CN113484391B - 一种自参比比率电化学生物传感器的构建方法及其黄曲霉毒素b1检测应用 - Google Patents

一种自参比比率电化学生物传感器的构建方法及其黄曲霉毒素b1检测应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物传感器技术领域，涉及一种自参比比率电化学生物传感器的构建方法及其黄曲霉毒素B1检测应用。首先将金纳米粒子修饰到玻碳电极表面，然后通过Au‑S键自组装sDNA，反应后再滴加MCH，经常温孵育封闭非特异性结合位点，然后，在电极表面引入携带Fc的适配体和辅助DNA，得到电化学生物传感器；在其表面修饰AFB1，通过测定传感器电流值，与AFB1浓度构建得到标准曲线；最后通过测定未知样品的电流值，代入构建的标准曲线，即可实现未知样品中AFB1的检测；本发明以单一的信号探针构建自参比比率传感器，得到更可靠更具有抗环境干扰能力的电化学信号，检测选择性好、速度快、灵敏度高。

Description

一种自参比比率电化学生物传感器的构建方法及其黄曲霉毒 素B1检测应用
技术领域
本发明属于生物传感器技术领域，具体涉及一种基于自参比比率电化学生物传感器的制备方法及其应用，可用于对真菌毒素黄曲霉毒素B1(AFB1)检测。
背景技术
黄曲霉毒素(AFT)是黄曲霉和寄生曲霉等某些菌株产生的双呋喃环类毒素，广泛分布在花生、玉米等多种常见农作物中。其衍生物有约20种，分别命名为B1、B2、G1、G2、M1、M2、GM、P1、Q1、毒醇等。其中以B1的毒性最大，致癌性最强。黄曲霉毒素B1(AFB1)可诱导人体细胞的DNA突变，且是一种剧毒的致肝癌物质。AFB1不仅直接危害人类健康，动物食用含AFB1的饲料后其肝、肾、肌肉、血、奶及蛋也回携带毒素极微量毒素。因AFB1的危害及其在自然界广泛的分布，开发了许多公认的先进分析技术来检测AFB1，例如高效液相色谱-荧光检测(HPLC-FL)和酶联免疫吸附测定(ELISA)。但是，这些方法操作复杂，成本高，准确性不足或受存在假阳性结果的限制。因此，开发一种高效、灵敏的电化学传感平台是很有必要的。
电化学方法以其简单，快速响应和低成本等优点而受到了广泛的关注。目前有文献报道已经构建了用于灵敏检测AFT的各种电化学传感器，例如通过常规电化学方法相结合的双模式传感器；但是单信号输出容易受环境因素的影响，导致其灵敏度和精确度不足。
为了使真菌毒素检测的结果更加准确可靠，本发明构建了一种基于单一信号探针的自参比比率适配体传感器用于黄曲霉毒素B1的准确检测。
发明内容
本发明旨在提供一种检测速度快，可靠性高的电化学检测器件，用于直接检测AFB1。本发明使用金纳米粒子(AuNPs)作为基底材料，使基底DNA(sDNA)链在电极表面固定，携带Fc信号的适配体(Fc-Apt)和携带Fc信号的辅助DNA(Fc-aDNA)在电极上自组装。Fc-Apt与Fc-aDNA在电极表面按照一定比例自组装，用交流循环伏安法检测无目标物时的总电化学信号IFc 0中，Fc-Apt产生的电流信号(记为IFc-Apt 0)和Fc-aDNA产生的电流信号(记为IFc-aDNA 0)的占比也是一定的。当目标物AFB1出现与Fc-Apt特异性识别并从电极表面剥离，Fc-aDNA作为参比探针不发生明显变化。即以Fc-aDNA为参比信号，用交流循环伏安法检测对应浓度目标物时的电化学信号IFc，再结合无目标物时确定的IFc-Apt 0/IFc-aDNA 0比率信号值，计算获得加入目标物后IFc-Apt/IFc-aDNA的比率信号值，通过IFc-Apt/IFc-aDNA比率信号值与目标物浓度之间的变化关系实现黄曲霉毒素B1的检测。
通过如下技术方案实现本发明的目的：
本发明首先提供一种基于自参比的比率电化学生物传感器的制备方法，步骤如下：
(1)首先制备得到AuNPs溶液；然后将基底DNA(sDNA)溶液和TCEP(三(2-羧乙基)磷酸酯)溶液混合，得到混合溶液A，使sDNA上的-SH充分活化；再将相同浓度的Fc-Apt溶液和Fc-aDNA溶液混合均匀，得到混合溶液B；
(2)取步骤(1)制备的AuNPs溶液滴加到玻碳电极(GCE)表面，进行第一次孵育，然后取步骤(1)制备的混合溶液A继续滴加到GCE表面，固定反应一段时间；通过Au-S键结合作用力，将sDNA链固定在玻碳电极表面；再将巯基己醇(MCH)滴加到GCE表面，进行第二次孵育；最后将混合溶液B修饰在玻碳电极表面，进行第三次孵育，得到自参比比率电化学生物传感器。
