CN110734962B - 一种基于核酸适配体检测食品毒素的方法 - Google Patents
一种基于核酸适配体检测食品毒素的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110734962B CN110734962B CN201911078391.8A CN201911078391A CN110734962B CN 110734962 B CN110734962 B CN 110734962B CN 201911078391 A CN201911078391 A CN 201911078391A CN 110734962 B CN110734962 B CN 110734962B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- solution
- aptamer
- cleaning
- nps
- food toxin
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/5308—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for analytes not provided for elsewhere, e.g. nucleic acids, uric acid, worms, mites
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种基于核酸适配体检测食品毒素的方法,包括以下步骤:1)将带凹槽的玻片进行清洗后,对玻片表面进行氨基硅烷化、醛基化修饰;2)将捕获探针capture DNA固定到醛基化玻片上;3)加入NPS‑aptamer,滴加10.0μL 3×SSC缓冲液,将其放入振荡培养箱中30‑45℃杂交25‑40min;4)在玻璃凹槽中加入食品毒素溶液,45℃反应20min;5)将反应液转移至PCR管,加入H2O2和TMB溶液,808nm波长的光照10s‑25min,温度计测定溶液温度变化;6)建立温度的变化和食品毒素加入量的拟合曲线图,实现食品毒素的测定。本发明操作简便,选择性好,无需使用昂贵的仪器。
Description
技术领域
本发明涉及食品毒素检测领域,具体涉及一种基于核酸适配体检测食品毒素的方法。
背景技术
随着现代检测技术的快速发展,重金属、真菌毒素、残留农药、药物和个人护理品(Phrmaceuticals and Personal CareProducts,PPCPs)等环境污染物,在地表水、地下水、土壤、水生生物体、饮用水中不断被检出,直接或间接地对人类的健康造成危害。由于实际环境样品基质复杂,环境污染物检测方法须高效、灵敏和选择性好。基于核酸适配体技术的检测方法相比其他方法具有很强的竞争力。
传统的测定方法主要包括色谱分析(薄层色谱分析法,质谱、紫外等联用的高效液相色谱法,气相色谱法等)和酶联免疫吸附测定方法,这两种方法对操作人员的要求比较高,样品处理繁琐,且仪器昂贵,特别在低浓度的时候准确度还不够高。因此,在过去的十几年里,分子水平的生物传感器的研究被大量的报道。各类环境污染物的测定从检测限、准确度、简单操作等方面都有了很大的提高,但是离实际应用还距离很远,还需要投入大量的研究。目前,科研工作者研究重点主要集中在传感器受体的选择、信号传导策略、新材料应用、信号产生机制等方面的研究,以期得到灵敏度高、线性范围宽、使用寿命长、小型便捷的,可以推广应用的传感体系。
核酸适配体(aptamer)技术由美国Gold和Szostak两个研究组最早提出,其在生物传感应用领域具有靶分子范围广、亲和力强、制备和修饰方便、快速、稳定性好等优势。aptamer的这些优势使其成为生物传感器的理想识别分子。aptamer是一段与靶物质具有高亲和力和高特异性的寡核苷酸链。核酸适配体法不同于抗原-抗体的特异性反应,可以克服免疫分析易受到pH值、温度等干扰问题,基于aptamer的生物传感器的构建与应用已经成为生物分析领域的研究热点之一。目前,大部分传感器都是基于荧光检测和电化学检测传感系统,需要借助昂贵的仪器和繁琐的操作。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于核酸适配体检测食品毒素的方法,以解决现有技术中存在的基于aptamer的生物传感器大部分都是基于荧光检测和电化学检测传感系统,需要借助昂贵的仪器和繁琐的操作的问题。
为了实现上述发明目的,本发明采用的技术方案为:
一种基于核酸适配体检测食品毒素的方法,包括以下步骤:
1)将带凹槽的玻片进行清洗后,对玻片表面进行氨基硅烷化、醛基化修饰;
2)将捕获探针capture DNA固定到醛基化玻片上;将capture DNA用蒸馏水稀释到5.0g/mL,滴加到醛基化玻片表面,室温静置过夜,然后用质量百分浓度为0.2%的SDS清洗,蒸馏水清洗,室温晾干;
3)加入NPS-aptamer,滴加10.0μL 3×SSC缓冲液来维持湿度,将其放入振荡培养箱中30-45℃杂交25-40min,用配制好的杂交后清洗液1、清洗液2和清洗液3清洗;
4)在玻璃凹槽中加入食品毒素溶液,45℃反应20min;
5)将反应液转移至PCR管,加入H2O2和TMB溶液,808nm波长的光照10s-25min,温度计测定溶液温度变化;
6)建立温度的变化和食品毒素加入量的拟合曲线图,实现食品毒素的测定。
进一步的,步骤3)中,杂交温度为45℃,杂交时间为25min。
进一步的,步骤3)中,清洗液1为1×SSC+0.03%SDS;清洗液2为0.20×SSC;清洗液3为0.05×SSC。
