CN106525814A - 一种基于磁核‑金卫星组装体的psa检测方法 - Google Patents

一种基于磁核‑金卫星组装体的psa检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种基于磁核‑金卫星组装体的PSA检测方法，属于生物检测领域。该方法是：将修饰有PSA适配体PSA aptamer的磁性纳米颗粒，和修饰有与适配体部分互补的序列PSA CS的金纳米颗粒，组装形成核‑卫星组装体；当存在待测物PSA时，该组装体的结构改变引起体系中上清液的拉曼信号的变化，基于此，可实现对PSA含量的检测。本发明提供了一种基于捕获探针‑拉曼信号颗粒的核‑卫星组装体以实现对PSA超灵敏检测的表面增强拉曼光谱方法，同时结合了磁性捕获探针的磁性富集作用，通过检测上清液而得到拉曼信号，具有灵敏度高，特异、选择性高，检测限低，操作简便，方便快捷的优点，有着非常好的应用前景。

Description

一种基于磁核-金卫星组装体的PSA检测方法
技术领域
本发明属于生物检测领域，涉及一种对前列腺特异性抗原检测的新方法，具体涉及一种基于磁核-金卫星组装体的PSA检测方法。
背景技术
前列腺特异性抗原(Prostate Specific Antigen，PSA)是一种由前列腺上皮细胞内浆小泡产生、含有237个氨基酸残基的单链糖蛋白，分子量约为34kD，在功能上属于类激肽释放酶的一种丝氨酸蛋白酶。它是公认的诊断前列腺癌的较好的肿瘤标志物。
现有技术评估前列腺癌风险的标准方法是检测血液中PSA的含量。例如，中国专利CN101070345B公开了一种检测前列腺特异性抗原(PSA)的检测方法，其利用了该专利发明的抗前列腺特异性抗原的单克隆抗体，其单克隆抗体的PSA检测范围达0～2048ng/mL。该发明涉及到生物单克隆抗体，检测方法中对抗体的特异性要求非常高，否则会出现大量假阳性的结果，另外对生物抗体保藏要求高，如保存不当，在实际操作中会造成极大误差。
此外，还有许多检测PSA的方法，如酶联免疫法、电化学法、放射免疫测定法等。然而，这些方法都是基于抗原与抗体之间的免疫反应，涉及到生物抗体。众所周知，抗体制备的条件极为苛刻而且十分昂贵，所需时间也较长；此外，抗体的稳定性也进一步限制其广泛的使用。
表面增强拉曼光谱(surface enhanced Raman scattering，SERS)技术是一种新兴的生物标记手段。它一方面克服了传统拉曼散射信号弱、不易检测的缺点；同时，其还有诸多优点，如光信号不易受水的影响、对生物组织损伤小、具有超高的灵敏性和选择性等。基于SERS技术而发展起来的纳米探针在生物成像、核酸或蛋白质检测、肿瘤识别、药物输运等诸多生物医药领域展现出可观的应用前景。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种基于磁核-金卫星组装体的PSA检测方法。该方法通过PSA打断磁核-金卫星组装体内部适配体双链间的结合作用，进而检测上清液中游离的金卫星探针的信号，从而可以实现对PSA的定量检测。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种基于磁核-金卫星组装体的PSA检测方法，包括如下步骤：
首先，将修饰有PSA适配体PSA aptamer的磁性纳米颗粒，和修饰有与适配体部分互补的序列PSA CS的金纳米颗粒，组装形成核-卫星组装体；当存在待测物PSA时，该组装体的结构改变引起体系中上清液的拉曼信号的变化，基于此，可实现对PSA含量的检测；
本发明所述的基于磁核-金卫星组装体的PSA检测方法，具体包括如下步骤：
(1)采用活化剂活化表面修饰有羧基的磁性微粒，随后加入PSA适配体制备成修饰有PSA适配体PSA aptamer的磁性纳米颗粒，即捕获探针；
(2)先将拉曼信号分子结合到金纳米颗粒表面，再将与步骤(1)中适配体部分互补的序列PSA CS修饰到该颗粒表面，制备成拉曼信号颗粒；
(3)将步骤(1)中的捕获探针和步骤(2)中的拉曼信号颗粒混合，利用捕获探针上适配体与拉曼信号颗粒上互补序列的杂交，形成捕获探针-拉曼信号颗粒的核-卫星组装体；
(4)用Tris-HCl缓冲溶液配制PSA溶液，并稀释成一组具有浓度梯度的标准样品液；
