CN112986211A

CN112986211A - 一种可靶向触发和自校准的适配体sers传感器高精度检测人体血液中肿瘤标志物的方法

Info

Publication number: CN112986211A
Application number: CN202110258440.7A
Authority: CN
Inventors: 林多; 冯尚源; 吴琼
Original assignee: Fujian Normal University
Current assignee: Fujian Normal University
Priority date: 2021-03-10
Filing date: 2021-03-10
Publication date: 2021-06-18

Abstract

本发明公开了一种可靶向触发和自校准的适配体SERS传感器高精度检测人体血液中肿瘤标志物的方法。首先，制备不同粒径的金纳米粒子，进一步合成带有静默区信号内标的金银核壳纳米颗粒。而后，将制备好的纳米粒子功能化，修饰上适配体DNA及带有拉曼报道分子的互补DNA链。接着，利用DNA自组装特性将两种纳米粒子连接后，合成利用适配体连接的核壳纳米核卫星SERS传感器模型。最后，在适配体SERS传感器中加入不同浓度的肿瘤标志物，由于核酸适配体能特异性识别目标蛋白，可触发核壳纳米核卫星组件解体，导致拉曼探针分子信号的下降。我们利用内标分子的信号对拉曼探针分子的信号进行动态校正，实现灵敏、可靠、准确的定量检测。

Description

一种可靶向触发和自校准的适配体SERS传感器高精度检测人体血液中肿瘤标志物的方法

技术领域

本发明属于生物医学肿瘤标志物检测领域，具体涉及一种可靶向触发和自校准的适配体SERS传感器高精度检测人体血液中肿瘤标志物的方法。

背景技术

癌症是全球第二大死亡原因，2016年约有六分之一的死亡病例是由癌症引起的。液体活检是一种极具潜力的肿瘤体外微创诊断新技术，其通过检测患者血液（尿液、唾液等）中游离的肿瘤相关物质来实现肿瘤的筛查诊断、疗效评估、预后监测。目前，液体活检的主要检测对象包括：肿瘤循环细胞（CTC）、肿瘤循环DNA（ctDNA）、蛋白分子等。其中，蛋白分子是液体活检中的一类重要物质，在肿瘤的发生和增殖过程中，可由肿瘤细胞本身产生或由机体对肿瘤细胞反应而产生，因此常规蛋白分子的异常表达以及特异性蛋白分子的特征表达，与肿瘤的早期病变、进展状况、预后效果紧密相关。因此，蛋白肿瘤标志物的检测在临床上得到了广泛的应用。目前，血液中肿瘤标志物的检测方法有一些，主要包括化学发光免疫法、荧光法、比色法、酶联免疫吸附法（ELISA）等。尽管这些方法具有可接受的准确性和宽广的动态反应范围，但仍存在一些缺点，例如，化学发光免疫的选择性容易受到环境的影响。对于荧光法，其信号易受光漂白影响，导致测量过程中信号波动，比色法虽然简单快速，但不能提供准确的定量，ELISA是临床上最常用的各种生物标志物检测方法，但需要克服劳动强度大、耗时长、程序复杂等一些缺点。因此，探索一种快速、灵敏、准确、方便的策略，提高蛋白肿瘤标志物的检测效率，将具有迫切的临床价值。

近来，表面增强拉曼光谱技术作为一种新型的、功能强大的传感技术逐渐兴起。由于激光束激发的表面等离子体共振效应，吸附在金属纳米结构表面或接近金属纳米结构表面的目标物的拉曼信号将被强烈增强，从而使其具有超灵敏的检测能力，甚至可以达到单分子水平。除了灵敏度高的优点外，SERS还继承了传统拉曼光谱的许多特点，如指纹和非侵入式检测。除了灵敏度上的优点，SERS还继承了传统拉曼光谱的许多特点，如分子“指纹”特性和非侵入式检测。此外，与常用的荧光和近红外光谱方法相比，SERS还表现出许多优点，包括抗光漂白和光毒性，较窄的谱宽允许多路检测，以及没有水的干扰等。由于这些突出的特点，SERS在化学、材料科学、生物化学和生命科学等领域得到了广泛的应用，特别是基于SERS技术的各种新型生物传感器，由于其在高选择性、高灵敏度检测人体体液中肿瘤标志物方面具有良好的应用前景，引起了人们的极大关注。