进一步的,步骤5)中,H2O2的摩尔浓度为1.0M,TMB的摩尔浓度为0.4mM。
进一步的,步骤5)中,光照辐射度为5.26W·cm-2,光照时间为20min。
进一步的,捕获探针capture DNA与NPS-aptamer的体积比为3-6:1。
优选,捕获探针capture DNA与NPS-aptamer的体积比为4:1。
进一步的,NPS的粒径为100nm-1μm。
优选,NPS的粒径为1μm。
进一步的,NPS-aptamer是由生物素标记的aptamer和链霉亲和素-NPS结合而成,aptamer核酸适配体序列为5'-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACA-3';捕获探针capture DNA序列为5'-TTTTTTTTTCCGATGCTCCCT-3',且在5'端修饰了氨基。
有益效果:与现有技术相比,本发明具有如下优点:
(1)测定过程步骤简单、快速;
(2)无需使用昂贵的光学仪器,一般温度计读取温度信号即可;
(3)灵敏度高,可以最低检测OTA浓度已经达到nm级别。
附图说明
图1是OTA浓度与温度变化之间的拟合曲线图。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步说明本发明,但这些实施例并不用来限制本发明。
实施例1
一种基于核酸适配体检测食品毒素的方法,包括以下步骤:
(1)将带凹槽的普通玻璃浸入铬酸溶液中浸泡过夜,蒸馏水洗;浸入25%(质量百分浓度)氨水中过夜,二次蒸馏水水洗;浸入2%(质量百分浓度)的氨基硅烷95%乙醇溶液中,用冰醋酸调节pH至4.5,室温作用30min,用乙醇超声清洗,用二次蒸馏水超声清洗,室温晾干;室温下含2.5%(质量百分浓度)戊二醛的0.10mol·L-1,pH=7.2的PBS溶液与氨基玻片作用2h,PBS冲洗,再用二次蒸馏水水洗,晾干。
(2)将捕获探针capture DNA(捕获探针capture DNA序列为5'-TTTTTTTTTCCGATGCTCCCT-3',且在5'端修饰了氨基)固定到醛基化玻片上。将capture DNA用二次蒸馏水稀释到5.0g·mL-1,将样品滴加到醛基化玻片表面,室温静置过夜,然后用0.2%(质量百分浓度)的SDS洗2次,蒸馏水洗两次,室温晾干。
(3)加入一定量的NPS-aptamer(NPS-aptamer是由生物素标记的aptamer和链霉亲和素-NPS结合而成,aptamer核酸适配体序列为5'-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACA-3'),滴加10.0μL3×SSC来维持湿度,将其放入振荡培养箱中30-45℃杂交25-40min。用配制好的杂交后清洗液1(1×SSC+0.03%SDS)、清洗液2(0.20×SSC)和清洗液3(0.05×SSC)洗液清洗。
(4)在玻璃凹槽中加入OTA溶液,45℃反应20min。
(5)将反应液转移至PCR管,加入H2O2和TMB溶液(H2O2的摩尔浓度为1.0M,TMB的摩尔浓度为0.4mM)。溶液变成蓝色,用808nm波长的光照射10s-25min,光照辐射度为5.26W·cm-2,温度计测溶液温度变化。
(6)建立温度的变化和食品毒素加入量的拟合曲线图,实现食品毒素的测定。
步骤(3)中,清洗液由20×SSC与10%SDS按照一定比例配制,具体配置如表1所示。20×SSC含3M氯化钠和0.3M柠檬酸钠,pH为7.0,10%SDS溶液含100g/L的十二烷基硫酸钠。
表1清洗液配制
清洗液 | 清洗液1/mL | 清洗液2/mL | 清洗液3/mL |
二次蒸馏水 | 190.0 | 198.0 | 200.0 |
20×SSC | 10.0 | 2.0 | 0.5 |
10%SDS | 0.6 | ― | ― |
终体积 | 200.0 | 200.0 | 200.0 |
实施例2
1)改变捕获探针capture DNA与NPS-aptamer的比例关系(磁珠粒径使用100nm),溶液温度变化如表2所示。
表2 capture DNA与NPS-aptamer的体积比对溶液温度的影响
2)改变NPS磁珠粒径,溶液温度变化如表3所示。
表3磁珠粒径对溶液温度的影响
3)改变NPS-aptamer的结合量,溶液温度变化如表4所示。
表4 NPS-aptamer的结合量对溶液温度的影响
4)改变杂交时间,溶液温度变化如表5所示。
表5杂交时间对溶液温度的影响
5)改变杂交温度,溶液温度变化如表6所示。
表6杂交温度对溶液温度的影响
6)改变光照时间,溶液温度变化如表7所示。
表7光照时间对溶液温度的影响
7)在捕获探针capture DNA与NPS-aptamer的比例为4:1,磁珠粒径为1μm,NPS-aptamer的结合量为450pmol的aptamer加入31μL的1μm磁珠,45℃杂交25min,光照时间为20min的条件下,发现温度的变化与OTA的浓度(2.5×10-6、2.5×10-7、2.5×10-8、2.5×10-9、2.5×10-10M)有一定的相关性,具体如图1所示。当OTA浓度到达0.25nM时都能检测出来,证明最低检测OTA浓度已经达到nM级别。
需要注意的是,以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然,本发明不限于以上实施例,还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形,均应认为是本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 江苏开放大学(江苏城市职业学院)
