电极在0.3M的NaOH溶液中煮沸沸腾30min，然后分别在乙醇、水中分别超声15min，自然干燥后获得干净的ITO电极；
(2)将6μL、浓度为5nM的AuNPs溶液修饰在步骤(1)所制得的ITO电极表面，在37℃条件下孵育30min，修饰后的材料记为AuNPs/ITO；
(3)以AFB1适配体为主链，MB标记的第一条互补DNA(MB-DNA1)和MB与巯基标记的第二条互补DNA(MB-DNA2)进行互补配对，利用多聚酶链式反应(PCR)技术，在95℃条件下变性2min，然后在4℃下快速退火10min，合成含有三条链的复合物，记为MB-Mix-DNA；
(4)将合成的浓度为1μM的MB-Mix-DNA修饰6μL在步骤(2)得到的AuNPs/ITO表面，并在4℃温度条件下孵育一夜(12h)，得到电化学传感器，记为MB-Mix-DNA/AuNPs/ITO；
基于交替光激发调控亚甲基蓝电子传递的电化学传感方法后续研究分析：
(1)对制备的光激发调控亚甲基蓝电子传递的电化学传感器的分析性能进行研究：
(1)首先配制不同浓度的AFB1溶液，然后将不同浓度AFB1为0.5,1,5,50,500,1000,5000,50000pg mL-1修饰在实施例1制备的电化学传感器表面，并在37℃进行孵育，然后用Tris-HCl(pH＝7.4)溶液对电极进行清洗，得到修饰AFB1的电化学传感器；
(2)以步骤(1)修饰后的电化学传感器为工作电极，饱和Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为对电极，利用功率为70mW/cm2且激发波长分别为532nm，650nm的激光器在距离工作电极3cm处对工作界面激发，由型号为Autolab PGSTAT 302N的电化学工作站记录、检测MB的电化学信号IMB 532nm，IMB 650nm；在0.1M PBS(pH＝7.4)缓冲溶液中进行测试；扫描电压范围为-0.4～0V，振幅为0.025V，频率为25Hz；每一个浓度的AFB1对应两个激发波长下MB的电化学信号(IMB 532nm，IMB 650nm)，根据IMB 532nm/IMB 650nm与AFB1浓度的对数构建得到标准曲线；随着AFB1浓度的增加，IMB 532nm/IMB 650nm逐渐降低，在AFB1浓度为0.5～50000pg mL-1范围内与获得的两个电化学信号呈现线性关系(图1A)；具体的线性关系图如图1B所示，AFB1浓度对数与IMB 532nm/IMB 650nm呈现良好线性关系，其线性曲线为IMB/IFc＝-0.098lgCAFB1+1.24，回归系数为0.994，证明传感的器性能良好。
为了评估传感器的选择性，使用FB1、AFB2、OTA、三种毒素混合物Mix(FB1、AFB2、OTA)、四种毒素混合物(FB1、AFB2、OTA、AFB1)进行了干扰实验。如图2中A所示，传感器对干扰物的响应与背景信号几乎相同；只有AFB1能对IMB 532nm/IMB 650nm产生明显的改变，表明该传感器具有良好的选择性。
如图2中B所示，7次平行测量AFB1来评估电化学传感器的重现性，测量结果RSD为1.87％，表明传感器的重现性良好。
如图2中C所示，传感器7天测量AFB1结果的RSD为1.34％，表明其具有较好的长期稳定性。
基于传感器优异的分析性能我们对实际样品花生AFB1进行了分析：
(1)将5g花生样品磨碎浸泡在含有5mL甲醇、15mL超纯水的混合溶液中，震荡1.5小时，之后在6000转离心10分钟，取上清液作为花生样品液；
(2)取样品液，修饰6μL样品液于传感器表面，通过电化学测试得到相应的电流值IMB 532nm和IMB 650nm，然后将IMB 532nm/IMB 650nm代入构建的标准曲线，即可获知样品中AFB1的浓度，实现未知样品中AFB1检测的用途。
分析结果如表1所示。
表1.利用构建的电化学传感器及标准方法UPLC-MS/MS检测花生中AFB1
利用两种传感方法对实际样品花生中不同浓度的AFB1进行了分析，回收率为92～101.4％。与国标方法UPLC-MS/MS相比(101.8％～120％)，本发明提出的电化学传感器对于实际样品花生中AFB1的分析可靠性、准确性高。
说明：以上实施例仅用以说明本发明而并非限制本发明所描述的技术方案；因此，尽管本说明书参照上述的各个实施例对本发明已进行了详细的说明，但是本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换；而一切不脱离本发明的精神和范围的技术方案及其改进，其均应涵盖在本发明的权利要求范围内。
Claims (10)
1.一种基于交替光激发调控亚甲基蓝电子传递的电化学传感器的构建方法，其特征在于，步骤如下：
