CN110208343B - 一种检测黄曲霉毒素b1的比率电化学生物传感器的制备方法 - Google Patents

一种检测黄曲霉毒素b1的比率电化学生物传感器的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物传感器技术领域，具体涉及一种检测黄曲霉毒素B1的比率电化学生物传感器的制备方法。硫堇THI与还原氧化石墨烯rGO复合材料作为信标分子一，AFB1适配体携带的二茂铁作为信标分子二，带正电的壳聚糖通过静电吸附作用将两者连接并固定在玻碳电极表面。本发明中，引入AFB1适配体，提高了比率生物传感器毒素AFB1的高特异性；构思在适配体两端标记Fc信号，实现了对比率信号的放大。构筑的比率电化学生物传感器检测线性范围为0.01ng·mL‑1‑100ng·mL‑1,检出限为3.3pg·mL‑1。通过探究，该传感器的制备方法简单，选择性高，灵敏度高，重现性好，稳定性好，为检测实际样品中的AFB1提供良好的传感平台。

Description

一种检测黄曲霉毒素B1的比率电化学生物传感器的制备方法
技术领域
本发明属于生物传感器技术领域，具体涉及一种基于静电作用的比率电化学生物传感器制备方法及其应用，可用于对真菌毒素黄曲霉毒素B1(AFB1)检测。
背景技术
真菌毒素是由某些真菌产生的毒性次生代谢产物。在所有真菌毒素中，AFB1毒性最强，对人类健康构成严重威胁(致癌物、致畸物和致突变物)，已被国际癌症研究机构(IARC)列为第一批人类致癌物。AFB1容易在花生、玉米、小麦等农作物中产生，所以为了保护消费者的健康和防止食品安全问题，欧盟委员会规定粮食中的AFB1最高含量为2μg/kg。目前，AFB1现有的检测方法各有其优缺点。例如，高效液相色谱与质谱联用和薄层色谱法具有较高的准确度，但是，操作繁琐、成本高。然而，电化学发光、光电化学和电化学方法在操作方法、检测特异性和应用范围等方面都有明显的优势。电化学法具有灵敏度高、选择性好、操作简单、成本低、小型化等优点，引起了研究者的广泛关注。但是，单信号电化学容易受到干扰因素如环境条件、复杂的操作、缓慢的电子转移动力学等影响，产生假阳性或假阴性信号。因此，开发一种高效、灵敏的电化学传感平台是很有必要的。
双信号输出模式的比率电化学检测技术具有固有的内置校正，可用于消除系统固有的背景电化学信号的影响，由于其具有较高灵敏度、优异的选择性、良好的可靠性和再现性，已经被广泛研究。目前，大多数比率生物传感器的研究利用二茂铁(Fc)和亚甲基蓝(MB)等电化学信号标记DNA分子，还未有文献报道在裸玻碳电极表面修饰无标签信号分子作为稳定信号，引入DNA链携带的另一个电化学分子来获得高灵敏度比率电化学生物传感器。
发明内容
本文旨在发明一种集高稳定性、高选择性、高灵敏度、低干扰等优点为一体的比率电化学生物传感器直接检测AFB1。我们提出了一种新型比率电化学传感器的构建方法，实现对AFB1的检测。本发明介绍了一种无标记比率信号分子硫堇与还原氧化石墨烯(THI-rGO)复合材料，其通过硫堇(THI)和还原石墨烯氧化物(rGO)的非共价结合形成。通过静电吸附作用将壳聚糖固定在电极表面，在3’末端和5’末端携带比率信号分子Fc的适配体通过与壳聚糖的静电作用而固定在被修饰的电极表面。获得新型比率电化学生物传感器，用于对实际样品灵敏、快速的分析。
本发明通过如下技术方案实现：
一种电位选择比率光电化学生物传感器构建的方法，步骤如下：
(1)THI-rGO复合材料的制备：
首先，分别将THI、rGO用超纯水溶解并室温保存，THI需要避光；然后用细胞粉碎机处理rGO，提高其在水中的分散性；最后，将THI溶液与处理的rGO分散液混合搅拌并离心水洗，得到THI-rGO复合材料，室温储存备用；
(2)将玻碳电极依次用不同粒径的三氧化二铝粉末打磨，在乙醇和水中超声后于空气中干燥；
(3)将步骤(1)制备的THI-rGO复合材料修饰到步骤(2)所制得的玻碳电极表面，并在室温下自然晾干；记为THI-rGO/GCE；
(4)将壳聚糖修饰在步骤(3)所制得的传感器表面，并在室温下自然晾干；传感器表面形成一层膜结构，记为CS/THI-rGO/GCE；
(5)将二茂铁Fc修饰的AFB1适配体修饰在步骤(4)所获得的传感器表面，壳聚糖与AFB1适配体之间的静电吸附作用使AFB1适配体被固定在电极表面，从而获得高灵敏比率电化学生物传感器，记为APT/CS/THI-rGO/GCE。
步骤(1)中，THI的浓度为5μg·mL-1，rGO浓度为0.1mg·mL-1，细胞粉碎机处理rGO时间为30min，两个材料混合搅拌时间为12h，离心水洗三次，离心转速为8000rpm，每次15min，最终得到沉淀溶解在超纯水中；THI溶液：rGO分散液的体积比为1:3。
步骤(2)中，玻碳电极的直径d＝3mm；所用的三氧化二铝粉末的粒径依次为0.3μm、0.05μm。
步骤(3)中，THI-rGO复合材料的用量为6μL。
步骤(4)中，壳聚糖的浓度为0.5wt％，pH为5.0，用量为8μL。
步骤(5)中，二茂铁Fc修饰的AFB1的适配体浓度所用量为1.0-3.0μM，用量为6μL；反应温度为4℃，反应时间为6-14h。
在上述所制得的生物传感器表面依次修饰不同浓度的AFB1溶液，室温下绑定时间为0.4-1.6h，AFB1浓度依次为0.01ng·mL-1,0.05ng·mL-1,0.1ng·mL-1,0.5ng·mL-1,5ng·mL-1,20ng·mL-1,100ng·mL-1，之后用Tris-HCl(pH＝7.4)溶液对电极进行清洗。制得的传感器作为工作电极，饱和Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为对电极，由型号为CHI750E的电化学工作站记录与检测电化学信号。在0.1M PBS(pH＝7.0)缓冲溶液中进行测试。扫描电压范围-0.4-0.7V，振幅为0.025V，频率为25Hz。
本发明的有益效果：
(1)本发明的比率电化学生物传感器可同时获得两个检测信号，信息量大，精准度、可信度高。
(2)本发明将一个比率信号分子修饰在电极表面，作为传感器的内标分子，提高了传感器的准确度。
(3)本发明在适配体两端修饰比率分子，实现比率信号的放大，解决了DNA链携带信号分子电化学信号小的难题。
(4)本发明引入特异性识别元件AFB1的适配体，提高了比率生物传感器的选择性，降低了与AFB1同时存在毒素的干扰，实现对AFB1的特异性分析。
(5)本发明构建的比率电化学生物传感器用于AFB1的检测，灵敏度高、选择性好、稳定性好，线性范围宽,为0.01-100ng·mL-1。
附图说明
图1为比率电化学生物传感器构建过程图。
图2(A)为AFB1适配体孵育时间与IFc关系图；(B)为目标物孵育时间与IFc关系图。
图3(A)为rGO的SEM图；(B)复合材料THI-rGO的SEM图；(C)rGO的TEM图；(D)复合材料THI-rGO的SEM图。
图4(A)不同浓度AFB1所对应的电化学信号ITHI与IFc的变化：a-g浓度依次为0.01,0.05,0.1,0.5,5,20,100ng·mL-1；(B)不同浓度AFB1对数与电化学信号ITHI/IFc之间构建的线性关系。
图5(A)不同电极之间的比率生物传感器的重现性，(B)适配体传感器连续放置7天的稳定性能。
图6比率生物传感器的选择性。干扰物分别为伏马菌素；黄曲霉毒素B2；玉米赤霉烯酮；赭曲霉毒素A。
具体实施方式：
实施例1
按照图1所述的的制备工艺流程，比率电化学生物传感器的制备方法包括以下步骤：
(1)THI-rGO复合材料的制备：
首先，称量1mg THI用超纯水溶解，得到50mL浓度为20μg·mL-1的THI溶液，并逐级稀释至5μg·mL-1，避光室温储存；称量3mg rGO并分散在30mL超纯水中从而得到浓度为0.1mg·mL-1的rGO分散溶液，利用细胞粉碎机处理分散液30min并置于室温储存待用。
然后，取3mL 5μg·mL-1的THI与15mL 0.1mg·mL-1的rGO在100mL的烧杯中混合并搅拌12h，搅拌结束，将溶液置于10mL离心管，在转速为8000rpm，离心时间为15min条件下，离心水洗三次，得到沉淀
最后，将所得沉淀溶解在3mL超纯水中，室温保存备用。
(2)将玻碳电极(d＝3mm GCE)依次用0.3μm和0.05μm的三氧化二铝粉末打磨，在乙醇和水中超声后在空气中干燥。
(3)将6μL THI-rGO复合材料修饰到步骤(2)制备的玻碳电极表面，在室温下自然晾干，此时传感器表示为THI-rGO/GCE；
(4)将8μL浓度为0.5wt％，pH为5.0的壳聚糖修饰在步骤(3)制备的电极表面，室温下自然晾干，传感器表面形成一层膜结构，此时传感器表示为CS/THI-rGO/GCE；
(5)6μL 1.0-3.0μM二茂铁Fc修饰的AFB1适配体修饰在在步骤(4)的电极上，4℃下孵育6-14h,通过静电作用固定在电极表面，传感器表示为APT/CS/THI-rGO/GCE。
制得的传感器作为工作电极，饱和Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为对电极，由型号为CHI750E的电化学工作站记录与检测电化学信号。在0.1M PBS(pH＝7.0)缓冲溶液中进行测试。扫描电压范围-0.4-0.7V，振幅为0.025V，频率为25Hz。
图3(A)为rGO的SEM图，结果表明rGO呈片状结构并且表面有轻微皱纹；图3(B)是THI-rGO复合材料的代表性SEM图像，可观察到大量的硫堇分子附着在rGO表面；图3(C)与(D)分别为rGO与复合材料THI-rGO的SEM图，证明rGO与THI复合之后溶解性更好。
实施例2
制备的比率电化学生物传感器检测黄曲霉毒素B1优化实验条件：
将实施例1制备的生物传感器在4℃条件下放置6、8、10、12、14h，检测Fc电化学信号。
图2(A)为AFB1适配体孵育时间与IFc关系图，适体孵育时间从6h增加到10h，IFc逐渐增加，在10h达到平稳。因此，选择12h为适配体的最佳孵育时间。
实施例3
制备的比率电化学生物传感器检测黄曲霉毒素B1优化实验条件：
在实施例2获得的条件最佳的比率生物传感器的基础上，于传感器表面修饰目标物AFB1，如图2(B)为目标物孵育时间与IFc关系图，目标物在电极表面孵育时间从0.3h到1.0h，IFc信号逐渐降低，在1h后IFc信号无明显变化，所以，选择目标物AFB1的孵育时间为1.3h。
实施例4
比率电化学生物传感器检测黄曲霉毒素B1：
分别用0.01,0.05,0.1,0.5,5,20,100ng·mL-1的黄曲霉毒素B1修饰实施例2所获得的最佳比率电化学生物传感器，根据实施例3得到的最佳实验条件，由型号为CHI750E的电化学工作站记录与检测电化学峰电流，并得到两信号峰电流比(ITHI/IFc)对不同浓度AFB1的响应。评价该比率传感器的分析性能。随着AFB 1浓度的增加，THI氧化峰电流不变，Fc氧化峰电流减小并且在一定范围内ITHI/IFc与AFB1浓度的对数呈线性关系。
实施例5
比率电化学生物传感器选择性分析：
根据实施例3探究的最佳比率电化学生物传感器的实验条件，干扰物FB1(10ng··mL-1)、AFB2(10ng·mL-1)、ZEN(10ng·mL-1)和OTA(ng·mL-1)分别与传感器进行孵育，所得电化学响应结果与空白试验结果基本一样，但是，0.5ng·mL-1AFB1与传感器孵育后，电化学信号响应结果明显高于空白。当生物传感器与0.5ng·mL-1AFB1和4种干扰物(10ng mL-1)的混合物共同孵育时，其响应与单纯AFB1响应相比，基本保持不变。结果表明，电化学生物传感器具有良好的特异性，可用于AFB1的检测。
从图4(A)可以看出，随着AFB1浓度的增加(a-g的浓度依次为0.01、0.05、0.1,0.5、5、20、100ng·mL-1)，THI信号基本保持不变，Fc信号逐渐降低，这应归因于AFB1与其适配体的特异性结合并使其适配体远离电极表面。
从图4(B)可以看出，电化学信号比(ITHI/IFc)与AFB1浓度的对数值(logCAFB1)绘制的标准曲线为ITHI/IFc＝0.156+1.33logCAFB1(R2＝0.998)，线性范围为0.01-100ng·mL-1，检测限为3.33pg·mL-1。
从图5(A)中可以看出比率生物传感器具有良好的重现性。
从图5(B)中可以看出比率生物传感器具有良好的稳定性。
从图6中可以看出其他毒素干扰物FB1,AFB2,ZEN,OTA以及四类毒素的混合所引起的电化学信号的变化可忽略不计，从而证明该比率电化学生物传感器具有良好的选择性。

Claims (6)

1.一种检测黄曲霉毒素B1比率电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤如下：
(1)THI-rGO复合材料的制备：
首先，分别将THI、rGO用超纯水溶解并室温保存，THI需要避光；然后用细胞粉碎机处理rGO，提高其在水中的分散性；最后，将THI溶液与处理的rGO分散液混合搅拌并离心水洗，得到THI-rGO复合材料，室温储存备用；
(2)将玻碳电极依次用不同粒径的三氧化二铝粉末打磨，在乙醇和水中超声后于空气中干燥；
(3)将步骤(1)制备的THI-rGO复合材料修饰到步骤(2)所制得的玻碳电极表面，并在室温下自然晾干；
(4)将壳聚糖修饰在步骤(3)所制得的传感器表面，并在室温下自然晾干；
(5)将二茂铁Fc修饰的AFB1适配体修饰在步骤(4)所获得的传感器表面，壳聚糖与AFB1适配体之间的静电吸附作用使AFB1适配体被固定在电极表面，从而获得高灵敏比率电化学生物传感器。
2.根据权利要求1所述的检测黄曲霉毒素B1比率电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，THI的浓度为5μg·mL-1，rGO浓度为0.1mg·mL-1，细胞粉碎机处理rGO时间为30min，两个材料混合搅拌时间为12h，离心水洗三次，离心转速为8000rpm，每次15min，最终得到沉淀溶解在超纯水中；THI溶液：rGO分散液的体积比为1:3。
3.根据权利要求1所述的检测黄曲霉毒素B1比率电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，玻碳电极的直径d＝3mm；所用的三氧化二铝粉末的粒径依次为0.3μm、0.05μm。
4.根据权利要求1所述的检测黄曲霉毒素B1比率电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，THI-rGO复合材料的用量为6μL。
5.根据权利要求1所述的检测黄曲霉毒素B1比率电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，壳聚糖的浓度为0.5wt％，pH为5.0，用量为8μL。
6.根据权利要求1所述的检测黄曲霉毒素B1比率电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，二茂铁Fc修饰的AFB1的适配体浓度所用量为1.0-3.0μM，用量为6μL；反应温度为4℃，反应时间为6-14h。
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