CN115356324A - 一种利用表面增强拉曼光谱对肺癌肿瘤标志物进行检测的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用表面增强拉曼光谱对肺癌肿瘤标志物进行检测的方法。本发明通过制备金纳米棒与以4MBN为内标分子的金包银核壳结构纳米粒子为SERS基底，在基底表面分别修饰与miRNA‑21有互补片段的DNA后，通过miRNA‑21构建核‑卫星结构从而创造大量“热点”实现内标分子的信号放大。本发明提供的方法能够对血清中肺癌肿瘤标志物miRNA‑21进行高灵敏度与高选择性检测，检测范围为10‑14M～10‑9M，能做到早期筛查且操作简便，在临床诊断中有极大应用潜力。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用表面增强拉曼光谱对肺癌肿瘤标志物进行检测的方法，属于生物医学检测技术领域。
背景技术
MicroRNA(miRNA)是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA 分子，由肿瘤细胞主动分泌，并且miRNA的表达量随肿瘤细胞生长、凋零而变化，通过检测不同的miRNA的含量可以为癌症早筛提供依据。其中miRNA-21是非侵入性早期肺癌诊断的肿瘤标志物。
目前肺癌的检测方法主要是低剂量CT，在肺癌早期筛查上取得很大成功，却仍然存在辐射诱变的风险，并且不能够提供肿瘤的生物学信息的缺点。因此选择以miRNA为肿瘤标志物进行无损检测能够避免以上问题。但miRNA在体液中丰度低、同源性高且容易降解的特点使其难以被检测到，目前的检测方法主要有Northern Blotting印迹法、微阵列分析法、实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)以及深度测序法等。这些方法灵敏度高但是样品前处理过程复杂，其中微阵列分析法虽然有高通量但是灵敏度和选择性都相对低，因此亟需提出一种快速、高灵敏度和高选择性的miRNA检测方法。
表面增强拉曼光谱(SERS)作为一种分析技术广泛应用于体液分析，能够做到无损快速分析且不需要经过复杂的样品预处理过程。但由于miRNA在体内的含量极低且所处的环境条件复杂，在定量检测方面仍存在很大挑战，因此需要提高miRNA的信号强度且通过选择性识别排除其他信号的干扰。
发明内容
为了解决现有技术中的难题，本发明设计了用于miRNA-21检测的SERS基底，通过DNA 与RNA的互补序列，使得以4MBN为内标分子的金包银核壳结构纳米粒子在金纳米棒周围组装构建核-卫星结构，通过内标分子的放大信号实现对miRNA-21的检测。并且通过对miRNA-21浓度与内标分子信号强度建立相关关系实现定量分析。
本发明的技术方案如下：
一种利用表面增强拉曼光谱对肺癌肿瘤标志物进行检测的方法，包括如下步骤：将金纳米棒(Au NRs)与以4MBN为内标的银包金核壳结构纳米粒子(Au@4MBN@Ag NPs)进行DNA探针功能化修饰后与肺癌肿瘤标志物miRNA-21共同孵育，而后进行拉曼检测。
进一步的，具体包括如下步骤：
(4)制备Au NRs-DNA1溶液；
(5)制备Au@4MBN@Ag NPs-DNA2；
(6)37℃下在超纯水或血清(标准溶液溶剂为超纯水，实际样品检测及可行性分析时溶剂为血清)中将10μL miRNA-21与1mL Au NRs-DNA1和1mL Au@4MBN@Ag NPs-DNA2 共同孵育，随后离心去除多余的miRNA-21，得到以Au NRs-DNA1为中心，Au@4MBN@Ag NPs-DNA2在周围自组装的核-卫星等离子体纳米结构溶液，将其沉积在铝片进行拉曼检测。
进一步的，步骤(1)的具体步骤为：将硫醇修饰的DNA1加入到Au NRs溶液中剧烈搅拌10min，-20℃低温振荡20min后逐渐升温到30℃，离心重分散；得到Au NRs-DNA1溶液。
进一步的，步骤(2)的具体步骤为：将硫醇修饰的DNA2加入到Au@4MBN@Ag NPs 溶液中剧烈搅拌10min，-20℃低温振荡20min后升温到30℃，离心重分散；得到 Au@4MBN@AgNPs-DNA2溶液。