(5)取相同体积的步骤(3)中核-卫星组装体溶液，分别加入不同浓度的目标物PSA，室温孵育，由于PSA会竞争性的与PSA aptamer反应，随着PSA浓度的增加，核-卫星组装体会有不同程度的解散，上清液中游离的拉曼信号颗粒的浓度也会发生相应变化，通过磁分离作用分离底物，进而可以从上清液中得到不同的拉曼信号强度；
(6)根据PSA浓度与拉曼信号强度的关系建立两者之间的标准曲线，从而应用拉曼信号强度对PSA进行检测。
在上述PSA检测方法中：
步骤(1)中所述的活化剂优选为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)。
步骤(1)中所述的表面修饰有羧基的磁性微粒为表面修饰有羧基的四氧化三铁(Fe3O4)，其粒径为400～500nm。
步骤(1)中所述的PSA适配体序列为5'-NH2-(T)10-ATTAAAGCTCGCCATCAAATAGCTGC-3'。
步骤(1)中所述的修饰有PSA适配体PSA aptamer的磁性纳米颗粒(捕获探针)的溶液浓度为0.4～0.6mg/mL。
步骤(2)中所述的拉曼信号分子优选为4,4'-联吡啶。
步骤(2)中所述的金纳米颗粒平均粒径优选为30nm～35nm。
步骤(2)中所述的适配体部分互补的序列为5'-SH-(T)10-GCAGCTATTT-3'。
步骤(2)中所述的拉曼信号颗粒的溶液浓度为0.95～1.05mmol/L。
步骤(3)中所述的修饰有PSA适配体PSA aptamer的磁性纳米颗粒(捕获探针)和拉曼信号颗粒体积混合比例为3：(2～2.5)。
步骤(4)中所述的Tris-HCl缓冲溶液是pH为7.4的Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷-盐酸)缓冲溶液；
步骤(4)中所述的Tris-HCl缓冲溶液里包含50mM NaCl、5mM KCl、5mM MgCl2。
步骤(4)中所述的一定的浓度梯度为0、1、5、50、500pg/mL以及5、50ng/mL，其中0pg/mL为对照。
步骤(5)中所述的室温孵育的时间优选为8h～12h；更优选为8h。
步骤(5)中所述的核-卫星组装体溶液与目标物PSA的体积比值为30～35。
以上混合比例会分别影响到实验过程中背景信号以及实验结果中最低检测限的大小。当采用上述比例的用量关系时，最低检测限和背景信号大小合适。
步骤(5)中通过磁铁的磁场作用分离底物，保留上清液，所述的拉曼信号是通过检测上清液中残留的拉曼信号颗粒得到的。
步骤(5)中所述的拉曼信号强度是通过显微拉曼光谱仪测得；所述的显微拉曼光谱仪的操作条件优选为激发光源是波长为632.8nm的He-Ne激光器，到达样品的激光功率为1mW，信号收集时间为30～35s。
步骤(5)中所述的拉曼信号强度是选取拉曼信号分子特征拉曼谱中最强的谱峰(约为1612cm-1处)作为定量峰。
本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：
本发明提供了一种基于捕获探针-拉曼信号颗粒的核-卫星组装体以实现对PSA超灵敏检测的表面增强拉曼光谱方法，克服了传统方法的不足，同时结合了磁性捕获探针的磁性富集作用，通过检测上清液而得到拉曼信号，具有灵敏度高，特异、选择性高，检测限低，操作简便，方便快捷的优点，有着非常好的应用前景。
附图说明
图1是实施例1中基于磁核-金卫星组装体的PSA检测方法流程示意图。
图2是实施例1中制备的金纳米颗粒的透射电镜图。
图3是实施例1中拉曼信号颗粒的透射电镜图。
图4是实施例1中使用不同浓度的PSA标准溶液得到的拉曼信号光谱图；其中，横坐标代表PSA浓度的(横坐标是浓度的log10)，纵坐标代表不同浓度PSA时的拉曼信号强度。
图5是实施例2中水体中的PSA的拉曼信号光谱图。
图6是实施例3中PSA特异性检测的拉曼信号强度图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
下面实施例中，未注明具体条件和环境的实验方法，通常按照常规条件，或制造厂商所建议的条件。本发明中DP为拉曼信号分子4,4'-联吡啶；PSA为前列腺特异性抗原；Tris-HCl表示三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液；PBS表示磷酸盐缓冲液；EDC表示1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；NHS表示N-羟基琥珀酰亚胺；TCEP为三(2-羧乙基)膦。