发明内容

本发明介绍了一种基于核心卫星结构的适配体辅助SERS传感平台，利用识别释放机制检测肿瘤标志物（PSA）。以嵌入拉曼报告分子为内标，合成了一种金属核壳型纳米粒子(Ag@IS@Au)，通过拉曼探针和内标分子的强度比实现SERS信号的动态校准。另外，这些IS分子的SERS信号位于1800-2300 cm^-1的拉曼光谱区域，避免了与内源分子和拉曼探针信号的重叠。因此，这些信息系统的使用将大大提高基于卫星的SERS生物传感器的稳定性和准确性。此外，拉曼探针作为对目标的指示，被牢固地固定在由上述准备好的核心和外部卫星形成的“热点”区域，以产生稳定而强烈的SERS信号，这将提高该传感模型的灵敏度。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种基可靶向触发和自校准的适配体SERS传感器高精度检测人体血液中肿瘤标志物的方法，利用可靶向触发和自校准的适配体SERS传感器，通过免疫方法捕获蛋白肿瘤标志物后测量拉曼标记分子的信号，实现对肿瘤标志物的高精度、高特异性SERS检测;

所述适配体SERS传感器以46 nm的银包金纳米粒子为核，外部卫星是20 nm的金纳米粒子，形成一种核卫星结构的SERS传感模型；核卫星纳米组件中间为嵌入内标分子4MBN的核壳纳米粒子。

所述传感器的制备方法包括以下步骤：通过巯基将适配体修饰在核壳纳米粒子上，并加入PBS缓冲液调节pH值，缓慢搅拌，使其适配体DNA通过巯基与Au@4MBN@Ag结合形成Au@4MBN@Ag^@ADNA NPs，用PBS洗涤浓缩后重悬于PBS中；用同样的方法，将适配体的互补DNA链修饰在卫星Au纳米粒子上，形成Au^@CDNANPs；通过DNA的碱基互补配对，将Au@4MBN@Ag^@ADNANPs与Au^@CDNANPs进行连接，形成核壳卫星结构的适配体SERS传感器模型。

其中适配体为与前列腺抗原特异性结合的DNA单链，适配体的5'端修饰有巯基，使它易与贵金属纳米粒子结合，并在近5'端接上10个胸腺嘧啶，使适配体形成直链，避免贴于金属纳米粒子表面；根据适配体序列设计出互补的DNA单链，所述互补DNA单链的3'端上修饰拉曼报道分子Cy5，通过范德华力、氢键和静电相互作用形成稳定的目标-适配体复合物；

所述与前列腺抗原特异性结合的DNA单链序列为：

SH-(CH₂)₆-TTTTTTTTTTATTAAAGCTCGCCATCAAATAGCTGC；

所述互补的DNA单链序列为：

SH-(CH₂)₆-TTTTTTTTTTGCAGCTATTT-Cy5。

在DNA单链修饰纳米粒子之前，先将单链DNA活化；所述活化包括以下步骤：分别将与肿瘤标志物特异性结合的适配体10^-5 M DNA链和带有拉曼报道分子的互补DNA链放入到5mM TCEP和Tris-HCl缓冲液的混合溶液中，所述DNA、TCEP和Tris-HCl缓冲液的体积比为1:1:1，活化巯基。

一种可靶向触发和自校准的适配体SERS传感器高精度检测人体血液中肿瘤标志物的方法，包括如下步骤:

1）合成两种尺寸的金纳米颗粒Au NPs：在水中加入氯金酸溶液，搅拌沸腾后加入不同体积的柠檬酸三钠溶液还原，持续搅拌并加热15分钟，待室温冷却，获得32nm和20nm的金纳米胶体。

