CN108027368A - 利用呼出气体的起源于肺脏外组织的癌症的非侵入性检测 - Google Patents

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Abstract

提供了一种检测或筛查受试者试样中起源于肺脏外组织的癌症的非侵入性方法。该方法包括检测来自受试者试样的呼出气体中升高水平的一种或多种身为癌症生物标记的含羰基的挥发性有机化合物(VOCs)。该方法可以进一步包括：从受试者试样获得呼出气体；形成含羰基的VOCs与反应性化合物的加合物；定量含羰基的VOCs的加合物以建立加合物中每一种的对象值；并且将每个对象值与含羰基的VOCs的加合物中每一种的健康试样阈值进行比较。量大于健康试样阈值的一个或多个对象值也可用于筛查受试者试样中的癌症。

Description

利用呼出气体的起源于肺脏外组织的癌症的非侵入性检测
政府资助支持条款
本发明是在国家科学基金会授予的CBET-1159829基金资助下，在政府的支持下完成的。政府对本发明有一定的权利。
相关申请的交叉引用
根据37 C.F.R.§1.78(a)，本申请要求2015年7月31日提交的，先前提交的共同未决的临时申请序列号62/199,698的权益和优先权，其全部内容通过引用明确并入本文。
技术领域
本发明涉及用于检测和筛查癌症的非侵入性方法，并且更具体地涉及用于检测和筛查肺脏外组织中的癌症以及起源于肺脏外组织但是会转移到肺脏的癌症的非侵入性方法。
背景技术
癌症是全球死亡的主要原因，但癌症的早期发现是提高癌症患者存活率的关键因素。目前，成像和活检是用于癌症检测的主要技术。
近年来，呼出气体的分析已经成为国际研究的前沿，因为它适用于非侵入性健康诊断。已经开发了几种方法来分析呼出气体，包括使用传感器阵列、质子-传递反应质谱(PTR-MS)、选择离子流管质谱(SIFT-MS)和气相色谱-质谱(GC-MS)，仅举几例。虽然呼出气体中的一些挥发性有机化合物(VOCs)已被报道为潜在的肺癌生物标记，但是呼吸分析方法尚未临床上用于诊断肺脏外组织中的癌症或起源于肺脏外组织但是会转移到肺脏的癌症。
此外，分析呼出气体的癌症指示生物标记(即排泄的代谢产物)是一项艰巨的任务，迄今在人呼气中已经鉴定了超过1700种内源性VOCs。另外，这些内源性VOCs中的一些以小于用于检测和/或鉴定它们的检测方法的实验误差的量存在于呼出气体中。例如，呼气中的一些VOCs的浓度范围仅从万亿分之几(ppt)到十亿分之几(ppb)；呼气样品中的一些化学物质的浓度比普遍的VOCs(例如水蒸汽和二氧化碳)高数百万倍，为了避免干扰大多数分析仪器，可能需要将其去除。此外，呼气是含有醇、酮和醛的类似物/同系物/异构体混合物的化学多样性混合物，这使得疾病生物标记的鉴定复杂化；呼气中的VOCs可能包括非代谢组分，这可能会在呼气分析中引入虚假的生物标记。
因此，为了有效且准确地分析呼吸中的VOCs，以检测或鉴定疾病状态，需要克服多重障碍。要克服的第一个障碍是浓缩所关注的VOCs。从稀释的气体样品中浓缩一种或多种所关注的VOCs的一般方法集中在以下中的一种：化学法、低温法和吸附法。第二个障碍是鉴定生物标记和/或特定生物标记的量之间的特定关系，其与对疾病状态的存在的高水平的确定性相关联，并且具有假阴性的较低可能性。
因此，鉴于癌症检测/鉴定和筛查的传统方法的缺点和挑战，需要新的非侵入性方法。
