CN109187481A - 一种基于Fe3O4@Au NPs和分子印迹的农药检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于Fe3O4@Au NPs和分子印迹的农药检测方法，属于食品监测等技术领域。该方法通过以合成的由壳聚糖包裹的磁性纳米材料Fe3O4为内核，在其表面包覆金纳米颗粒形成金‑磁复合粒子，最终构建Fe3O4@Au NPs复合纳米表面增强拉曼基底，该基底不仅保留磁性粒子的性质还引入了金纳米粒子优良的光学性能以及良好的生物适用性等特点，在该Fe3O4@Au NPs拉曼基底的基础上，以农药为目标分子，壳聚糖为功能单体，戊二醛为交联剂制备了纳米尺度的分子印迹微球，可对农药具有一定的选择性，可用于实际样品中农药的拉曼检测，通过筛选拉曼特征峰，建立该农药分子检测的标准曲线。本方法操作简单，检测速度快、精度较高、稳定性好，可以应用到食品中农残的原位探测中。

Description

一种基于Fe3O4@Au NPs和分子印迹的农药检测方法
技术领域
本发明具体涉及一种基于Fe3O4@Au NPs和分子印迹的农药检测方法，适用于食品安全、材料化学等技术领域。
背景技术
农药的发明和使用无疑大大提高了农作物的产量，但随着农药的大量和不合理地使用，食品中的农药残留对人类健康造成的负面影响也日益显露出来。发展快速、可靠、灵敏和实用的农药残留分析技术无疑是控制农药残留、保证食用者安全和避免国际间有关贸易争端的基础。如果过多的使用农药，由于其吸附性强，残留微量药剂会造成一定的危害，使用方法不当，则会引起人和牲畜程度不同的毒副作用。有害的农药残留不仅与国民的人身安全密切相关，而且已经成为影响我国食品进出口贸易的重要因素。因此，农残检测重要性的日益突出，对其分析检测结果呈现出更高的目标。世界各国逐年降低的农残限量标准与逐年递增的检测项目，对其分析检测方法显示出更高的要求，常规的农药残留检测技术在分析检测过程中存在诸多缺陷，尤其是在灵敏度、准确性、检测费用、检测时限等方面。因此，研究一种高效、准确、灵敏的现代农药残留检测手段具有重要意义。目前常规的用于农药噻虫嗪的检测方法，主要有免疫分析技术、仪器分析技术、光谱分析技术。
免疫分析技术简单、灵敏，在农残分析检测中具有重要作用。最常用的方法有：酶免疫技术、放射免疫技术和金免疫技术。酶免疫技术(Enzyme immunoassay，EIA)主要是用酶进行标记，被标记后与抗原(或抗体)连接，利用两者的特异性反应使抗体与酶标抗原结合(或抗原与酶标抗体相结合)，然后加入反应底物，借助酶与相应反应物的显色反应进行待测物的定性、定量分析。放射免疫技术(Radioimmunoassay，RIA)是一种结合了高灵敏度的放射性同位素标记物与高度特异性的抗原/体反应，通过对同位素的跟踪获得目标物信息的检测分析。金免疫技术(Immune colloidalgold labeling technique，ICG)主要利用金颗粒具有的高密度性，使其在金标记蛋白的结合处仅仪器放大下现黑点，而在对应的配体处可裸眼视粉(红)点，所以可用于定性及半定量检测。基于免疫分析技术的农药残留检测方法，能够减少有毒有害试剂的使用，使检测操作简洁，具有较高的反应灵敏度，但仍然存在一些缺点，比如酶的特性范围有限，导致检测目标物的适用范围受限，抗原抗体的使用成本较高等。