2）合成带有内标（SERS信号在静默区）的金银核壳纳米颗粒Au@4MBN@Ag NPs：将内标4-巯基苯甲腈溶液加入步骤1）中制备好的32 nm的金胶体中，搅拌反应1.5小时，得到Au@MB NPs溶胶；将其离心洗涤后重悬于超纯水中，并加入抗坏血酸，搅拌0.5小时使其分布均匀，再逐滴滴加AgNO₃溶液，反应1小时，形成Au@4MBN@Ag NPs，离心洗涤浓缩后重悬于超纯水中；

3）活化DNA修饰纳米粒子

3-1）DNA活化：分别将可与肿瘤标志物特异性结合的适配体DNA（ADNA）和带有拉曼报道分子的互补DNA（CDNA）放入到TCEP（5mM）和Tris-HCl缓冲液的混合溶液中，反应1小时活化巯基。

3-2）制备适配体DNA修饰的Au@4MBN@Ag NPs：量取步骤2）制备好的带内标的金银核壳纳米粒子，加入步骤3-1）中活化过的适配体DNA中，同时加入PBS调节PH值，在室温下缓慢搅拌12小时，使其适配体DNA通过巯基与Au@4MBN@Ag结合形成Au@4MBN@Ag^@CDNA NPs，用PBS洗涤浓缩后重悬于PBS中。

3-3）制备互补DNA修饰的Au NPs：量取步骤1)制备好的20 nm金纳米粒子，加入步骤3-1）中活化过的互补DNA中，同时加入PBS调节PH值，在室温下缓慢搅拌12小时，使其适配体DNA通过巯基与Au NPs结合形成Au^@ADNA NPs，用PBS洗涤浓缩后重悬于PBS中，作为SERS纳米探针待用。

4）组装核壳卫星结构的适配体SERS传感器溶液：将步骤3-2）制成的Au@4MBN@Ag^@CDNA NPs与步骤3-3）中合成的Au^@ADNA NPs，混合轻轻搅拌反应3小时，利用DNA自组装形成核壳卫星结构的适配体SERS传感器溶液。

5）肿瘤标志物的检测：量取步骤4）制备好的适配体SERS传感器溶液与肿瘤标志物混匀，静置1小时。在一定条件下，用共聚焦拉曼光谱仪检测不同浓度肿瘤标志物与适配体传感器的混合物，该方法主要是对SERS探针信号和内标信号的检测。然后以PSA的浓度的对数值作为横坐标，SERS标记分子Cy5在932 cm^-1峰位的强度与内标4MBN在2221 cm^-1峰位的强度的比值I₉₃₂/I₂₂₂₁（静默区SERS探针与内标的信号强度比率）作为纵坐标，绘制标准溶液的SERS探针与内标信号强度比率-浓度标准曲线。

上述适配体SERS传感器的动态检测范围为10^-2 - 10^-15 mg/mL, 检测极限浓度为0.38 ag/mL。

本发明采用以上技术方案，将“核卫星”等离子体纳米结构的适配体传感器平台作为SERS检测基底，发展一种利用适配体与肿瘤标志物特异性结合，靶向检测目标蛋白的新方法。首先，该发明采用信号处于“静默区”（1800-2300 cm^-1）的SERS探针分子与SERS内标分子，不仅避免了其他蛋白对SERS探针分子信号的干扰，还能对SERS探针分子的拉曼信号进行动态校正。其次，本发明将拉曼报道分子修饰在DNA链上，使其稳定处于核卫星结构“热点”区域内。这些设计有望提高蛋白SERS定量检测的灵敏度、可靠性与准确性，发展一种肿瘤液态活检新技术。因此，实验中所构建的基于核心卫星结构的适配体辅助SERS传感平台在肿瘤标志物超灵敏检测方面展现出巨大的潜力。