发明内容
本发明的实施例提供了一种用于检测或筛查起源于肺脏外组织的癌症的非侵入性方法。
根据本发明的一个实施例，提供了一种检测或筛查受试者试样中的癌症疾病状态的非侵入性方法。该方法包括定量一种或多种含羰基的挥发性有机化合物(VOCs)的水平，所述含羰基的挥发性有机化合物(VOCs)是来自受试者试样的呼出气体中的癌症的生物标记，并且如果一种或多种含羰基的VOCs的水平高于其各自的健康试样阈值，则将受试者试样诊断为具有癌症疾病状态的可能性。在一个实施例中，含羰基的VOC是通过脱水反应形成的反应性化学物的加合物。含羰基的VOC生物标记选自由2-丁酮、2-羟基乙醛、3-羟基-2-丁酮、4-羟基-2-己烯醛、4-羟基-2-壬烯醛以及包括2-戊酮和戊醛的C5H10O化合物的混合物组成的群组。升高的生物标记的数量与癌症的可能性相关，这意味着更高的生物标记与癌症的可能性增加有关。
根据另一个实施例，提供了一种筛查受试者试样中的癌症疾病状态的方法，所述方法包括以下步骤：从受试者试样获得呼出气体，其中呼出气体包括多种含羰基的挥发性有机化合物(VOCs)；形成多种含羰基的VOCs与反应性化合物的加合物；定量多种含羰基的VOCs中的每一种的加合物中的每一种以建立加合物中的每一种的对象值；以及将每个对象值与多种含羰基的VOCs的加合物中的每一种的健康试样阈值进行比较，所述健康试样阈值对应于从健康试样计算的值，以确定存在量大于它们各自的健康试样值的范围下的一个或多个对象值，从而指示受试者试样中癌症疾病状态的相当大的可能性。适于使用本文所述的方法进行检测的癌症的示例性类型是起源于肺脏外组织的原发性癌症，并且可包括转移至肺脏的原发性癌症。示例性的原发性癌症包括但不限于声门上喉鳞状细胞癌、胰腺癌、黑素瘤、结肠癌、乳腺癌、肾细胞癌、前列腺癌、卵巢癌、食管癌、软骨肉瘤、胆管癌、淋巴瘤和鳞状皮肤癌。在其它实施例中，两个或更多个，或者三个或更多个，或者四个或更多个对象值高于它们各自的健康试样值。
根据另一个实施例，提供了一种检测受试者试样中的癌症疾病状态的非侵入性方法，所述方法包括以下步骤：浓缩从受试者试样获得的呼出气体中所含的多种含羰基的挥发性有机化合物(VOCs)，其中所述多种含羰基的VOCs选自由2-丁酮、2-羟基乙醛、3-羟基-2-丁酮、4-羟基-2-己烯醛、4-羟基-2-壬烯醛以及包含2-戊酮和戊醛的C5H10O化合物的混合物组成的群组，其与反应性化合物形成加合物；定量所述多种含羰基的VOCs的加合物以建立所述多种含羰基的VOCs的加合物的每个成员的对象值；以及将所述多种含羰基的VOCs的加合物的每个成员的对象值与所述多种含羰基的VOCs的加合物的每个成员的健康试样阈值进行比较，以确定存在量大于其各自的健康试样阈值下的一个或多个对象值，从而指示受试者试样中癌症疾病状态的相当大的可能性。在另一个实施例中，两个或更多个，或者三个或更多个，或者四个或更多个对象值高于它们各自的健康试样值。在另一个实施例中，所述多种含羰基的VOCs选自由2-丁酮、2-羟基乙醛、3-羟基-2-丁酮和4-羟基-2-己烯醛组成的群组。
附图说明
并入并构成本说明书的一部分的附图说明了本发明的实施例，并且与上面给出的本发明的一般描述以及下面给出的具体实施方式一起用于描述本发明。
图1是根据本发明的一个实施例的用于浓缩空气样品或呼气样品中的含羰基的VOCs的示意性装置。