进一步地，所述Au NRs合成方法如下：
A1、制备种子溶液：将氯金酸溶液(HAuCl4)与十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)溶液混合，加入还原剂硼氢酸钠(NaBH4)加热搅拌以制备种子溶液；
A2、制备生长液：在30℃时将硝酸银溶液(AgNO3)加入到CTAB和油酸钠(NaOL) 的混合溶液中，静置10min，随后加入HAuCl4连续搅拌90min得到生长液；
A3、将种子溶液和抗坏血酸(AA)按不同配比加入到生长液中，合成不同长径比的Au NRs 备用。
进一步地，所述Au@4MBN@Ag NPs的合成方法为将柠檬酸钠(Na3Ct)快速加入沸腾的HAuCl4中剧烈搅拌15min生成Au核。随后加入4-腈基硫酚(4MBN)形成Au-S共价键，磁力搅拌30min，第一次离心后重分散，随后逐滴加入AgNO3溶液和抗坏血酸，搅拌60min，第二次离心后得Au@4MBN@Ag NPs。
进一步地，所述DNA探针功能化修饰Au NRs与Au@4MBN@Ag NPs的具体方法为分别将硫醇修饰的DNA1与DNA2加入到Au NRs与Au@4MBN@Ag NPs中，低温振荡并缓慢升温到30℃，得到Au NRs-DNA1与Au@4MBN@Ag NPs-DNA2，离心重分散，低温保存。
进一步地，所述拉曼检测的具体方法为适宜温度下在超纯水或血清中将miRNA-21与Au NRs和Au@4MBN@Ag NPs共同孵育，离心后得到以Au NRs为中心，Au@4MBN@Ag NPs 在周围自组装的核-卫星等离子体纳米结构溶液，将其沉积在铝片上并进行拉曼检测。
进一步地，步骤A3所述种子溶液与抗坏血酸(AA)体积比分别为为1：2.5、1：1.25、1：0.83、1：0.625、1：0.5。
进一步地，所述第一次离心速度为9500rpm，时间为12min；第二次离心速度为8600rpm，时间为10min。
进一步地，所述DNA1的序列为(SH-TTT TTT TTT TTC AAC ATC AGT，5′→3′)；DNA2的序列为(CTG ATA AGC TAT TTT TTT TTT-SH，5′→3′)，所述低温为-20℃，振荡20min，最后于4℃下保存。
进一步地，所述的孵育温度为37℃，时间为12h，离心速度为4000rpm，时间为5min，拉曼检测所用激光为785nm，功率为2.38mW，积分时间为10s。
本发明的有益效果在于：
1、本发明所提供的方法选择以4MBN为内标分子，其特征拉曼位移2226cm-1属于体液的拉曼沉默区，有效地避免了其他可能拉曼信号带来的干扰，稳定性及准确度高。另外由于 miRNA同源性高，需要排除其他miRNA的干扰，4MBN在miRNA-21存在下的信号增强明显高于其他miRNA，故能够做到对miRNA-21的高选择性检测。
2、本发明所提供的方法通过选择与miRNA-21序列半互补的DNA1和DNA2，并且分别对SERS基底进行表面功能化修饰后，得到Au NRs-DNA1与Au@4MBN@Ag NPs-DNA2。在共同孵育过程中Au NRs-DNA1和Au@4MBN@Ag NPs-DNA2可分别与miRNA-21序列的两端结合，互补配对后形成以Au NRs-DNA1为核心，miRNA-21序列连接，Au@4MBN@Ag NPs-DNA2环绕在周围的核-卫星结构(参见说明书附图5)。它与单一基底相比可创设了更多的热点区域实现了内标信号的极大增强，检测灵敏度也优于单一基底对miRNA-21的检测，且重复性更好。
3、本发明所提供的方法无需复杂的样品前处理工作，简便快速且灵敏度高，同时不会对机体造成伤害，能够实现定量检测，可以直接对血清进行检测为肺癌早筛提供依据，判断癌症发展程度。
附图说明
图1A从左往右分别为为长径比从2.8～3.7的AuNRs的透射电镜图。
图1B为紫外可见吸收光谱图。
图1C是对R6G的拉曼信号增强对比。
图1D表明了添加不同体积的种子溶液对应的R6G特征峰的信号强度。
图2A为不同浓度miRNA-21(10-9M,10-10M,10-11M,10-12M,10-13M and 10-14M)的SERS。