附图说明：

图1为本实施例合成的适配体SERS传感器的合成路线及检测反应机理示意图。

图2为实施例制得Au@4MBN@Ag的表征图，其中（A）为紫外-近红外吸收光谱；（B）为动态光散射粒径图；（C）为Au@4MBN@Ag各步骤的拉曼光谱图；（D）为透射电镜图（TEM）

图3为实施例中标准PSA溶液的浓度为10^-15 mg/mL到10^-2 mg/mL范围内的SERS光谱。

图4（A）为实施例中以标记分子Cy5光谱中位于2024 cm^-1处的峰值强度与浓度在10^-15 mg/mL到10^-2 mg/mL范围内的PSA的标准曲线；（B）为以内标分子4MBN光谱中位于2221cm^-1处的峰值强度对SERS光谱进行归一化处理后（I₉₃₂/I₂₂₂₁）与浓度在10^-15 mg/mL到10^-2 mg/mL范围内的PSA的标准曲线。

图5为本实施例抗干扰SERS测试结果。

具体实施方式：

为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。

实施例

1. 试剂：柠檬酸三钠、氯金酸（HAuCl₄）、4-对巯基苯甲腈（4MBN）、三（羟甲基）氨基甲烷（Tris-Hcl 缓冲液）、三(2-羧乙基)膦（TCEP）、抗坏血酸、硝酸银（AgNO3）、磷酸盐缓冲液（PBS，pH=7.2）、Tris-Hcl盐酸缓冲液（pH=7.4）、癌胚抗原（CEA）、牛血清白蛋白（BSA）、甲胎蛋白（AFP）、酪氨酸酶（TYR）。前列腺特异抗原适配体(ADNA): 5'-SH-(CH₂)₆-TTTTTTTTTTATTAAAGCTCGCCATCAAATAGCTGC；

互补DNA (CDNA): SH-(CH₂)₆-TTTTTTTTTTGCAGCTATTT-Cy5。

2. 纳米粒子的合成

1）制备金纳米胶体：将1 ml氯金酸溶液转入锥形瓶中，然后再缓慢倒入99 ml去离子水，将其放置在磁力搅拌加热器上搅动和加热，在溶液即将沸腾滴时加1%柠檬酸钠溶液（2 ml，1 mL），观察颜色逐渐分别变成酒红色和紫红色，保持搅拌沸腾15分钟（min）停止，置于室温环境下降温，待用。

2）制备带有内标（SERS信号在静默区，4MBN）的金银核壳纳米颗粒Au@4MBN@AgNPs：量取10 mL的金纳米溶胶于锥形瓶中，在磁力搅拌子的不断搅动下逐滴滴加10 µL浓度为0.1 mM的对巯基苯甲腈(4MBN)，保持搅拌1.5小时，从而在Au NPs表面修饰了拉曼标记分子4MBN（Au@4MBN）。将Au@4MBN胶体转移至离心管中离心，调节转速为10000 rpm，时间为10min，离心清洗2次，目的是将多余的标记分子4MBN移除。然后，移除上层清液，将剩余胶体转入锥形瓶中，重悬于10 mL蒸馏水中。在磁子搅拌下，逐滴加入0.1 M的抗坏血酸溶液2 mL。接着，逐滴滴加2.5 mL，AgNO₃溶液（10^-3 M），观察液体颜色由酒红色逐步变成橙色，反应时间为1 h，形成标记分子为4MBN的金银核壳结构（Au@4MBN@Ag）纳米粒子胶体。

3. 修饰DNA单链

1）DNA活化：分别将浓度为10^-5 M DNA单链（适配体 DNA，互补 DNA；适配体 DNA与互补 DNA质量比为1:1）、Tris-Hcl缓冲液、TCEP（Tris (2-carboxyethyl) phosphine）按体积1:1:1加入离心管中平衡一个小时。

2）制备Au@4MBN@Ag^@ADNA：将已经清洗2遍的Au@4MBN@Ag纳米粒子，加入活化好的ADNA溶液，并加入PBS缓冲液调节溶液的pH值，加入磁子搅拌反应12h，从而在Au@4MBN@Ag修饰上ADNA单链，得到Au@4MBN@Ag^@ADNA。