进一步地，步骤(1)中，所述AuNPs溶液的浓度为5nM；所述sDNA溶液和TCEP溶液的浓度分别为0.5μM和1mM；所述Fc-Apt和Fc-aDNA的浓度均为0.5μM。
进一步地，步骤(1)中，所述基底DNA(sDNA)溶液和TCEP溶液混合时的体积比为1:1；所述Fc-Apt溶液和Fc-aDNA溶液混合时的体积比为1:1。
进一步地，步骤(2)中，所述AuNPs溶液、混合溶液A、混合溶液B滴加到GCE电极表面的用量均为8μL。
进一步地，步骤(2)中，所述固定反应一段时间为14h；所述巯基己醇的浓度为1mM，滴加到GCE电极表面的用量为8μL。
进一步地，步骤(2)中，所述第一次孵育的温度为37℃，孵育时间为30-80min。
进一步地，步骤(2)中，所述第二次孵育为常温孵育，孵育时间为30-80min。
进一步地，步骤(2)中，所述第三次孵育为常温孵育，孵育时间为60min。
本发明还涉及一种基于自参比的比率电化学生物传感器检测黄曲霉毒素B1的用途，步骤如下：
(1)取多个上述步骤中已经构建的电化学生物传感器，在其表面分别修饰不同浓度V1体积的AFB1溶液，一个浓度的AFB1溶液对应修饰一个电化学生物传感器，浓度和电化学生物传感器呈一一对应关系；经常温孵育一段时间，得到已完成识别检测的电化学生物传感器界面；
(2)用三电极体系(GCE工作电极，Pt对电极，Ag/AgCl参比电极)在CHI660E电化学工作站上选择交流伏安法(ACV)检测步骤(1)中修饰AFB1的电化学生物传感器界面电流；由于传感器表面的Fc-Apt与目标物结合并被带离电极表面，交流伏安法测量电极表面剩余的Fc-Apt产生的Fc氧化还原电流(IFc-Apt)，Fc-aDNA不与目标物结合，不发生变化的Fc-aDNA产生的Fc氧化还原电流(IFc-aDNA)；以IFc-Apt和IFc-aDNA作比率，IFc-Apt/IFc-aDNA比率信号值与AFB1溶液的浓度呈负相关，每一个浓度的AFB1会对应一个比率信号值，根据比率信号值和AFB1浓度的对数值构建得到标准曲线；
(3)样品中AFB1的检测：将样品处理后得到样品液，修饰V2体积的的样品液于电化学生物传感器表面，常温孵育后按照步骤(2)进行操作测定电流值，分析数据得IFc-Apt/IFc-aDNA比率信号值；将IFc-Apt/IFc-aDNA比率信号值代入步骤(2)构建的标准曲线，即可获知样品中AFB1的浓度；实现未知样品中黄曲霉毒素B1检测的用途。
进一步地，步骤(1)中，所述AFB1溶液的浓度为0.1pg mL-1-10ng mL-1；所述常温孵育一段时间为30-80min。
进一步地，步骤(3)中，所述常温孵育一段时间为30-80min。
进一步地，所述V1、V2的用量均为8μL。
本发明的有益效果：
(1)本发明的电化学生物传感器构筑简单，无毒。
(2)本发明利用辅助DNA，构建了一个可以在单电极表面提供内置自参比信号的比率电化学传感器，实现简捷的实现参比信号的引入。
(3)本发明利用适配体和辅助DNA携带相同的电化学信号探针，构建基于单一探针的自参比比率电化学传感器，相同探针对环境干扰的响应程度相同，可以有效的屏蔽检测体系的环境对信号产生的影响，实现了比率电化学信号的精准获取，有效提高了检测的可靠性。
附图说明
图1为本发明电化学生物传感器的检测机理图。
图2为本发明电化学生物传感器可行性验证的结果图。
图3中(A)为pH与未加入目标物时IFc-Apt 0/IFc-aDNA 0比率信号值的关系图；(B)图为温度与未加入目标物时IFc-Apt 0/IFc-aDNA 0比率信号值的关系图；(C)优化sDNA的孵育时间图；(D)优化目标物的孵育时间图。
图4为本发明电化学生物传感器与AFB1浓度对数的线性关系图。
具体实施方式：
结合附图对本发明的实施例作详细说明：实施例在本发明的技术方案为前提下进行，给出了详细实施步骤和具体操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
本发明所提及的试剂：sDNA溶液、Fc-Apt溶液、Fc-aDNA溶液、巯基己醇、AFB1溶液均购买自上海生物工程公司。