图2B在拉曼位移2226cm-1处SERS信号强度与miRNA-21浓度的关系。
图2C不同miRNA-21浓度(Ⅰ)10-14M(Ⅱ)10-11M(Ⅲ)10-9M对应Au NRs/Au@4MBN@AgNPs在AuNRs周围组装情况。
图3A为浓度10-9M的不同miRNA(miRNA-155,miRNA-10b,miRNA-21)的SERS 图。
图3B为拉曼位移2226cm-1处不同miRNA的信号强度。
图4为对健康人和处于肺癌不同时期(分别为Ⅰ.Ⅲ,Ⅰ时期)的病人的血清中miRNA-21 进行拉曼检测的结果。
图5为本发明检测流程图。
具体实施方式
下面结合较佳实施例对本发明做进一步的说明。
Au NRs为金纳米棒；Au@4MBN@Ag NPs为以4MBN为内标的银包金核壳结构纳米粒子；CTAB为十六烷基三甲基溴化铵；NaBH4为硼氢酸钠；AA为抗坏血酸；Na3Ct为柠檬酸钠；4MBN为4-腈基硫酚；Au NRs-DNA1为DNA1修饰的金纳米棒；Au@4MBN@Ag NPs-DNA2为DNA2修饰的以4MBN为内标的银包金核壳结构纳米粒子；所述DNA1为序列为(SH-TTT TTT TTT TTCAAC ATC AGT，5′→3′)的DNA探针；DNA2为序列为(CTG ATA AGC TAT TTT TTT TTT-SH，5′→3′)的DNA探针。
实施例1
一种利用表面增强拉曼光谱对肺癌肿瘤标志物进行检测的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1、合成长径比为2.8的Au NRs
A1、制备种子溶液：将25μL 10mM氯金酸溶液(HAuCl4)与1mL 0.1M十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)溶液混合，加入0.5mL 0.1M硼氢酸钠(NaBH4)在30℃下剧烈搅拌30min 以制备种子溶液；
A2、制备生长液：在30℃时将1.8mL 4mM硝酸银溶液(AgNO3)加入到250mL溶解了7.0g CTAB和2.8g油酸钠(NaOL)的混合溶液中，静置10min，随后加入250mL 1mM HAuCl4连续搅拌90min得到生长液；
A3、将0.5mL 64mM AA与0.2mL的种子溶液混合，加入到PH为1.7的生长液中，在 30℃下静置48h。
2、合成Au@4MBN@Ag NPs
将2mL 1wt％的柠檬酸钠(Na3Ct)快速加入沸腾的100mL 0.01wt％HAuCl4中剧烈搅拌 15min生成Au核。随后加入100μL 0.1M 4-腈基硫酚(4MBN)形成Au-S共价键，磁力搅拌30min，将该混合物在9500rpm离心12min去除游离的4MBN，而后重分散于10mL的超纯水中得到Au-4MBN胶体，随后逐滴加入1mL 1mM AgNO3和400μL 10mM AA到10 mL Au-4MBN胶体中，搅拌60min并得到Au@4MBN@Ag NPs，在8600rpm离心10min重分散于10mL超纯水中备用。
4、DNA探针功能化修饰Au NRs与Au@4MBN@Ag NPs
分别将10μL 100μM硫醇修饰的DNA1与DNA2加入到Au NRs与Au@4MBN@Ag NPs 中剧烈搅拌10min，-20℃低温振荡20min后缓慢升温到30℃，得到Au NRs-DNA1与 Au@4MBN@AgNPs-DNA2，离心重分散于1mL超纯水中，于4℃低温保存。
5、拉曼检测
适宜温度下在超纯水或血清中将10μLmiRNA-21与1mL Au NRs-DNA1和1mL Au@4MBN@Ag NPs-DNA2在37℃下共同孵育12h，随后在4000rpm下离心5min除去多余的miRNA-21，得到以Au NRs为中心，Au@4MBN@Ag NPs在周围自组装的核-卫星等离子体纳米结构溶液，将其沉积在铝片上用波长785nm，功率2.38mW积分时间10s的条件下进行拉曼检测。
实施例2
一种利用表面增强拉曼光谱对肺癌肿瘤标志物进行检测的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1、合成长径比为3.0的Au NRs