<120> 一种基于核酸适配体检测食品毒素的方法
<130> 1
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> aptamer核酸适配体
<400> 1
gatcgggtgt gggtggcgta aagggagcat cggaca 36
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> capture DNA
<400> 2
tttttttttc cgatgctccc t 21
Claims (1)
1.一种基于核酸适配体检测食品毒素的方法,其特征在于,包括以下步骤:
1)将带凹槽的玻片进行清洗后,对玻片表面进行氨基硅烷化、醛基化修饰;
2)将捕获探针capture DNA固定到醛基化玻片上;将capture DNA用蒸馏水稀释到5.0g/mL,滴加到醛基化玻片表面,室温静置过夜,然后用质量百分浓度为0.2%的SDS清洗,蒸馏水清洗,室温晾干;
3)加入NPS-aptamer,所述捕获探针capture DNA与NPS-aptamer的体积比为4:1;所述NPS为纳米磁珠;所述NPS的粒径为1μm;滴加10.0µL 3×SSC缓冲液维持湿度,将其放入振荡培养箱中45℃杂交25min;用配制好的杂交后清洗液1、清洗液2和清洗液3清洗;所述清洗液1为1×SSC+0.03% SDS;所述清洗液2为0.20×SSC;所述清洗液3为0.05×SSC;所述aptamer核酸适配体序列为5'-GATCGGGTGTGGGTG GCGTAAAGGGAGCATCGGACA-3';所述捕获探针capture DNA序列为5'-TTTTTTTTTCCGATGCTCCCT-3',且在5'端修饰了氨基;
4)在玻璃凹槽中加入食品毒素溶液,45℃反应20min;
5)将反应液转移至PCR管,加入H2O2和TMB溶液,808nm波长的光照,温度计测定溶液温度变化;所述光照辐射度为5.26W·cm-2,所述光照时间为20min;所述H2O2的摩尔浓度为1.0M,所述TMB的摩尔浓度为0.4mM;
6)建立温度的变化和食品毒素加入量的拟合曲线图,实现食品毒素的测定;所述食品毒素为OTA。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201911078391.8A CN110734962B (zh) | 2019-11-06 | 2019-11-06 | 一种基于核酸适配体检测食品毒素的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201911078391.8A CN110734962B (zh) | 2019-11-06 | 2019-11-06 | 一种基于核酸适配体检测食品毒素的方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN110734962A CN110734962A (zh) | 2020-01-31 |
CN110734962B true CN110734962B (zh) | 2021-10-19 |
Family
ID=69272380
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201911078391.8A Active CN110734962B (zh) | 2019-11-06 | 2019-11-06 | 一种基于核酸适配体检测食品毒素的方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN110734962B (zh) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111521783A (zh) * | 2020-03-26 | 2020-08-11 | 军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所 | 一种纳米花传感器体系及其制备方法和应用 |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104237136A (zh) * | 2014-09-29 | 2014-12-24 | 江南大学 | 一种基于金核-银卫星手性组装体的赭曲霉毒素a的超灵敏检测方法 |
CN106370868A (zh) * | 2016-09-23 | 2017-02-01 | 中国科学院重庆绿色智能技术研究院 | 基于核酸适配体信号放大策略的检测微囊藻毒素的spr传感器及其制备方法和应用 |
CN107515295A (zh) * | 2017-10-17 | 2017-12-26 | 环境保护部华南环境科学研究所 | 一种检测环境中真菌毒素的方法 |
WO2019010285A1 (en) * | 2017-07-07 | 2019-01-10 | Aviana Molecular Technologies, Llc | BIOACTIVE COATING FOR ACOUSTIC SURFACE WAVE SENSOR |
CN109738635A (zh) * | 2019-01-15 | 2019-05-10 | 湖北工业大学 | 一种检测黄曲霉毒素b1的试剂盒及其制备方法 |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2009086621A1 (en) * | 2008-01-10 | 2009-07-16 | Neoventures Biotechnology Inc. | Method of mycotoxin detection |