本发明所用的电极体系基于传统三电极体系：1.玻碳工作电极2.铂丝对电极3.银/氯化银参比电极；
(1)本发明制备的电化学生物传感器用于AFB1检测的可行性探究；
具体方法操作为：三组实验，分别为0ng mL-1AFB1，10ng mL-1AFB1,100ng mL- 1AFB1，此三组实验分别记为组A、组B、组C。
组A操作为：将制备的AuNPs溶液8μL修饰在裸的玻碳电极表面，之后将浓度为0.5μM的sDNA溶液8μL进一步修饰到电极表面在4℃孵育14h。然后，用8μL，1mM巯基己醇滴在电极表面，封闭AuNPs非特异性结合位点，在室温下封闭40min。0.5μM Fc-Apt和Fc-aDNA混合溶液修饰8μL，用于引入电化学信号探针，单双链自组装反应时长为60min。在CHI660E电化学工作站上选择ACV测传感器界面的电流。由于传感器表面aDNA和Apt携带二茂铁，交流伏安法可测量其在氧化还原过程中产生的电流强度，通过电流强度反映传感器界面反应的进行程度。
组B操作为：将制备的AuNPs溶液8μL修饰在裸的玻碳电极表面，之后将浓度为0.5μM的sDNA溶液8μL进一步修饰到电极表面在4℃孵育14h。然后，用8μL，1mM巯基己醇滴在电极表面，在室温下封闭40min。0.5μM Fc-Apt和Fc-aDNA混合溶液修饰8μL，反应时长为60min。加入8μL 10ng mL-1目标物AFB1，目标物与Fc-Apt特异性结合并将Fc-Apt拽离电极表面，反应时长为70min。与组A同样检测电流强度。
组C的操作为：将制备的AuNPs溶液8μL修饰在裸的玻碳电极表面，之后将浓度为0.5μM的sDNA溶液8μL进一步修饰到电极表面在4℃孵育14h。然后，用8μL，1mM巯基己醇滴在电极表面，在室温下封闭40min。0.5μM Fc-Apt和Fc-aDNA混合溶液修饰8μL，反应时长为60min。加入8μL 10ng mL-1目标物AFB1，目标物与Fc-Apt特异性结合并将Fc-Apt拽离电极表面，反应时长为70min。按组A、B同样方法获得电流。根据三组对照实验的结果通过图2可以看出有10ng mL-1和100ng mL-1目标物电化学信号相较无目标物有显著下降，且目标物浓度为100ng mL-1时Fc信号下降更明显，证明该传感器可以通过电化学信号的变化实现对AFB1的检测。
(2)Fc-Apt和Fc-aDNA在不同温度、pH的初始比值；
考察Fc-Apt和Fc-aDNA的初始比值，即在未加入目标物时IFc-Apt 0/IFc-aDNA 0的比率信号值。
组A操作为：将制备的AuNPs溶液8μL修饰在裸的玻碳电极表面，之后将浓度为0.5μM的sDNA溶液8μL进一步修饰到电极表面在4℃孵育14h。然后，用8μL，1mM巯基己醇滴在电极表面，在室温下封闭40min。0.5μM Fc-Apt和aDNA混合溶液修饰8μL，反应时长为60min。在CHI660E电化学工作站上选择交流伏安法(ACV)检测传感器界面的电流。
组B操作为：将制备的AuNPs溶液8μL修饰在裸的玻碳电极表面，之后将浓度为0.5μM的sDNA溶液8μL进一步修饰到电极表面在4℃孵育14h。然后，用8μL，1mM巯基己醇滴在电极表面，在室温下封闭40min。0.5μM Apt和Fc-aDNA混合溶液修饰8μL，反应时长为60min。在CHI660E电化学工作站上选择交流伏安法(ACV)检测传感器界面的电流。
分别在温度条件为15，20，25，30，35，40℃时(pH 7.4)，测定组A和组B中传感器界面的电流，并通过数据处理得IFc-Apt 0/IFc-aDNA 0比率信号值；分别在pH条件为4，5，6，7.4，8，9，10时(温度25℃)，测定组A和组B中传感器界面的电流，并通过数据处理得IFc-Apt 0/IFc-aDNA 0的数值。
通过图3中B图可以看出IFc-Apt 0/IFc-aDNA 0在温度条件为15，20，25，30，35，40℃时(pH7.4)，比率信号初始值相同；通过图3中A图可以看出IFc-Apt 0/IFc-aDNA 0在pH条件为4，5，6，7，8，9，10时(温度25℃)，比率信号初始值相同。
(3)sDNA孵育时长的优化；