3）制备Au^@CDNA：将已经清洗2遍的Au纳米粒子，1:1加入活化好的CDNA溶液，并加入PBS缓冲液调节溶液的pH值至7.2，加入磁子搅拌反应12h，从而在Au修饰上CDNA单链，得到Au^@CDNA。

4. 组装

Au^@ADNA与Au^@CDNA的组装：将修饰好的Au^@CDNA及Au@4MBN@Ag^@ADNA离心清洗两次后，按体积1:1倒入离心管用磁子搅拌反应3小时，从而实现Au^@CDNA和Au@4MBN@Ag^@ADNA的自组装，形成合卫星结构。

5. 肿瘤标志物的检测：

1）配置肿瘤标志物溶液：首先，配制浓度梯度的PSA溶液，通过稀释得到10^-2 mg/ml、10^-3 mg/ml、10^-4 mg/ml、10^-5 mg/ml、10^-6 mg/ml、10^-7 mg/ml、10^-8 mg/ml、10^-9 mg/ml、10^-10 mg/ml、10^-11 mg/ml、10^-12 mg/ml、10^-13 mg/ml、10^-14 mg/ml、10^-15 mg/ml的PSA标样溶液。按照体积2:1的量加入组装好的核卫星纳米粒子中，充分反应1h，然后进行SERS 检测。

2）肿瘤标志物的检测：量取步骤4）制备好的适配体SERS传感器溶液与肿瘤标志物混匀，静置1小时。利用雷尼绍激光共聚焦拉曼显微光谱仪检测不同浓度肿瘤标志物与适配体传感器的混合物，测试条件为：激发波长为785 nm，物镜为20倍镜，检测波数范围为400 -2500 cm^-1，积分时间为10秒，积分次数为1次。该方法主要是对SERS探针信号和内标信号的检测。然后以PSA的浓度的对数值作为横坐标，SERS标记分子Cy5在932 cm^-1峰位的强度与内标4MBN在2221 cm^-1峰位的强度的比值I₉₃₂/I₂₂₂₁（静默区SERS探针与内标的信号强度比率）作为纵坐标，绘制标准溶液的SERS探针与内标信号强度比率-浓度标准曲线；

6. 抗干扰测定

将10^-2 mg/mL的癌胚抗原（CEA）、牛血清蛋白（BSA）、甲胎蛋白（AFP）、酪氨酸酶（TYP）运用上述方法，分别加入制备好的组装好的合卫星纳米粒子中，充分反应1小时，进行SERS检测。测得SERS光谱与10^-2 mg/mL 前列腺特异抗原（PSA）进行比较。

本发明通过抗坏血酸还原银壳，包裹在金核外层形成金银纳米核壳结构，另外，将合成的Au@4MBN@Ag胶体通过紫外-可见吸收光谱表征，如图2（A）展现的黑色谱线表示AuNPs的最大吸收峰位于530cm^-1左右，裹上4MBN后红移至532 cm^-1（绿线），说明内标分子4MBN成功修饰在Au NPs表面。红线表示的是包裹银壳合成Au@4MBN@Ag核壳胶体，当银包裹上后，最大吸收峰由532 cm^-1移到504 cm^-1处，说明金球外层成功包裹上了Ag壳。图2（B）是对Au纳米粒子、Au@4MBN纳米粒子和Au@4MBN@Ag的动态光散射检测。可以清晰的看到Au纳米粒子随着实验的推进，粒径逐渐增大。从图2（B）可以看出，在Au@4MBN@Ag NPs中，4MBN中2221 cm^-1处的SERS信号显著增强，这可归因于金核和银壳的相互作用。并且，进一步通过透射电镜（TEM），可以清晰的观察到其结构，如图2（D）所示，平均粒径约为46 nm，可以从图中可观察到核壳结构的形成。