实施例1
如图1所示，本实施例提供的前列腺特异性抗原PSA的定量检测方法，包括以下步骤：
(1)捕获探针的制备
取100μL表面修饰有羧基的Fe3O4，购自阿拉丁试剂(上海)有限公司，用Tris-HCl缓冲液清洗两次，最后定容至500μL。然后配制EDC(2mg/mL)和NHS溶液(0.5mg/mL)，首先向上述溶液中加入30μL的EDC溶液，20min后，加入同样体积的NHS溶液，混合液持续搅拌1.5h。随后，加入50μL(10μM)的PSA适配体，反应3h后，用Tris-HCl缓冲液清洗上次磁珠两次，重悬备用，即得到捕获探针。
(2)金纳米颗粒的制备
在不断搅拌下将100mL 1mM的氯金酸(HAuCl4)溶液加热至沸腾，然后加入6mL38.8mM的柠檬酸三钠水溶液。此时溶液的颜色变化是：淡黄-无色-黑色-紫色-深红色，等溶液变成深红色继续加热回流15～20min。最后冷却至常温，制备得到30nm的金纳米颗粒溶液，其透射电镜图参见图2。
(3)拉曼信号颗粒的制备
向1mL金纳米颗粒中加入10μL 0.01mM的DP溶液，充分混匀后放置10min，然后利用离心机离心10min，转速为8000rpm。离心后去掉上清液，以1mL三蒸水重悬底物。PSA CS通过盐沉积法修饰到金纳米颗粒表面：首先，向10μL 100μM的PSA CS中加入1.5μL 10mM新配置的TCEP溶液，反应10min以活化PSA CS，然后将活化后的PSA CS加入到上述三蒸水重悬的悬液中。4℃环境下孵育12h，加入100μL100mM的PBS溶液，接着24小时内逐步加入1M的NaCl溶液直至终浓度为0.1mM，最后，以8000rpm离心30min，去掉上清液，底物用Tris-HCl缓冲液重悬，最终得到的探针保存在4℃环境下。其透射电镜图参见图3。
(4)标准样品溶液的制备
选择6个浓度的PSA(购自Sigma试剂公司)标准溶液，分别为1、5、50、500pg/mL以及5、50ng/mL。
(5)核-卫星组装体的形成以及PSA的检测
取150μL步骤(1)中制备的捕获探针和100μL步骤(3)中得到的拉曼信号颗粒混合，利用捕获探针上适配体与拉曼信号颗粒上互补序列的杂交，形成捕获探针-拉曼信号颗粒的核-卫星组装体；随后，取每一份上述得到的组装体溶液，分别加入8μL不同浓度的目标物PSA，室温孵育8h，由于PSA会竞争性的与PSA aptamer反应，随着PSA浓度的增加，核-卫星组装体会有不同程度的解散，上清液中残留的拉曼信号颗粒浓度也会有不同程度的增加。
(6)拉曼信号的测量
通过将反应容器置于磁力架上，利用磁铁的磁场作用分离底物，保留上清液，测量上清液的拉曼信号，可以得到不同强度的拉曼信号。PSA浓度与拉曼信号强度关系结果参见图4。其中，显微拉曼光谱仪购自日本Nippon Optical System公司，激发光源是波长为632.8nm的He-Ne激光器，到达样品的激光功率为1mW，信号收集时间为30s。
可以明显地看到，随着样品中PSA浓度的提高，采集的拉曼信号逐渐升高，在5～500pg/mL的浓度范围内，两者的关系符合Y＝-79.63+455.22X，表明在这一区间可以进行有效的定量分析。本实施例利用磁场定向富集磁性底物，通过磁分离以得到上清液，通过检测上清液拉曼信号的方法，使得检测结果更加稳定可靠，并且可重复。
实施例2
取珠江广州段水体，操作方法与实施例1相同，测得其拉曼谱图如图5所示(实验三次)，信号强度约为226(a.u.)，该信号强度与背景信号强度比较接近，可以认为该水源中不含有PSA。
实施例3
为了说明本发明的特异性，分别制备牛血清白蛋白BSA和癌胚抗原CEA标准溶液(4ng/mL)，具体实施步骤参照例1，得到的拉曼信号强度可参照图6，说明该方法具有很强的特异性。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 华南师范大学
<120> 一种基于磁核-金卫星组装体的PSA检测方法
<130> 1
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PSA适配体序列
<220>
<221> NH2修饰
<222> (1)..(1)
<400> 1
tttttttttt attaaagctc gccatcaaat agctgc 36