优化sDNA孵育时长，将AuNPs溶液8μL修饰在裸的玻碳电极表面，之后将浓度为0.5μM的sDNA溶液8μL进一步修饰到电极表面，在4℃孵育4、6、8、10、12、14、16h。然后用8μL，1mM巯基己醇滴在电极表面，封闭Au活性位点。在室温下封闭40min。0.5μMFc-Apt和Fc-aDNA混合溶液修饰8μL，反应时长为60min。在CHI660E电化学工作站上选择交流伏安法(ACV)检测传感器界面的电流，由于sDNA孵育时长不同，传感器表面结合的Au-S键结合程度不同，通过Fc产生的电流强度反映传感器界面反应的进行程度。
通过图3中C图可以看出sDNA孵育时长为14h时电化学信号响应已达到饱和，因此选择14h作为sDNA的最优孵育时长。
(4)目标物结合反应时长的优化；
优化sDNA目标物结合反应时长，将AuNPs溶液8μL修饰在裸的玻碳电极表面，之后将浓度为0.5μM的sDNA溶液8μL进一步修饰到电极表面，在4℃孵育14h。然后用8μL，1mM巯基己醇滴在电极表面，封闭Au活性位点。在室温下封闭40min。0.5μM Fc-Apt和Fc-aDNA混合溶液修饰8μL，反应时长为60min。加入0.1ng mL-1目标物AFB1，反应时长为20、30、40、50、60、70、80min。在CHI660E电化学工作站上选择交流伏安法(ACV)检测传感器界面的电流，由于目标物与Fc-Apt结合时长不同，传感器表面结未被目标物拽离的Fc-Apt的量不同，通过Fc产生的电流强度反映传感器中与Fc-Apt结合的目标物的量。
通过图3中D图可以看出目标物结合反应时长为60min时电化学信号响应降到最低并趋于稳定，因此选择60min作为目标物结合反应时长。
实施例1：
(1)将制备的AuNPs溶液8μL修饰在裸的玻碳电极表面，之后将浓度为0.5μM的sDNA溶液8μL进一步修饰到电极表面在4℃孵育14h。然后，用8μL，1mM巯基己醇滴在电极表面，在室温下封闭40min。0.5μM Fc-Apt和Fc-aDNA混合溶液修饰8μL，反应时长为60min。得到基于自参比的比率电化学生物传感器。
(2)取4个上述步骤中已经构建的电化学生物传感器，在其表面分别修饰浓度为0.1pg mL-1,1pg mL-1,10pg mL-1,100pg mL-1,1ng mL-1,10ng mL-1AFB1溶液，常温孵育60min，得到已完成识别检测的电化学生物传感器界面；一个浓度的AFB1溶液对应修饰一个电化学生物传感器，浓度和电化学生物传感器呈一一对应关系；
(3)用三电极体系(GCE工作电极，Pt对电极，Ag/AgCl参比电极)在CHI660E电化学工作站上选择交流伏安法(ACV)检测步骤(4)中浸泡处理的电化学生物传感器界面的电流，传感器表面由于自组装丰富的二茂铁，交流伏安法测量表二茂铁在氧化还原过程中产生的电流强度；IFc-Apt/IFc-aDNA比率信号值与AFB1溶液的浓度负相关，每一个浓度的AFB1会对应一个比率信号值，根据比率信号值和AFB1浓度的对数构建得到标准曲线；
计算标准液中AFB1浓度CAFB1与IFc-Apt/IFc-aDNA比率信号值的线性回归方程，方程公式为IFc-Apt/IFc-aDNA＝0.689-0.164log(CAFB1)作为实际检测中的线性方程。
通过图4可以看出提出的传感策略，针对AFB1检测的线性范围为0.1pg mL-1到10ngmL-1，跨越5个数量级。
(4)玉米样品检测：将5g玉米样品磨碎浸泡在含有5mL甲醇，15mL超纯水的混合溶液中，震荡1.5小时，之后在6000转离心10分钟，取上清液作为玉米样品提取液。加入10pgmL-1AFB1进行检测，并代入步骤(3)中的线性回归方程中，获得其检测回收率，具体如表1所示。
表1：玉米样品中AFB1的检测回收率
通过表1可以看出，本实施例单一探针产生的电化学信号可以灵敏定量检测待测样品中的AFB1，不需要专业培训，操作简便。
说明：以上实施例仅用以说明本发明而并非限制本发明所描述的技术方案；因此，尽管本说明书参照上述的各个实施例对本发明已进行了详细的说明，但是本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换；而一切不脱离本发明的精神和范围的技术方案及其改进，其均应涵盖在本发明的权利要求范围内。

Claims (9)