仪器分析技术，目前主以利用气相色谱法、高效液相色谱法、气相色谱-质谱法和液相色谱-质谱法进行农药残留的检测。气相色谱法(Gas Chromatography，GC)主要是依据气相和固定相的不同靶点性质及其分布系数的差异，使多种农药在气体和固体两相之间的多次分布，从而实现目标检测对象的分离，最后以一定的顺序进行列、分离。高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)是建立于传统液相色谱，并融合气相色谱的有关机理和技术，用以检测并量化不同成分比例的一种现代分离分析技术。气相色谱-质谱(Gas Chromatography-Mass Spectrometry，GC-MS)是一种将气相色谱仪与质谱仪作为一个整体，其中GC用于分离混合物中的成分；MS的作用为对未知化合物的分子量、分子式或官能团进行鉴定。液相色谱-质谱法(Liquid Chromatography-Mass Spectrometry，LC-MS)是一种将液相色谱仪与质谱仪作为一个整体使用的分析方法。上所述方法分析能力强、检测范围广，其结果具备稳定可靠、灵敏度高及重现性好等特点，并发展成熟形成一定行业标准，但其前处理步骤复杂且检测过程繁杂、仪器设备昂贵、分析时间很长，特异性不明显，并需要专业操作人员辅助才能完成分析检测。因此，不适应现场的快速检测，也不利于普及应用和实现牛奶中农药残留快速检测的目的。
随着仪器技术的迅猛发展，一系列光谱分析检测方法应运而生。在此领域，目前经常使用的农药残留检测技术包括：高光谱成像、荧光光谱、红外光谱和拉曼光谱。与传统的分析检测方法相比，光谱分析方法具有快速、简便、环保等特点，可用于农药残留的快速检测，为食品中农药残留的检测提供了一些新的解决方案。但同时，他们也存在一定的不足，在定量分析的精准度及灵敏度方面尚有欠缺。例如高光谱技术和红外光谱技术试验了农药的光谱统计特征，适合于较高浓度的农药检测，而对于微量或者痕量的农药残留检测效果有待改进；光光谱技术因为有些农药不具有荧光特性，使其同样在应用范围上存在一定的局限性。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于Fe3O4@Au NPs和分子印迹的农药检测方法，其灵敏度高、可靠性强、检测速度快，可以实现农药的快速免标记检测。
为了实现上述目的，本发明方法操作简单，检测速度快、精度较高、稳定性好等可以实现对农药的大批量原位检测。该方法适用于食品安全、材料化学等技术领域。
本发明的技术方案包括：一种基于Fe3O4@Au NPs和分子印迹的农药检测方法，将Fe3O4和贵金属Au进行复合制备出复合型表面增强拉曼基底，以农药为目标分子，壳聚糖为功能单体，戊二醛为交联剂制备了纳米尺度的分子印迹微球，结合拉曼光谱技术，构建对农药分子的特异性捕捉，建立定量检测体系。
进一步，所述Fe3O4为采用壳聚糖修饰Fe3O4，在高温分解后，使Fe3O4表面包裹一层壳聚糖，使Fe3O4表面带有正电荷。
进一步，所述Fe3O4具有磁性性能，在检测农药的过程中通过外部磁铁对农药和Fe3O4@AuNPs结合体进行收集。
进一步，在构建对农药分子的特异性捕捉过程中，还包括采用免标记的方法检测到农药的拉曼特征峰，并与密度泛函数理论计算的理论拉曼谱峰进行对比，实现了特征拉曼谱峰的归属。
进一步，将Fe3O4和贵金属Au进行复合制备出复合型表面增强拉曼基底的具体过程如下：