CN102735740B (zh) * | 2012-06-14 | 2014-02-19 | 合肥工业大学 | 利用电化学核酸适配体传感器一步快速检测赭曲霉毒素a的方法 |
US20180037942A1 (en) * | 2016-08-03 | 2018-02-08 | Cellular Research, Inc. | Enzyme-independent molecular indexing |
CN109813703B (zh) * | 2019-01-11 | 2021-06-01 | 东南大学 | 基于dna行走机器人构建的电化学发光适体传感器检测赭曲霉毒素a的方法 |
CN111122847B (zh) * | 2020-01-22 | 2022-09-20 | 福建中医药大学 | 一种基于适配体的现场快速检测黄曲霉毒素b1的方法 |
-
2019
- 2019-11-06 CN CN201911078391.8A patent/CN110734962B/zh active Active
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104237136A (zh) * | 2014-09-29 | 2014-12-24 | 江南大学 | 一种基于金核-银卫星手性组装体的赭曲霉毒素a的超灵敏检测方法 |
CN106370868A (zh) * | 2016-09-23 | 2017-02-01 | 中国科学院重庆绿色智能技术研究院 | 基于核酸适配体信号放大策略的检测微囊藻毒素的spr传感器及其制备方法和应用 |
WO2019010285A1 (en) * | 2017-07-07 | 2019-01-10 | Aviana Molecular Technologies, Llc | BIOACTIVE COATING FOR ACOUSTIC SURFACE WAVE SENSOR |
CN107515295A (zh) * | 2017-10-17 | 2017-12-26 | 环境保护部华南环境科学研究所 | 一种检测环境中真菌毒素的方法 |
CN109738635A (zh) * | 2019-01-15 | 2019-05-10 | 湖北工业大学 | 一种检测黄曲霉毒素b1的试剂盒及其制备方法 |
Non-Patent Citations (6)
Title |
---|
"A potential reusable fluorescent aptasensor based on magnetic nanoparticles for ochratoxin A analysis";Pinzhu Qin等;《Open Chem》;20191231;第17卷;第1301-1308页 * |
"DNA Aptamer−Target Binding Motif Revealed Using a Fluorescent Guanine Probe: Implications for Food Toxin Detection";Kaila L. Fadock等;《ACS Omega》;20170825;第2卷(第8期);第4955-4963页 * |
"Nano Aptasensor for Protective Antigen Toxin of Anthrax";Lakshmi N. Cella等;《Analytical Chemistry》;20100301;第82卷(第5期);第2042-2047页 * |
"光及光热纳米材料在生物传感、药物靶向运输和生物成像中的应用";郑力榕等;《生物技术通报》;20180926;第34卷(第9期);第82页右栏最后一段 * |
"用于寡核苷酸芯片制备载体的醛基载玻片的制备方法优化及性质研究";邹宗亮等;《生物工程学报》;20040108;第17卷(第5期);摘要,第499页左栏第2段 * |
"谷物中赭曲霉毒素A核酸适配体荧光传感器的研究";唐琳玥;《福建分析测试》;20180115;第27卷(第1期);第6-12页 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN110734962A (zh) | 2020-01-31 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
kholafazad Kordasht et al. | Biosensing of microcystins in water samples; recent advances | |
Pebdeni et al. | Recent advances in optical biosensors for specific detection of E. coli bacteria in food and water | |
Eivazzadeh-Keihan et al. | Recent advances in nanomaterial-mediated bio and immune sensors for detection of aflatoxin in food products | |
Van Dorst et al. | Recent advances in recognition elements of food and environmental biosensors: A review | |