1.基于电化学生物传感器用于检测黄曲霉毒素B1的用途，其特征在于，步骤如下：
(1)首先制备得到AuNPs溶液；然后将sDNA溶液和TCEP溶液混合，得到混合溶液A；再将相同浓度的Fc-Apt溶液和Fc-aDNA溶液混合均匀，得到混合溶液B；
(2)取步骤(1)制备的AuNPs溶液滴加到玻碳电极表面，进行第一次孵育，然后取步骤(1)制备的混合溶液A继续滴加到玻碳电极表面，固定反应一段时间；通过Au-S键结合作用力，将sDNA链固定在玻碳电极表面；再将巯基己醇滴加到玻碳电极表面，进行第二次孵育；最后将混合溶液B修饰在玻碳电极表面，进行第三次孵育，得到自参比比率电化学生物传感器；
(3)取多个所述电化学生物传感器，在其表面分别修饰不同浓度V1体积的AFB1溶液，一个浓度的AFB1溶液对应修饰一个电化学生物传感器，浓度和电化学生物传感器呈一一对应关系；经常温孵育一段时间，得到已完成识别检测的电化学生物传感器界面；
(4)用GCE工作电极、Pt对电极和Ag/AgCl参比电极三电极体系，在CHI660E电化学工作站上选择交流伏安法检测步骤(3)中修饰AFB1的电化学生物传感器界面电流；由于传感器表面的Fc-Apt与目标物结合并被带离电极表面，交流伏安法测量电极表面剩余的Fc-Apt产生的Fc氧化还原电流，记为IFc-Apt；Fc-aDNA不与目标物结合，检测不发生变化的Fc-aDNA产生的Fc氧化还原电流，记为IFc-aDNA；以IFc-Apt和IFc-aDNA作比率，IFc-Apt/IFc-aDNA比率信号值与AFB1溶液的浓度呈负相关，每一个浓度的AFB1会对应一个比率信号值，根据比率信号值和AFB1浓度的对数值构建得到标准曲线；
(5)样品中AFB1的检测：将样品处理后得到样品液，修饰V2体积的样品液于电化学生物传感器表面，常温孵育后按照步骤(4)进行操作测定电流值，分析数据得IFc-Apt/IFc-aDNA比率信号值；将IFc-Apt/IFc-aDNA比率信号值代入步骤(4)构建的标准曲线，即可获知样品中AFB1的浓度；实现未知样品中黄曲霉毒素B1检测的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，步骤(1)中，所述AuNPs溶液的浓度为5nM；所述sDNA溶液和TCEP溶液的浓度分别为0.5μM和1mM；所述Fc-Apt和Fc-aDNA的浓度均为0.5μM。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，步骤(1)中，所述sDNA溶液和TCEP溶液混合时的体积比为1:1；所述Fc-Apt溶液和Fc-aDNA溶液混合时的体积比为1:1。
4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，步骤(2)中，所述AuNPs溶液、混合溶液A、混合溶液B滴加到GCE电极表面的用量均为8μL。
5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，步骤(2)中，所述固定反应一段时间为14h；所述巯基己醇的浓度为1mM，滴加到GCE电极表面的用量为8μL。
6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，步骤(2)中，所述第一次孵育的温度为37℃，孵育时间为30-80min；所述第二次孵育为常温孵育，孵育时间为30-80min；所述第三次孵育为常温孵育，孵育时间为60min。
7.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，步骤(3)中，所述AFB1溶液的浓度为0.1pgmL-1-10ng mL-1；所述常温孵育一段时间为30-80min。
8.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，步骤(5)中，所述常温孵育一段时间为30-80min。
9.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，步骤(3)-(5)中所述V1、V2的用量均为8μL。
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