步骤1.1，壳聚糖包裹的Fe3O4纳米颗粒制备：取0.82g FeCl3·H2O和40mL乙二醇在常温下剧烈搅拌至完全溶解；将反应温度升至50℃，在上述反应溶液中加入3.6gNaAc和0.5g壳聚糖，剧烈搅拌20min至完全溶解；将上述反应液加入50ml聚四氟乙烯内衬中，放入反应釜在200℃下反应16h；反应结束后将反应釜取出冷却至室温，利用外部磁铁收集合成好的壳聚糖包裹的Fe3O4纳米颗粒，用乙醇清洗三次，在真空干燥箱中60℃干燥5h；
步骤1.2，Au NPs的合成：取0.25mL，0.1M的HAuCl4加入到100mL超纯水中，加热搅拌至反应液沸腾，快速注入1.5mL，1％的柠檬酸钠溶液反应30min至反应液呈酒红色，形成AuNPs；
步骤1.3，Fe3O4@Au NPs的合成：取10mg壳聚糖包裹的Fe3O4和30mLAuNPs溶液混合搅拌2h后外加磁场分离洗涤后得到Fe3O4-CS-Auseed1复合粒子，在上述反应液中加入5mg壳聚糖在60℃条件下搅拌2h，外加磁场分离洗涤后，加入40mL制备好的AuNPs溶液搅拌12h，外加磁场富集分离后，保存磁性部分得到Fe3O4@AuNPs。
进一步，以农药为目标分子，壳聚糖为功能单体，戊二醛为交联剂制备了纳米尺度的分子印迹微球的具体过程为：取0.2g壳聚糖溶解在20mL的1％醋酸溶液中在室温下搅拌溶解；在上述反应液中加入27mg农药和4mL乙腈，在室温下搅拌2h；在上述反应液中加入10mLFe3O4-CS-AuNPs溶液，室温搅拌2h，外加磁场分离水洗三次，加入适量戊二醛溶液室温反应2h，升温至50℃，反应6h后用体积比为9:1的甲醇/乙酸混合溶液超声洗涤提取模板农药分子，最后磁分离，真空干燥后得到Fe3O4@Au NPs分子印迹微球；非印迹Fe3O4@Au NPs微球制备过程除了不加模板农药分子外，其余步骤相同。
进一步，所述结合拉曼光谱技术，构建对农药分子的特异性捕捉，建立定量检测体系的具体过程为：称取一定量Fe3O4@Au NPs分子印迹微球分别和不同浓度的农药溶液混合5小时，在780nm激光激发下，利用搭建的便携式拉曼光谱仪采集拉曼光谱，从而建立拉曼信号强度和对应农药浓度间的标准曲线。
与现有的技术相比，将分子印迹应用到表面拉曼光谱技术中可以降低由连接适配体主导的特异性检测的成本。本发明制得的SERS基底结合分子印迹技术，使该基底在具有较强的特异性捕捉能力的同时也具有较强的SERS效应，可以提高了检测农药的稳定性和灵敏性。
本发明的优点在于：
1)本发明制备的表面增强拉曼基底，将磁性材料和贵金属材料以及分子印迹技术相结合作为表面拉曼增强基底。
2)本发明制备的表面增强拉曼基底，Fe3O4@Au NPs具有磁性，在检测的过程中方便收集，有利于制作便携式的SERS基底。
3)本发明采用分子印迹技术实现了非标记检测农药，节约检测成本，提高了检测速度。
4)本发明制备的的检测方法可用于食品中农药残留的原位检测，其检测速度快，检测范围广，稳定性、灵敏度高，在食品安全、环境监测等技术领域广泛应用。
附图说明
图1为Fe3O4@Au NPs复合纳米物质的表征图：(a)为Fe3O4的X射线衍射图；(b)为Fe3O4@Au NPs、AuNPs和Fe3O4紫外光谱图。
图2为不同浓度噻虫嗪农药的表面增强拉曼光谱图。
图3为不同浓度噻虫嗪农药的标准曲线图。
具体实施方式
表面增强拉曼光谱(Surface-Enhanced Raman Scattering，SERS)技术是拉曼光谱的延伸与完善。其光谱可以获取分子结构的指纹信息，具有强大的分子识别能力，是分子信息快速获取的理想手段。因此，表面增强拉曼方法在构建痕量物质的快速、灵敏检测传感器方面，得到了很大的关注与应用。根据被测物特定波长下的拉曼峰强度，可以建立被测物浓度和拉曼峰强度之间的线性关系，实现对被测物浓度的定量分析。