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 适配体部分互补序列
<220>
<221> SH修饰
<222> (1)..(1)
<400> 2
tttttttttt gcagctattt 20

Claims (10)

1.一种基于磁核-金卫星组装体的PSA检测方法，其特征在于包括如下步骤：
首先，将修饰有PSA适配体PSA aptamer的磁性纳米颗粒，和修饰有与适配体部分互补的序列PSA CS的金纳米颗粒，组装形成核-卫星组装体；当存在待测物PSA时，该组装体的结构改变引起体系中上清液的拉曼信号的变化，基于此实现对PSA含量的检测；
所述的PSA适配体序列为5'-NH2-(T)10-ATTAAAGCTCGCCATCAAATAGCTGC-3'；
所述的适配体部分互补的序列为5'-SH-(T)10-GCAGCTATTT-3'。
2.根据权利要求1所述的基于磁核-金卫星组装体的PSA检测方法，其特征在于具体包括如下步骤：
(1)采用活化剂活化表面修饰有羧基的磁性微粒，随后加入PSA适配体制备成修饰有PSA适配体PSA aptamer的磁性纳米颗粒，即捕获探针；
(2)先将拉曼信号分子结合到金纳米颗粒表面，再将与步骤(1)中适配体部分互补的序列PSA CS修饰到该颗粒表面，制备成拉曼信号颗粒；
(3)将步骤(1)中的捕获探针和步骤(2)中的拉曼信号颗粒混合，利用捕获探针上适配体与拉曼信号颗粒上互补序列的杂交，形成捕获探针-拉曼信号颗粒的核-卫星组装体；
(4)用Tris-HCl缓冲溶液配制PSA溶液，并稀释成一组具有浓度梯度的标准样品液；
(5)取相同体积的步骤(3)中核-卫星组装体溶液，分别加入不同浓度的目标物PSA，室温孵育，由于PSA会竞争性的与PSA aptamer反应，随着PSA浓度的增加，核-卫星组装体会有不同程度的解散，上清液中游离的拉曼信号颗粒浓度会发生相应的变化，通过磁分离作用分离底物，进而从上清液中得到不同的拉曼信号强度；
(6)根据PSA浓度与拉曼信号强度的关系建立两者之间的标准曲线，从而应用拉曼信号强度对PSA进行检测。
3.根据权利要求2所述的基于磁核-金卫星组装体的PSA检测方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的活化剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺；
步骤(1)中所述的表面修饰有羧基的磁性微粒为表面修饰有羧基的四氧化三铁，其粒径为400～500nm。
4.根据权利要求1或2所述的基于磁核-金卫星组装体的PSA检测方法，其特征在于：所述的修饰有PSA适配体PSA aptamer的磁性纳米颗粒的溶液浓度为0.4～0.6mg/mL。
5.根据权利要求2所述的基于磁核-金卫星组装体的PSA检测方法，其特征在于：步骤(2)中所述的拉曼信号分子为4,4'-联吡啶；
步骤(2)中所述的金纳米颗粒平均粒径为30nm～35nm；
步骤(2)中所述的拉曼信号颗粒的溶液浓度为0.95～1.05mmol/L。
6.根据权利要求2所述的基于磁核-金卫星组装体的PSA检测方法，其特征在于：
步骤(3)中所述的捕获探针和拉曼信号颗粒体积混合比例为3：(2～2.5)。
7.根据权利要求2所述的基于磁核-金卫星组装体的PSA检测方法，其特征在于：步骤(4)中所述的一定的浓度梯度为0、1、5、50、500pg/mL以及5、50ng/mL，其中0pg/mL为对照；
步骤(5)中所述的室温孵育的时间为8h～12h。
8.根据权利要求2所述的基于磁核-金卫星组装体的PSA检测方法，其特征在于：
步骤(5)中所述的核-卫星组装体溶液与目标物PSA的体积比值为30～35。
9.根据权利要求2所述的基于磁核-金卫星组装体的PSA检测方法，其特征在于：步骤(5)中所述的拉曼信号强度是通过显微拉曼光谱仪测得；所述的显微拉曼光谱仪的操作条件为激发光源是波长为632.8nm的He-Ne激光器，到达样品的激光功率为1mW，信号收集时间为30～35s。
10.根据权利要求2所述的基于磁核-金卫星组装体的PSA检测方法，其特征在于：步骤(5)中所述的拉曼信号强度是选取拉曼信号分子特征拉曼谱中最强的谱峰作为定量峰。
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