A1、制备种子溶液：将25μL 10mM氯金酸溶液(HAuCl4)与1mL 0.1M十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)溶液混合，加入0.5mL 0.1M硼氢酸钠(NaBH4)在30℃下剧烈搅拌30min 以制备种子溶液；
A2、制备生长液：在30℃时将1.8mL 4mM硝酸银溶液(AgNO3)加入到250mL溶解了7.0g CTAB和2.8g油酸钠(NaOL)的混合溶液中，静置10min，随后加入250mL 1mM HAuCl4连续搅拌90min得到生长液；
A3、将0.5mL 64mM AA与0.4mL的种子溶液混合，加入到PH为1.7的生长液中，在 30℃下静置48h。
2、合成Au@4MBN@Ag NPs
将2mL 1wt％的柠檬酸钠(Na3Ct)快速加入沸腾的100mL 0.01wt％HAuCl4中剧烈搅拌15min生成Au核。随后加入100μL 0.1M 4-腈基硫酚(4MBN)形成Au-S共价键，磁力搅拌30min，将该混合物在9500rpm离心12min去除游离的4MBN，而后重分散于10mL的超纯水中得到Au-4MBN胶体，随后逐滴加入1mL 1mM AgNO3和400μL 10mM AA到10 mL Au-4MBN胶体中，搅拌60min并得到Au@4MBN@Ag NPs，在8600rpm离心10min重分散于10mL超纯水中备用。
3、DNA探针功能化修饰Au NRs与Au@4MBN@Ag NPs
分别将10μL 100μM硫醇修饰的DNA1与DNA2加入到Au NRs与Au@4MBN@Ag NPs 中剧烈搅拌10min，-20℃低温振荡20min后缓慢升温到30℃，得到Au NRs-DNA1与 Au@4MBN@AgNPs-DNA2，离心重分散于1mL超纯水中，于4℃低温保存。
4、拉曼检测
适宜温度下在超纯水或血清中将10μL miRNA-21与1mL Au NRs-DNA1和1mL Au@4MBN@Ag NPs-DNA2在37℃下共同孵育12h，随后在4000rpm下离心5min除去多余的miRNA-21，得到以Au NRs为中心，Au@4MBN@Ag NPs在周围自组装的核-卫星等离子体纳米结构溶液，将其沉积在铝片上用波长785nm，功率2.38mW积分时间10s的条件下进行拉曼检测。
实施例3
一种利用表面增强拉曼光谱对肺癌肿瘤标志物进行检测的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1、合成长径比为3.3的Au NRs
A1、制备种子溶液：将25μL 10mM氯金酸溶液(HAuCl4)与1mL 0.1M十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)溶液混合，加入0.5mL 0.1M硼氢酸钠(NaBH4)在30℃下剧烈搅拌30min 以制备种子溶液；
A2、制备生长液：在30℃时将1.8mL 4mM硝酸银溶液(AgNO3)加入到250mL溶解了7.0g CTAB和2.8g油酸钠(NaOL)的混合溶液中，静置10min，随后加入250mL 1mM HAuCl4连续搅拌90min得到生长液；
A3、将0.5mL 64mM AA与0.6mL的种子溶液混合，加入到PH为1.7的生长液中，在 30℃下静置48h。
2、合成Au@4MBN@Ag NPs
将2mL 1wt％的柠檬酸钠(Na3Ct)快速加入沸腾的100mL 0.01wt％HAuCl4中剧烈搅拌 15min生成Au核。随后加入100μL 0.1M 4-腈基硫酚(4MBN)形成Au-S共价键，磁力搅拌30min，将该混合物在9500rpm离心12min去除游离的4MBN，而后重分散于10mL的超纯水中得到Au-4MBN胶体，随后逐滴加入1mL 1mM AgNO3和400μL 10mM AA到10 mL Au-4MBN胶体中，搅拌60min并得到Au@4MBN@Ag NPs，在8600rpm离心10min重分散于10mL超纯水中备用。
3、DNA探针功能化修饰Au NRs与Au@4MBN@Ag NPs