实施实例1为了进一步验证本发明所制备的检测方法对食品中噻虫嗪农药的检测作用，本发明实例，以噻虫嗪农药的检测为例，具体操作步骤如下：
1)壳聚糖包裹的Fe3O4纳米颗粒制备：取0.82g FeCl3·H2O和40mL乙二醇在常温下剧烈搅拌至完全溶解；将反应温度升至50℃，在上述反应溶液中加入3.6gNaAc和0.5g壳聚糖，剧烈搅拌20min至完全溶解；将上述反应液加入50ml聚四氟乙烯内衬中，放入反应釜在200℃下反应16h；反应结束后将反应釜取出冷却至室温，利用外部磁铁收集合成好的壳聚糖包裹的Fe3O4纳米颗粒，用乙醇清洗三次，在真空干燥箱中60℃干燥5h。
2)Au NPs的合成：取0.25mL，0.1M的HAuCl4加入到100mL超纯水中，加热搅拌至反应液沸腾，快速注入1.5mL，1％的柠檬酸钠溶液反应30min至反应液呈酒红色，形成AuNPs。
3)Fe3O4@Au NPs的合成：取10mg壳聚糖包裹的Fe3O4和30mlAuNPs溶液混合搅拌2h后外加磁场分离洗涤后得到Fe3O4-CS-Auseed1复合粒子，在上述反应液中加入5mg壳聚糖在60℃条件下搅拌2h，外加磁场分离洗涤后，加入40mL制备好的AuNPs溶液搅拌12h，外加磁场富集分离后，保存磁性部分得到Fe3O4-CS-AuNPs。
4)分子印迹微球的制备：取0.2g壳聚糖溶解在20mL的1％醋酸溶液中在室温下搅拌溶解；在上述反应液中加入27mg噻虫嗪和4mL乙腈，在室温下搅拌2h；在上述反应液中加入10mLFe3O4-CS-AuNPs溶液，室温搅拌2h，外加磁场分离水洗三次，加入适量戊二醛溶液室温反应2h，升温至50℃，反应6h后用体积比为9:1的甲醇/乙酸混合溶液超声洗涤提取模板农药分子，最后磁分离，真空干燥后得到Fe3O4@Au NPs分子印迹微球；非印迹Fe3O4@Au NPs微球制备过程除了不加模板农药分子外，其余步骤相同。
5)样品表面增强拉曼光谱SERS的采集：称取一定量Fe3O4@Au NPs分子印迹微球分别和不同浓度的农药溶液混合5小时，在780nm激光激发下，利用自行搭建的便携式拉曼光谱仪采集拉曼光谱，从而建立拉曼信号强度和对应农药浓度间的标准曲线。
图1为Fe3O4@Au NPs复合纳米物质的表征图：(A)为Fe3O4的X射线衍射图；(B)为Fe3O4@Au NPs、AuNPs和Fe3O4紫外光谱图。图2为不同浓度噻虫嗪农药的表面增强拉曼光谱图。图3为不同浓度噻虫嗪农药的标准曲线图。
综上，本发明涉及一种基于Fe3O4@Au NPs和分子印迹的农药检测方法。该方法为：将磁性材料和Au纳米相结合来增强农药分子的拉曼信号，采用分子印迹技术来对特定的农药进行特异性的捕捉，建立农药分子定量检测的标准曲线。本发明方法操作简单，检测速度快、精度较高、稳定性好等可以实现对农药的大批量原位检测。该方法适用于食品安全、材料化学等技术领域。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示意性实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims (7)

1.一种基于Fe3O4@Au NPs和分子印迹的农药检测方法，其特征在于：将Fe3O4和贵金属Au进行复合制备出复合型表面增强拉曼基底，以农药为目标分子，壳聚糖为功能单体，戊二醛为交联剂制备了纳米尺度的分子印迹微球，结合拉曼光谱技术，构建对农药分子的特异性捕捉，建立定量检测体系。