为了证明本发明能不能实现对肿瘤标志物的定量检测，我们做了验证实验。如图3所示，经过对2221 cm^-1峰值归一化后随着PSA浓度的降低，Cy5的特征峰逐渐升高。如图4（A）所示，随着肿瘤标志物（PSA）浓度从10^-2 mg/mL降低到10^-15 mg/mL，所得的标准曲线是y = -51.628X+41.957，应该注意的是，计算所得的相关系数R²= 0.886。为了能得到更好的相关系数，我们利用内标分子归一化处理的方法。实验中，我们选择4MBN作为内标分子，由于4MBN具有位于生物静默区的谱峰（2221cm^-1），利用此峰位进行计算可以避免“指纹区”以内的谱峰产生的干扰。如图4（B）所示，利用4MBN位于生物静默区的拉曼峰位为2221 cm^-1处的峰值强度对拉曼报道分子（Cy5）的光谱进行强度归一化，将Cy5光谱中932 cm^-1峰位的SERS强度与4MBN光谱中2221 cm^-1峰位的SERS强度相比，所得的比值作为纵坐标，可以观察到抗原浓度从10^-15增加到10^-2 mg/mL，比值（I₉₃₂/I₂₂₂₁）的变化，重要地是计算所得的相关系数是R² =0.945，相比较于直接利用SERS强度代入计算所得的R²，此时的R²具有显著的提高，也表明了PSA的浓度与SERS强度呈现一个良好的线性关系。

此外，为进一步证明适配体SERS传感器的特异性，将制备好的核卫星纳米组件分别与干扰物结合进行SERS检测，结果如图5所示。由图中可见，在同一浓度下干扰物癌胚抗原（CEA）、牛血清白蛋白（BSA）、甲胎蛋白（AFP）、酪氨酸酶（TYR）在的SERS比率值（I₉₃₂/I₂₂₂₁）远小于PSA的SERS比率值，表明本发明构建的适配体SERS传感器具有很好的特异性。

综上，验证了本发明可靶向触发和自校准的适配体SERS传感器高精度检测人体血液中肿瘤标志物的方法，具有重要应用价值。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建师范大学

<120> 一种可靶向触发和自校准的适配体SERS传感器高精度检测人体血液中肿瘤标

志物的方法

<130> 2

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tttttttttt attaaagctc gccatcaaat agctgc 36

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tttttttttt gcagctattt 20

Claims

1.一种基可靶向触发和自校准的适配体SERS传感器高精度检测人体血液中肿瘤标志物的方法，其特征在于，利用可靶向触发和自校准的适配体SERS传感器，通过免疫方法捕获蛋白肿瘤标志物后测量拉曼标记分子的信号，实现对肿瘤标志物的高精度、高特异性SERS检测；所述适配体SERS传感器以46nm的银包金纳米粒子为核，外部卫星是20 nm的金纳米粒子，形成一种核卫星结构的SERS传感模型。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征是在于，核卫星纳米组件中间为嵌入内标分子（4MBN）的核壳纳米粒子，这是一种在1800 - 2300 cm^-1（静默区）有拉曼信号的标记分子，不会与生物分子的拉曼信号重叠，也可消除外部环境对SERS信号的影响，实现动态自校准，提高SERS检测的准确性。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述传感器的制备方法包括以下步骤：通过巯基将适配体修饰在核壳纳米粒子上，并加入PBS缓冲液调节pH值，缓慢搅拌，使其适配体DNA通过巯基与Au@4MBN@Ag结合形成Au@4MBN@Ag^@ADNA NPs，用PBS洗涤浓缩后重悬于PBS中；用同样的方法，将适配体的互补DNA链修饰在卫星Au纳米粒子上，形成Au^@CDNANPs；通过DNA的碱基互补配对，将Au@4MBN@Ag^@ADNA NPs与Au^@CDNANPs进行连接，形成核壳卫星结构的适配体SERS传感器模型。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，其中适配体为与前列腺抗原特异性结合的DNA单链，适配体的5'端修饰有巯基，使它易与贵金属纳米粒子结合，并在近5'端接上10个胸腺嘧啶，使适配体形成直链，避免贴于金属纳米粒子表面；根据适配体序列设计出互补的DNA单链，所述互补DNA单链的3'端上修饰拉曼报道分子Cy5，通过范德华力、氢键和静电相互作用形成稳定的目标-适配体复合物；