分别将10μL 100μM硫醇修饰的DNA1与DNA2加入到Au NRs与Au@4MBN@Ag NPs 中剧烈搅拌10min，-20℃低温振荡20min后缓慢升温到30℃，得到Au NRs-DNA1与 Au@4MBN@AgNPs-DNA2，离心重分散于1mL超纯水中，于4℃低温保存。
4、拉曼检测
适宜温度下在超纯水或血清中将10μL miRNA-21与1mL Au NRs-DNA1和1mL Au@4MBN@Ag NPs-DNA2在37℃下共同孵育12h，随后在4000rpm下离心5min除去多余的miRNA-21，得到以Au NRs为中心，Au@4MBN@Ag NPs在周围自组装的核-卫星等离子体纳米结构溶液，将其沉积在铝片上用波长785nm，功率2.38mW积分时间10s的条件下进行拉曼检测。
实施例4
一种利用表面增强拉曼光谱对肺癌肿瘤标志物进行检测的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1、合成长径比为3.4的Au NRs
A1、制备种子溶液：将25μL 10mM氯金酸溶液(HAuCl4)与1mL 0.1M十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)溶液混合，加入0.5mL 0.1M硼氢酸钠(NaBH4)在30℃下剧烈搅拌30min 以制备种子溶液；
A2、制备生长液：在30℃时将1.8mL 4mM硝酸银溶液(AgNO3)加入到250mL溶解了7.0g CTAB和2.8g油酸钠(NaOL)的混合溶液中，静置10min，随后加入250mL 1mM HAuCl4连续搅拌90min得到生长液；
A3、将0.5mL 64mM AA与0.8mL的种子溶液混合，加入到PH为1.7的生长液中，在 30℃下静置48h。
2、合成Au@4MBN@Ag NPs
将2mL 1wt％的柠檬酸钠(Na3Ct)快速加入沸腾的100mL 0.01wt％HAuCl4中剧烈搅拌 15min生成Au核。随后加入100μL 0.1M 4-腈基硫酚(4MBN)形成Au-S共价键，磁力搅拌30min，将该混合物在9500rpm离心12min去除游离的4MBN，而后重分散于10mL的超纯水中得到Au-4MBN胶体，随后逐滴加入1mL 1mM AgNO3和400μL 10mM AA到10 mL Au-4MBN胶体中，搅拌60min并得到Au@4MBN@Ag NPs，在8600rpm离心10min重分散于10mL超纯水中备用。
3、DNA探针功能化修饰Au NRs与Au@4MBN@Ag NPs
分别将10μL 100μM硫醇修饰的DNA1与DNA2加入到Au NRs与Au@4MBN@Ag NPs 中剧烈搅拌10min，-20℃低温振荡20min后缓慢升温到30℃，得到Au NRs-DNA1与 Au@4MBN@AgNPs-DNA2，离心重分散于1mL超纯水中，于4℃低温保存。
4、拉曼检测
适宜温度下在超纯水或血清中将10μL miRNA-21与1mL Au NRs-DNA1和1mL Au@4MBN@Ag NPs-DNA2在37℃下共同孵育12h，随后在4000rpm下离心5min除去多余的miRNA-21，得到以Au NRs为中心，Au@4MBN@Ag NPs在周围自组装的核-卫星等离子体纳米结构溶液，将其沉积在铝片上用波长785nm，功率2.38mW积分时间10s的条件下进行拉曼检测。
实施例5
一种利用表面增强拉曼光谱对肺癌肿瘤标志物进行检测的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1、合成长径比为3.7的Au NRs
A1、制备种子溶液：将25μL 10mM氯金酸溶液(HAuCl4)与1mL 0.1M十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)溶液混合，加入0.5mL 0.1M硼氢酸钠(NaBH4)在30℃下剧烈搅拌30min 以制备种子溶液；
A2、制备生长液：在30℃时将1.8mL 4mM硝酸银溶液(AgNO3)加入到250mL溶解了7.0g CTAB和2.8g油酸钠(NaOL)的混合溶液中，静置10min，随后加入250mL 1mM HAuCl4连续搅拌90min得到生长液；
A3、将0.5mL 64mM AA与1.0mL的种子溶液混合，加入到PH为1.7的生长液中，在 30℃下静置48h。
2、合成Au@4MBN@Ag NPs
将2mL 1wt％的柠檬酸钠(Na3Ct)快速加入沸腾的100mL 0.01wt％HAuCl4中剧烈搅拌 15min生成Au核。随后加入100μL 0.1M 4-腈基硫酚(4MBN)形成Au-S共价键，磁力搅拌30min，将该混合物在9500rpm离心12min去除游离的4MBN，而后重分散于10mL的超纯水中得到Au-4MBN胶体，随后逐滴加入1mL 1mM AgNO3和400μL 10mM AA到10 mL Au-4MBN胶体中，搅拌60min并得到Au@4MBN@Ag NPs，在8600rpm离心10min重分散于10mL超纯水中备用。
3、DNA探针功能化修饰Au NRs与Au@4MBN@Ag NPs
分别将10μL 100μM硫醇修饰的DNA1与DNA2加入到Au NRs与Au@4MBN@Ag NPs 中剧烈搅拌10min，-20℃低温振荡20min后缓慢升温到30℃，得到Au NRs-DNA1与 Au@4MBN@AgNPs-DNA2，离心重分散于1mL超纯水中，于4℃低温保存。
4、拉曼检测
适宜温度下在超纯水或血清中将10μL miRNA-21与1mL Au NRs-DNA1和1mL Au@4MBN@Ag NPs-DNA2在37℃下共同孵育12h，随后在4000rpm下离心5min除去多余的miRNA-21，得到以Au NRs为中心，Au@4MBN@Ag NPs在周围自组装的核-卫星等离子体纳米结构溶液，将其沉积在铝片上用波长785nm，功率2.38mW积分时间10s的条件下进行拉曼检测。
根据上述实施例1～5制备的不同的AuNRs基底进行比较，如图1所示。
图1A从左往右分别为为长径比从2.8～3.7的AuNRs的透射电镜图，图1B为紫外可见吸收光谱图，图1C是对R6G的拉曼信号增强对比，图1D表明了添加不同体积的种子溶液对应的R6G特征峰的信号强度。
从图1B中可以发现，随着AuNRs长径比增加，吸收峰向长波方向移动。同时，图1D表明在加入的种子溶液为0.8mL时，AuNRs对R6G的拉曼信号增强效果最好。后续采用实施例4所述方法制备的SERS基底进行评价。
为评价该方法的灵敏度，根据上述实施例4，对空白组和从1nM到10fM的miRNA标准溶液与所述SERS基底按实施例4方法进行拉曼检测，所得结果如图2所示。
图2A为不同浓度miRNA-21(10-9M,10-10M,10-11M,10-12M,10-13M and 10-14M)的SERS。图2B在拉曼位移2226cm-1处SERS信号强度与miRNA-21浓度的关系。图2C不同miRNA-21浓度(Ⅰ)10-14M(Ⅱ)10-11M(Ⅲ)10-9M对应Au NRs/Au@4MBN@Ag NPs 在AuNRs周围组装情况。
从图2A中可以得出，本发明所提供的方法能够检测miRNA-21的浓度范围为10-9M～10-14 M。从图2B可以看出，在2226cm-1处miRNA-21浓度的对数与拉曼信号强度呈线性关系，拟合方程为y＝472.21x+8967.594，相关系数R2为0.9861，说明相关度高，因此该基底能够用于miRNA-21的定量检测。从图2C可以看出，随着miRNA-21浓度的增加在AuNRs周围组装的Au NRs/Au@4MBN@Ag NPs相应增加，这也是SERS信号增强的本质原因。
为评价该方法的选择性，根据上述实施例4，对空白组和从1nM到10fM的miRNA标准溶液与所述SERS基底按实施例4方法进行拉曼检测，所得结果如图3所示。
图3A为浓度10-9M的不同miRNA(miRNA-155,miRNA-10b,miRNA-21)的SERS 图。图3B为拉曼位移2226cm-1处不同miRNA的信号强度，可以看出，miRNA-155, miRNA-10b和空白相比并无明显增强，为空白组的1.3倍左右，而miRNA-21存在时，信号明显增强，为空白的3倍左右，因此本发明所提供的方法对miRNA-21的检测时有选择性的。