(1)将ITO电极在NaOH溶液中加热煮沸一段时间，然后分别在乙醇、水中超声清洗，获得清洗后的ITO电极；
(2)固定520nm具有光吸收的金纳米粒子溶液修饰在步骤(1)清洗后的ITO电极表面，孵育后得到的材料记为AuNPs/ITO；
(3)以AFB1适配体为主链，MB标记的第一条互补DNA和MB与巯基标记的第二条互补DNA进行互补配对，利用多聚酶链式反应技术合成含有三条链的复合物，记为MB-Mix-DNA；
(4)将在650nm具有光吸收的MB-Mix-DNA修饰在步骤(2)得到的AuNPs/ITO表面，并在一定温度条件下孵育一夜，得到电化学传感器，记为MB-Mix-DNA/AuNPs/ITO。
2.根据权利要求1所述的基于交替光激发调控亚甲基蓝电子传递的电化学传感器的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，所述ITO电极的直径为6mm，NaOH溶液浓度为0.3M，煮沸的一段时间为30min；在乙醇、水中超声时间均为10～15min。
3.根据权利要求1所述的基于交替光激发调控亚甲基蓝电子传递的电化学传感器的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，孵育时间为30min，孵育温度为37℃，金纳米粒子溶液修饰的用量为6～8μL，所述金纳米粒子溶液的浓度为5nM。
4.根据权利要求1所述的基于交替光激发调控亚甲基蓝电子传递的电化学传感器的构建方法，其特征在于，步骤(3)中，所述AFB1适配体、MB-DNA1、MB-DNA2的浓度均为3μM；所述利用多聚酶链式反应技术合成含有三条链的复合物的具体条件为：首先在95℃条件下变性2min，然后在4℃下退火10min。
5.根据权利要求1所述的基于交替光激发调控亚甲基蓝电子传递的电化学传感器的构建方法，其特征在于，步骤(4)中，所述MB-Mix-DNA的浓度为1μM；所述修饰的用量为6～8μL。
6.根据权利要求1-5任一项所述方法制备的传感器用于检测黄曲霉毒素B1的用途，其特征在于，步骤如下：
(1)首先配制不同浓度的AFB1溶液，然后在MB-Mix-DNA/AuNPs/ITO电化学传感器表面依次修饰一定量且浓度呈梯度变化的AFB1溶液，室温下孵育，用Tris-HCl溶液对电极进行清洗，得到修饰AFB1的电化学传感器，其中每个浓度的AFB1溶液对应修饰每个电化学传感器；
(2)构建标准曲线：以步骤(1)修饰后的电化学传感器为工作电极，饱和Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为对电极，利用外界光源，设定激发波长为λ1和λ2，对电化学传感界面激发，并在激发过程中进行电化学测试，每一个浓度的AFB1修饰的电极对应获得两个的电化学信号，分别记为I1和I 2；根据获得的两个电流值的比值和AFB1浓度的对数关系构建标准曲线；
(3)样品中AFB1的检测：首先获取样品液，修饰一定量的样品液于电化学传感器表面，利用激发波长分别为λ1和λ2的激光器对工作界面激发，在激发过程中通过电化学测试得到I1和I 2；将两者的比值代入步骤(2)构建的标准曲线，即可获知样品中AFB1的浓度；实现未知样品中AFB1检测的用途。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，步骤(1)中，所述AFB1溶液的浓度为0.5～50000pg mL-1；所述孵育时间为40～120min；所述电化学传感器表面修饰AFB1溶液的用量为6μL。
8.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，步骤(2)中所述电化学测试由型号为Autolab PGSTAT 302N的电化学工作站记录、检测；所述检测条件为在0.1M、pH＝7.4的PBS缓冲溶液中进行测试，扫描电压范围为-0.4～0V，振幅为0.025V，频率为25Hz。
9.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，步骤(2)中所述外界光源功率为70mW/cm2，λ1和λ2分别为532nm和650nm，距离工作电极的垂直距离为3cm。
10.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，步骤(3)中所述样品液于传感器表面的用量为6μL；所述外界光源功率为70mW/cm2，λ1和λ2分别为532nm和650nm，距离工作电极的垂直距离为3cm。
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