Usha et al. | Urinary p-cresol diagnosis using nanocomposite of ZnO/MoS2 and molecular imprinted polymer on optical fiber based lossy mode resonance sensor | |
Sajid et al. | Designs, formats and applications of lateral flow assay: A literature review | |
Campas et al. | Novel nanobiotechnological concepts in electrochemical biosensors for the analysis of toxins | |
Gattani et al. | Recent progress in electrochemical biosensors as point of care diagnostics in livestock health | |
CN112280831B (zh) | 一种基于DNA walker的电化学生物传感器的制备方法及其应用 | |
Mitchell et al. | Advances in multiplex electrical and optical detection of biomarkers using microfluidic devices | |
Russell et al. | Augmented reality for real-time detection and interpretation of colorimetric signals generated by paper-based biosensors | |
WO2007127512A3 (en) | Ultra sensitive tapered fiber optic biosensor for pathogens, proteins and dna | |
JP2004309493A (ja) | 病原性微生物の分類学的同定及び病原性微生物の毒性タンパク質 | |
CN104502593B (zh) | 一种电化学胃癌肿瘤标志物无标记免疫传感器的制备方法 | |
Shivashakarappa et al. | Nanotechnology for the detection of plant pathogens | |
Zhao et al. | Aptamer-based chemiluminescent optical fiber immunosensor with enhanced signal amplification for ultrasensitive detection of tumor biomarkers | |
Chen et al. | A DNA-functionalized graphene field-effect transistor for quantitation of vascular endothelial growth factor | |
Mao et al. | Accelerated and signal amplified nanozyme-based lateral flow assay of acetamiprid based on bivalent triple helix aptamer | |
CN110734962B (zh) | 一种基于核酸适配体检测食品毒素的方法 | |
Tran et al. | Simple Label‐Free Electrochemical Immunosensor in a Microchamber for Detecting Newcastle Disease Virus | |
Zhu et al. | A sensitive and rapid sensing platform for ochratoxin A detection based on triple-helix molecular switch and CMC-EDC/NHS covalent immobilized paper | |
Wang et al. | A visual cardiovascular biomarker detection strategy based on distance as readout by the coffee-ring effect on microfluidic paper | |
Razavilar et al. | A central composite face-centered design for optimizing the detection of Salmonella typhi with a fluorescence nanobiosensor using the microcontact method | |
Kwon et al. | Fully automated system for rapid enrichment and precise detection of enterobacteria using magneto-electrochemical impedance measurements | |
CN108956991B (zh) | 一种荧光共振能量转移生物传感器及其应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |