CN115932009A

CN115932009A - 一种快速筛查黄曲霉毒素b1的肝微粒体电极生物传感器及其制备方法与应用

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Publication number: CN115932009A
Application number: CN202310047392.6A
Authority: CN
Inventors: 孙秀兰; 孙鑫宇; 孙嘉笛; 叶永丽; 张银志
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2023-01-31
Filing date: 2023-01-31
Publication date: 2023-04-07

Abstract

本发明公开了一种快速筛查黄曲霉毒素B1的肝微粒体电极生物传感器及其制备方法与应用，属于快速检测技术领域。本发明肝微粒体电极生物传感器的制备是采用Au@MXene纳米复合材料吸附肝微粒体(RLM)，然后以Nafion溶液作为粘连剂，将RLM/Au@MXene粘连到电极表面，即得肝微粒体电极生物传感器。该肝微粒体电极生物传感器可以实现对AFB1的直接筛查，具有灵敏、快速、高效等优点，并且价格低廉，适用于基层或现场检测AFB1。

Description

一种快速筛查黄曲霉毒素B1的肝微粒体电极生物传感器及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种快速筛查黄曲霉毒素B1的肝微粒体电极生物传感器及其制备方法与应用，属于快速检测技术领域。

背景技术

黄曲霉毒素是由真菌、黄曲霉和寄生曲霉产生的次生代谢产物，广泛污染世界各地的农作物，如玉米、花生、小麦、大麦和水稻等。黄曲霉毒素B1(AFB1)是所有黄曲霉毒素中毒性最强的一种，对人类具有严重的毒性。

有研究指出，AFB1对人类和其他动物具有致突变性、致癌性、致畸性、肝脏毒性和胚胎毒性。黄曲霉毒素B1在低暴露剂量下便会对人类及动物产生毒副作用，然而低剂量暴露下的毒性效应难以发现，所以急需寻求一种快速、准确、灵敏且接近体内真实环境的方法，用于黄曲霉毒素B1的毒性筛查。

现有技术中AFB1的检测方法有很多，检测原理也各不相同，每种方法均有自己的优点和缺点，如高效液相色谱法、免疫测定法、化学发光法等，这些方法虽然能够用于AFB1的检测，但这些检测方法操作复杂、耗时耗力，并且灵敏度较低。

因此建立一种灵敏、快速、简便、经济且便携的检测方法是生产经营企业、质控人员、进出口检商迫切需要和食品、环境安全的有力保障。

发明内容

[技术问题]

现有技术AFB1的检测方法操作复杂、耗时耗力，并且灵敏度较低等问题突出。

[技术方案]

针对上述技术问题，本发明提供了一种用于快速筛查AFB1的肝微粒体电极生物传感器及其制备方法与应用；具体是以肝微粒体作为识别元件来制备Nafion/RLM/Au@MXene电极传感器构建电化学工作站，这不仅解决了外加辅酶NADPH作为电子源的限制问题，还充分结合了电化学传感器(成本低，操作简单，响应速度快，灵敏度高等)的多种优势；基于肝微粒体中CYP450酶的电化学传感器还有一个独特之处在于可以记录和定量表征催化循环的各个环节。当有底物存在时，肝微粒体中的CYP450酶会氧化该底物，从而产生与底物浓度成比例的催化电流，具有灵敏、快速、循环多次使用、便携等优点。因此，本发明肝微粒体电极生物传感器的制备，对AFB1的直接筛查提供了快捷有效的手段，适用于基层或现场检测AFB1。

本发明的第一个目的是提供一种快速筛查AFB1的肝微粒体电极生物传感器的制备方法，所述方法包括：采用Au@MXene纳米复合材料吸附肝微粒体，然后将吸附后的复合材料粘连到电极上即得。

在一种实施方式中，所述Au@MXene纳米复合材料与肝微粒体的质量比为2:3～5.5；优选为2:5。

在一种实施方式中，所述将吸附后的复合材料粘连到电极上是在Au@MXene纳米复合材料吸附肝微粒体过程中加入粘连剂；所述粘连剂为Nafion溶液。

在一种实施方式中，所述肝微粒体为大鼠肝微粒体。

在一种实施方式中，所述肝微粒体电极生物传感器的具体制备步骤如下：

(1)取Au@MXene纳米复合材料与超纯水混合，超声分散，形成Au@MXene溶液；

(2)步骤(1)制备的Au@MXene溶液与肝微粒体混合均匀，再加入Nafion溶液，持续搅拌，得混合溶液；

(3)取步骤(2)制备的混合溶液涂抹在电极表面即可。

在一种实施方式中，步骤(1)所述Au@MXene溶液的浓度为0.1～2.5mg/mL，优选为2mg/mL。

在一种实施方式中，步骤(2)所述混合溶液中肝微粒体的浓度为3～5.5mg/mL，优选为5mg/mL；其中，肝微粒体原液浓度为20mg/mL，将肝微粒体与Au@MXene及Nafion溶液混合成3～5.5mg/mL。

在一种实施方式中，所述Au@MXene纳米复合材料的制备包括如下步骤：将HAuCl₄·4H₂O溶液置于圆底烧瓶中，用恒温电磁搅拌器油浴加热至沸腾；然后在搅拌下，迅速加入柠檬酸三纳溶液，继续旋转搅拌，直至溶液呈现清亮的酒红色；室温冷却，然后向冷却后的溶液中加入MXene粉末，超声、洗涤、离心，收集沉淀，烘干即得。

在一种实施方式中，所述HAuCl₄·4H₂O溶液与MXene粉末的配比为3:1～1:4，mL/mg；优选为1:3,mL/mg。

在一种实施方式中，所述MXene粉末的制备包括如下：在室温下，将Ti₃AlC₂粉末溶于氢氟酸(HF)形成悬浮液；然后将悬浮液用去离子水多次漂洗，直至达到pH为6～7；超声、离心，取沉淀物洗涤、干燥即可。

本发明的第二个目的是提供一种由上述所述方法制备得到的肝微粒体电极生物传感器。

本发明的第三个目的是提供一种由上述所述的肝微粒体电极生物传感器在食品工业、饲料行业、环境保护、医学药筛和生物化学检测技术领域中的应用。

本发明的第四个目的是提供一种快速筛查AFB1的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)配置一系列的AFB1标准溶液；

(2)将上述制备的肝微粒体电极生物传感器作为工作电极分别插入步骤(1)制备的一系列的AFB1标准溶液和待测样品溶液中，铂作为对电极，银/氯化银作为参比电极构建电化学工作站，进行电化学分析，测得电流值；

(3)以AFB1标准溶液的浓度为横坐标，步骤(2)中AFB1标准溶液的浓度对应测定的电流值为纵坐标，构建定量关系模型；并依据该定量关系模型和待测样品的电流值，计算待测样品中AFB1的浓度。

在一种实施方式中，所述AFB1标准溶液的浓度为0.01～50μmol/L。

在一种实施方式中，所述AFB1标准溶液是将AFB1溶解在含1％甲醇的PBS溶液中配置而成。

在一种实施方式中，步骤(2)所述电化学分析过程中电压设置为-0.4～-0.6V。

在一种实施方式中，步骤(2)所述电化学工作站还配备LED显示屏。

本发明的第五个目的是提供一种用于检测AFB1的便携式肝微粒体电化学检测仪，所述肝微粒体电化学检测仪包含上述所述的肝微粒体电化学生物传感器和电化学检测器，其中AFB1的标准浓度与电流值构建的定量关系模型内置在电化学检测器程序中。

本发明的第六个目的是提供一种由上述所述便携式肝微粒体电化学检测仪在AFB1检测中的应用；所述应用是将便携式肝微粒体电化学检测仪直接插入测定待测样品中进行检测。

在一种实施方式中，所述待测样品检测前需要将便携式肝微粒体电化学检测仪插入AFB1标准品溶液中进行校正。

[有益效果]

(1)本发明构建的肝微粒体电极生物传感器能够快速、灵敏、高效对AFB1的筛查检测，可在80s内获得检测结果；能够满足工商部门，质检机构，科研高校等机构的检测需要的快速检测产品，适用于食品工业、饲料行业、环境保护、医学药筛和生物化学等领域。

(2)本发明通过引入Au@MXene纳米复合材料，显著提高了电极的导电性及生物相容性，既增加了肝微粒体蛋白的吸附又保护了蛋白的活性，从而提高了传感器的电信号响应及灵敏度；

(3)肝微粒体具有成本低、使用简单、易于储存、更加真实模拟动物肝脏微环境等优点，将肝微粒体作为一种识别元件与电化学相结合，不仅解决了外加辅酶NADPH作为电子源的限制问题，还充分结合了电化学传感(成本低，操作简单，响应速度快，灵敏度高等)的多种优势。

附图说明

图1为本发明实施例1制备肝微粒体电极生物传感器的流程示意图；

图2为本发明实施例2中使用的肝微粒体电极生物传感器构建的检测仪结构图；

图3为本发明实施例2构建的定量关系模型图；

图4为本发明实施例6肝微粒体电极生物传感器构建过程中参数优化数据图；(A)和(B)为不同AuNPs溶液与MXene混合比例构建的肝微粒体电极生物传感器的电化学阻抗数据图；(C)和(D)为不同Au@MXene纳米复合材料修饰浓度制备的肝微粒体电极生物传感器的电化学阻抗数据图；(E)为不同肝微粒体修饰浓度制备的肝微粒体电极生物传感器的循环伏安法测定数据图；

图5为本发明实施例1制备的肝微粒体电极生物传感器的特异性测定数据图；

图6为本发明实施例1和对比例1分别制备的传感器的循环伏安曲线变化图。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明，其目的仅在于更好理解本发明的内容而非限制本发明的保护范围。

本发明涉及的大鼠肝微粒体：购自武汉普莱特生物技术有限公司(中国，湖北)。

实施例1

一种制备快速筛查AFB1的肝微粒体电极生物传感器的方法，所述方法(肝微粒体电极的制备示意图如图1所示)包括如下步骤：

(1)MXene材料的制备：在室温下，将Ti₃AlC₂粉末(2g)溶于80mL 40％氢氟酸(HF)溶液中，腐蚀3d以去除铝层；将所得悬浮液用去离子水多次漂洗，直至达到pH＝6；之后超声1h、离心，去除上层混悬液，取沉淀物用无水乙醇洗涤3次，然后在室温下干燥2d；最后，在真空炉(0.09MPa)中于60℃下烘干24h；

(2)Au@MXene纳米复合材料的合成：采用化学还原的方法合成纳米Au颗粒；

将100mL 0.01％ HAuCl₄·4H₂O溶液置于圆底烧瓶中，用恒温电磁搅拌器油浴加热至沸腾，然后在搅拌下，迅速加入1％柠檬酸三纳溶液2mL，继续旋转搅拌，直至溶液呈现清亮的酒红色，室温冷却，得AuNPs溶液；然后取1mL AuNPs溶液加入3mg步骤(1)制备的MXene粉末，混合均匀，超声30min，得悬浮液；将所得悬浮液用去离子水洗涤三次，离心，收集沉淀，将收集的沉淀置于60℃的真空炉中烘干24h，即得Au@MXene纳米复合材料；

(3)肝微粒体电极的制备：采用简单的浇铸法制备了肝微粒体电极：

称取4mg步骤(2)制备的Au@MXene粉末，与1mL超纯水混合，超声分散30min；形成4mg/mL的Au@MXene溶液；然后，将10μL Au@MXene溶液与5μL大鼠肝微粒体(20mg/mL)混合搅拌20min；随后，向混合物中加入5μL(5％)Nafion溶液，搅拌10min；取5μL涂抹在刚抛光的玻碳电极表面，制备肝微粒体传感器Nafion/RLM/Au@MXene/GCE。

实施例2

一种快速筛查AFB1的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)标准曲线构建

将提纯后的AFB1样品溶解于含1％甲醇的PBS溶液制成不同已知浓度(浓度范围：0.01～50μmol/L)的AFB1标准溶液，然后将实施例1制备的肝微粒体电极传感器插入AFB1标准溶液中，在电压为-0.6V下，进行I-t法扫描，待电信号稳定后，记录电流值；检测电子从工作电极表面到肝微粒体蛋白而形成的电流峰值，以AFB1浓度为横坐标，电流值为纵坐标，构建定量关系模型；

(2)待测样品测定

将实施例1制备的肝微粒体电极插入待测样品溶液中，在电压为-0.6V下，进行I-t法扫描，待电信号稳定后，记录电流值；并依据步骤(1)构建的定量关系模型，计算待测样品中AFB1浓度。

所述肝微粒体电极的整个电极系统结构图如图2所示，构造如下：

整个电极系统包括玻碳工作电极、银/氯化银参比电极和铂对电极；玻碳工作电极表面粘连肝微粒体生物膜；工作电极、对电极和参比电极由电极连线导出，然后连接到多通道电位仪电化学工作站上，检测读数。

如图3所示：构建的定量关系模型方程为:Y＝0.0063C_AFB1+0.5375(R²＝0.998)，检测限为0.01-50μmol/L。

实施例3

一种用于检测AFB1的便携式肝微粒体电化学检测仪的制备方法，所述方法是将实施例2中步骤(1)构建的定量关系模型通过计算机程序内置于检测器，即得到AFB1专用便携式电化学检测仪。

实施例4

一种快速筛查AFB1的方法，所述方法包括：

先使用2个以上AFB1标准品溶液对AFB1专用便携式电化学检测仪进行校正，然后再用于待测样品的测定；便携式电化学检测仪可以根据内置的定量关系模型，最终直接将待测样品中AFB1的浓度显示在检测仪的显示屏上。

实施例5添加回收实验

分别称取3份无污染的玉米样品，每份2g玉米粉，编号为玉米1、玉米2、玉米3。将玉米1、玉米2、玉米3样品分别放入到50mL离心管中，分别向玉米1、玉米2、玉米3中加入100nmol、500nmol、1000nmol的AFB1并在室温下保持2h；然后分别加入20mL 80/20(v/v)的甲醇/水溶液，在室温下搅拌2h；随后在10000rmp下离心10min，收集上清液，用PBS溶液稀释五倍，得到样品提取液；每个样品重复三次。

依据实施例2的测定方法计算待测样品中AFB1浓度和回收率；结果如表1所示，AFB1的回收率为71.43％-87.30％(RSD＝3.59％–7.42％)，符合国家检测标准。表明，构建的肝微粒体电极生物传感器对AFB1的筛查表现出高的准确度，可实际用作粮食样品中AFB1的定量筛查。

表1大鼠肝微粒体电极生物传感器检测玉米样品中的AFB1

实施例6检测条件的优化

1)AuNPs溶液与MXene混合比例优化

参照实施例1，将AuNPs溶液与MXene混合比例分别设置为3：1，2：1，1：1，1：2，1：3，1：4mL/mg，其他条件不变，进行电化学阻抗的测定。

结果如图4B所示：随着MXene比例的增加，肝微粒体电极的阻抗值逐渐减小，当AuNPs溶液与MXene混合比例为1:3mL/mg，肝微粒体电极的阻抗值最小，当再增大MXene比例时，肝微粒体电极的阻抗值又呈上升的趋势；因此，只有AuNPs溶液与MXene混合比例为1:3时，有利于提高肝微粒体传感器的灵敏度。

2)Au@MXene纳米复合材料修饰浓度的优化：

参照实施例1，将Au@MXene的修饰浓度分别设置为0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mg/mL，其他条件不变，进行电化学阻抗的测定。

结果如图4D所示：当Au@MXene的修饰浓度为2mg/mL时，肝微粒体电极的阻抗值最小，更有利于提高肝微粒体传感器的灵敏度。

3)肝微粒体蛋白修饰浓度的优化：

参照实施例1，将肝微粒体蛋白的修饰浓度分别设置为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5mg/mL，其他条件不变，进行循环伏安法的测定。