所述与前列腺抗原特异性结合的DNA单链序列为：

SH-(CH₂)₆-TTTTTTTTTTATTAAAGCTCGCCATCAAATAGCTGC；

所述互补的DNA单链序列为：

SH-(CH₂)₆-TTTTTTTTTTGCAGCTATTT-Cy5。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在DNA单链修饰纳米粒子之前，先将单链DNA活化；所述活化包括以下步骤：分别将与肿瘤标志物特异性结合的适配体10^-5 M DNA链和带有拉曼报道分子的互补DNA链放入到5 mM TCEP和Tris-HCl缓冲液的混合溶液中，所述DNA、TCEP和Tris-HCl缓冲液的体积比为1:1:1，活化巯基。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述传感器的制备方法具体包括以下步骤：

1）合成两种尺寸的金纳米颗粒Au NPs：在水中加入氯金酸溶液，搅拌沸腾后加入柠檬酸三钠溶液还原，持续搅拌并加热15分钟，待室温冷却，获得32nm和20nm的金纳米胶体；

2）合成带有内标的金银核壳纳米颗粒Au@4MBN@Ag NPs：将内标4-巯基苯甲腈溶液加入步骤1）中制备好的32 nm的金胶体中，搅拌反应1.5小时，得到Au@MB NPs溶胶；将其离心洗涤后重悬于超纯水中，并加入抗坏血酸，搅拌0.5小时使其分布均匀，再逐滴滴加AgNO₃溶液，反应1小时，形成Au@4MBN@Ag NPs，离心洗涤浓缩后重悬于超纯水中；

3）活化DNA修饰纳米粒子

3-1）DNA活化：分别将可与肿瘤标志物特异性结合的适配体DNA和带有拉曼报道分子的互补DNA放入到TCEP和Tris-HCl缓冲液的混合溶液中，反应1小时活化巯基；

3-2）制备适配体DNA修饰的Au@4MBN@Ag NPs：量取步骤2）制备好的带内标的金银核壳纳米粒子，加入步骤3-1）中活化过的适配体DNA中，同时加入PBS调节pH值，在室温下缓慢搅拌12小时，使其适配体DNA通过巯基与Au@4MBN@Ag结合形成Au@4MBN@Ag^@CDNA NPs，用PBS洗涤浓缩后重悬于PBS中;

3-3）制备互补DNA修饰的Au NPs：量取步骤1)制备好的20 nm金纳米粒子，加入步骤3-1）中活化过的互补DNA中，同时加入PBS调节pH值，在室温下缓慢搅拌12小时，使其适配体DNA通过巯基与Au NPs结合形成Au^@ADNA NPs，用PBS洗涤浓缩后重悬于PBS中，作为SERS纳米探针待用;

4）组装核壳卫星结构的适配体SERS传感器溶液：将步骤3-2）制成的Au@4MBN@Ag^@CDNANPs与步骤3-3）中合成的Au^@ADNA NPs，混合轻轻搅拌反应3小时，利用DNA自组装形成核壳卫星结构的适配体SERS传感器溶液;

5）肿瘤标志物的检测：量取步骤4）制备好的适配体SERS传感器溶液与肿瘤标志物混匀，静置1小时;用共聚焦拉曼光谱仪检测不同浓度肿瘤标志物与适配体传感器的混合物，然后以PSA的浓度的对数值作为横坐标，SERS标记分子Cy5在932 cm^-1峰位的强度与内标4MBN在2221 cm^-1峰位的强度的比值I₉₃₂/I₂₂₂₁作为纵坐标，绘制标准溶液的SERS探针与内标信号强度比率-浓度标准曲线。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述适配体SERS传感器的动态检测范围为10^-2 - 10^-15 mg/mL, 检测极限浓度为0.38 ag/mL。