2.根据权利要求1所述的一种基于Fe3O4@Au NPs和分子印迹的农药检测方法，其特征在于，所述Fe3O4为采用壳聚糖修饰Fe3O4，在高温分解后，使Fe3O4表面包裹一层壳聚糖，使Fe3O4表面带有正电荷。
3.根据权利要求2所述的一种基于Fe3O4@Au NPs和分子印迹的农药检测方法，其特征在于，所述Fe3O4具有磁性性能，在检测农药的过程中通过外部磁铁对农药和Fe3O4@Au NPs结合体进行收集。
4.根据权利要求1所述的一种基于Fe3O4@Au NPs和分子印迹的农药检测方法，其特征在于，在构建对农药分子的特异性捕捉过程中，还包括采用免标记的方法检测到农药的拉曼特征峰，并与密度泛函数理论计算的理论拉曼谱峰进行对比，实现了特征拉曼谱峰的归属。
5.根据权利要求1所述的一种基于Fe3O4@Au NPs和分子印迹的农药检测方法，其特征在于，将Fe3O4和贵金属Au进行复合制备出复合型表面增强拉曼基底的具体过程如下：
步骤1.1，壳聚糖包裹的Fe3O4纳米颗粒制备：取0.82g FeCl3·H2O和40mL乙二醇在常温下剧烈搅拌至完全溶解；将反应温度升至50℃，在上述反应溶液中加入3.6gNaAc和0.5g壳聚糖，剧烈搅拌20min至完全溶解；将上述反应液加入50ml聚四氟乙烯内衬中，放入反应釜在200℃下反应16h；反应结束后将反应釜取出冷却至室温，利用外部磁铁收集合成好的壳聚糖包裹的Fe3O4纳米颗粒，用乙醇清洗三次，在真空干燥箱中60℃干燥5h；
步骤1.2，Au NPs的合成：取0.25mL，0.1M的HAuCl4加入到100mL超纯水中，加热搅拌至反应液沸腾，快速注入1.5mL，1％的柠檬酸钠溶液反应30min至反应液呈酒红色，形成AuNPs；
步骤1.3，Fe3O4@Au NPs的合成：取10mg壳聚糖包裹的Fe3O4和30mLAuNPs溶液混合搅拌2h后外加磁场分离洗涤后得到Fe3O4-CS-Auseed1复合粒子，在上述反应液中加入5mg壳聚糖在60℃条件下搅拌2h，外加磁场分离洗涤后，加入40mL制备好的AuNPs溶液搅拌12h，外加磁场富集分离后，保存磁性部分得到Fe3O4@AuNPs。
6.根据权利要求1所述的一种基于Fe3O4@Au NPs和分子印迹的农药检测方法，其特征在于，以农药为目标分子，壳聚糖为功能单体，戊二醛为交联剂制备了纳米尺度的分子印迹微球的具体过程为：取0.2g壳聚糖溶解在20mL的1％醋酸溶液中在室温下搅拌溶解；在上述反应液中加入27mg农药和4mL乙腈，在室温下搅拌2h；在上述反应液中加入10mLFe3O4-CS-AuNPs溶液，室温搅拌2h，外加磁场分离水洗三次，加入适量戊二醛溶液室温反应2h，升温至50℃，反应6h后用体积比为9:1的甲醇/乙酸混合溶液超声洗涤提取模板农药分子，最后磁分离，真空干燥后得到Fe3O4@Au NPs分子印迹微球；非印迹Fe3O4@Au NPs微球制备过程除了不加模板农药分子外，其余步骤相同。
7.根据权利要求1所述的一种基于Fe3O4@Au NPs和分子印迹的农药检测方法，其特征在于，所述结合拉曼光谱技术，构建对农药分子的特异性捕捉，建立定量检测体系的具体过程为：称取一定量Fe3O4@Au NPs分子印迹微球分别和不同浓度的农药溶液混合5小时，在780nm激光激发下，利用搭建的便携式拉曼光谱仪采集拉曼光谱，从而建立拉曼信号强度和对应农药浓度间的标准曲线。
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