结果如图4E所示：当肝微粒体蛋白的修饰浓度为5mg/mL时，肝微粒体电极产生的电信号最强，更有利于提高肝微粒体传感器的灵敏度。

实施例7大鼠肝微粒体电极生物传感器的特异性

用实施例1制备的大鼠肝微粒体电极传感器分别检测空白溶液、10μmol/L赭曲霉毒素A(OTA)、10μmol/L玉米赤霉烯酮毒素(ZEN)、10μmol/L黄曲霉毒素M1(AFM1)、10μmol/L黄曲霉毒素B1(AFB1)及混合溶液(10μM OTA,10μM ZEN,10μM AFM1,10μM AFB1)。

将肝微粒体电极传感器分别插入上述溶液中，在-0.6V的电位下，记录传感器的稳定催化电流。结果如图5所示，该传感器在AFB1溶液中表现出较高的催化电流，而在其它三种干扰中则观察到非常小的催化电流信号；这种明显的差异表明该传感器对AFB1具有高度的选择性。

对比例1

直接将10μL超纯水与5μL大鼠肝微粒体混合搅拌20min；随后，向混合物中加入5μL(5％)Nafion溶液，搅拌10min；取5μL涂抹在刚抛光的石墨电极表面，制备肝微粒体电极Nafion/RLM/GCE。

对制备的Nafion/RLM/GCE传感器与实施例1制备的Nafion/RLM/Au@MXene/GCE传感器分别进行肝微粒体氧化还原能力的比较；结果如图6所示，与未加入Au@MXene纳米复合材料的Nafion/RLM/GCE传感器相比，Nafion/RLM/Au@MXene/GCE传感器产生了更强的氧化还原峰，这意味着更强的电极催化性能，从而会增强电极对AFB1的检测灵敏度。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims

1.一种快速筛查AFB1的肝微粒体电极生物传感器的制备方法，其特征在于，所述方法包括：采用Au@MXene纳米复合材料吸附肝微粒体，然后将吸附后的复合材料粘连到电极上即可。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述Au@MXene纳米复合材料与肝微粒体的质量比为2:3～6。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述肝微粒体为大鼠肝微粒体。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述Au@MXene纳米复合材料的制备包括如下：将HAuCl₄·4H₂O溶液置于圆底烧瓶中，用恒温电磁搅拌器油浴加热至沸腾；然后在搅拌下，迅速加入柠檬酸三纳溶液，继续旋转搅拌，直至溶液呈现清亮的酒红色；室温冷却，然后向冷却后的溶液中加入MXene粉末，超声、洗涤、离心，收集沉淀，烘干即得。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述HAuCl₄·4H₂O溶液与MXene粉末的配比为3:1～1:4，mL/mg。

6.由权利要求1～5任一所述的制备方法得到的肝微粒体电极生物传感器。

7.由权利要求6所述的肝微粒体电极生物传感器在食品工业、饲料行业、环境保护、医学药筛和生物化学检测技术领域中的应用。

8.一种快速筛查AFB1的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)配置一系列的AFB1标准溶液；

(2)将权利要求6所述的肝微粒体电极生物传感器作为工作电极分别插入步骤(1)制备的一系列的AFB1标准溶液和待测样品溶液中，铂作为对电极，银/氯化银作为参比电极构建电化学工作站，进行电化学分析，测得电流值；

9.一种用于检测AFB1的便携式肝微粒体电化学检测仪，其特征在于，所述肝微粒体电化学检测仪包含权利要求6所述的肝微粒体电极生物传感器和电化学检测器，其中AFB1的标准浓度与电流值构建的定量关系模型内置在电化学检测器程序中。

10.由权利要求9所述的便携式肝微粒体电化学检测仪在AFB1检测中的应用，其特征在于，所述应用是将便携式肝微粒体电化学检测仪直接插入测定待测样品中进行检测。