根据实施例4所提供方法，对肺癌患者血清进行检测验证本发明所提出方法在早期肺癌筛查的可行性，结果如图4所示。
图4为对健康人和处于肺癌不同时期(分别为Ⅰ.Ⅲ,Ⅰ时期)的病人的血清中miRNA-21 进行拉曼检测的结果。可以看出，处于肺癌早期的病人的拉曼信号强度与健康人就有明显不同，处于肺癌中晚期差异则更加明显，这证明了本发明所提供方法的可靠性。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (10)
1.一种利用表面增强拉曼光谱对肺癌肿瘤标志物进行检测的方法，其特征在于，包括如下步骤：将Au NRs与Au@4MBN@Ag NPs进行DNA探针功能化修饰后与肺癌肿瘤标志物miRNA-21共同孵育后，进行拉曼检测。
2.根据权利要求1所述一种利用表面增强拉曼光谱对肺癌肿瘤标志物进行检测的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
(1)制备Au NRs-DNA1溶液；
(2)制备Au@4MBN@Ag NPs-DNA2；
(3)37℃下在超纯水或血清(标准溶液溶剂为超纯水，实际样品检测及可行性分析时溶剂为血清)中将10μL miRNA-21与1mL Au NRs-DNA1和1mL Au@4MBN@Ag NPs-DNA2共同孵育，随后离心去除多余的miRNA-21，得到以Au NRs-DNA1为中心，Au@4MBN@Ag NPs-DNA2在周围自组装的核-卫星等离子体纳米结构溶液，将其沉积在铝片进行拉曼检测。
3.根据权利要求2所述一种利用表面增强拉曼光谱对肺癌肿瘤标志物进行检测的方法，其特征在于，步骤(1)的具体步骤为：将硫醇修饰的DNA1加入到Au NRs溶液中剧烈搅拌10min，-20℃低温振荡20min后逐渐升温到30℃，离心重分散；得到Au NRs-DNA1溶液。
4.根据权利要求2或3所述一种利用表面增强拉曼光谱对肺癌肿瘤标志物进行检测的方法，其特征在于，步骤(2)的具体步骤为：将硫醇修饰的DNA2加入到Au@4MBN@Ag NPs溶液中剧烈搅拌10min，-20℃低温振荡20min后升温到30℃，离心重分散；得到Au@4MBN@Ag NPs-DNA2溶液。
5.根据权利要求4所述一种利用表面增强拉曼光谱对肺癌肿瘤标志物进行检测的方法，其特征在于，所述Au NRs合成步骤如下：
A1、制备种子溶液：将氯金酸溶液与CTAB溶液混合，加入硼氢酸钠溶液加热搅拌以制备种子溶液；
A2、制备生长液：在30℃时将硝酸银溶液加入到CTAB和油酸钠的混合溶液中，静置10min，随后加入HAuCl4连续搅拌90min得到生长液；
A3、将种子溶液和抗坏血酸加入到生长液中，合成Au NRs。
6.根据权利要求5所述一种利用表面增强拉曼光谱对肺癌肿瘤标志物进行检测的方法，其特征在于：所述Au@4MBN@Ag NPs的合成方法为将柠檬酸钠加入沸腾的HAuCl4中剧烈搅拌15min生成金核；随后加入4-腈基硫酚形成Au-S共价键，磁力搅拌30min，第一次离心后重分散，随后逐滴加入AgNO3溶液和抗坏血酸，搅拌60min，第二次离心后得Au@4MBN@AgNPs。
7.根据权利要求6所述一种利用表面增强拉曼光谱对肺癌肿瘤标志物进行检测的方法，其特征在于：步骤A3所述种子溶液与抗坏血酸体积比分别为为1：0.5-2.5。
8.根据权利要求7所述一种利用表面增强拉曼光谱对肺癌肿瘤标志物进行检测的方法，其特征在于：所述第一次离心速度为9500rpm，时间为12min；第二次离心速度为8600rpm，时间为10min。
9.根据权利要求8所述一种利用表面增强拉曼光谱对肺癌肿瘤标志物进行检测的方法，其特征在于：所述DNA1的序列为(SH-TTT TTT TTT TTC AAC ATC AGT，5′→3′)；DNA2的序列为(CTG ATA AGC TAT TTT TTT TTT-SH，5′→3′)。
10.根据权利要求9所述一种利用表面增强拉曼光谱对肺癌肿瘤标志物进行检测的方法，其特征在于：所述步骤(3)中，所述孵育温度为37℃，时间为12h，离心速度为4000rpm，时间为5min。
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