图2A是显示连接到两个熔融石英管的适用于图1所示的示意图的预浓缩器的照片；显示预浓缩器放置在美国一角硬币上以指示其尺寸。
图2B是显示图2A所示的预浓缩器内的微柱阵列的扫描电子显微照片。
图3是比较具有多种癌症类型的受试者中C4H8O水平与健康对照受试者的图。
图4是比较具有多种癌症类型的受试者中C2H4O2水平与健康对照受试者的图。
图5是比较具有多种癌症类型的受试者中C4H8O2水平与健康对照受试者的图。
图6是比较具有多种癌症类型的受试者中的4-HHE水平与健康对照受试者的图。
具体实施方式
根据本发明的一个实施例，提供了一种检测或筛查受试者试样中的癌症疾病状态的方法。
在一个实施例中，该方法包括检测一种或多种含羰基的挥发性有机化合物(VOCs)的水平，所述含羰基的挥发性有机化合物(VOCs)是来自受试者试样的呼出气体中的癌症的生物标记，并且如果一种或多种含羰基的VOCs的水平高于其各自的健康试样阈值，则将受试者试样诊断为具有癌症疾病状态的可能性。在一个优选实施例中，分析含羰基的VOCs的加合物。加合物通过与反应性化学品的脱水反应形成，并且有利地允许呼出气体中的含羰基的VOCs在分析测试前被预浓缩。根据本发明的实施例，含羰基的VOC生物标记选自由2-丁酮、2-羟基乙醛、3-羟基-2-丁酮、4-羟基-2-己烯醛、4-羟基-2-壬烯醛以及包括2-戊酮和戊醛的C5H10O化合物的混合物组成的群组。升高的生物标记的数量与癌症的可能性相关，这意味着更高的生物标记与癌症的可能性增加有关。
在另一个实施例中，该方法包括以下步骤：从受试者试样获得呼出气体，其中呼出气体包括多种含羰基的挥发性有机化合物(VOCs)；形成多种含羰基的VOCs与反应性化合物的加合物；定量多种含羰基的VOCs中的每一种的加合物中的每一种以建立加合物中的每一种的对象值；以及将每个对象值与多种含羰基的VOCs的加合物中的每一种的健康试样值范围进行比较，所述健康试样值范围对应于从健康试样计算的值，以确定存在量大于它们各自的健康试样值的范围下的至少三个对象值，从而指示受试者试样中癌症疾病状态的相当大的可能性。适于使用本文所述的方法进行检测的癌症的示例性类型是起源于肺脏外组织的原发性癌症，并且可包括转移至肺脏的原发性癌症。示例性的原发性癌症包括但不限于声门上喉鳞状细胞癌、胰腺癌、黑素瘤、结肠癌、乳腺癌、肾细胞癌、前列腺癌、卵巢癌、食管癌、软骨肉瘤、胆管癌、淋巴瘤和鳞状皮肤癌。
根据本发明的实施例，所述多种含羰基的VOCs选自由2-丁酮、2-羟基乙醛、3-羟基-2-丁酮、4-羟基-2-己烯醛(“4-HHE”)、4-羟基-2-壬烯醛(“4-HNE”)以及包括2-戊酮和戊醛的C5H10O化合物的混合物组成的群组。
如本文所用，“健康试样”被定义为不具有任何可检测癌症(如通过检测癌症的标准方法所确定的，包括CT扫描和身体检查)并且不具有可诊断的癌症疾病状态的试样。
如本文所用，“受试者试样”被定义为为了诊断或筛查癌症疾病状态的存在/不存在而从呼出气体样品获得的试样。先前已经使用计算机断层摄影术(CT)筛查了受试者试样，其中检测到可疑病变或结节，并且利用高于其各自的健康试样阈值的两个或更多个，或三个或更多个生物标记值的更高特异性(真阴性)测试是有利的。为了筛查的目的，可能没有使用CT扫描筛查受试者试样，但可能具有其它风险因素(例如，已知暴露于致癌物、癌症家族史或遗传标记)和利用高于其各自的健康试样阈值的一个或多个生物标记值的更高选择性(真阳性)测试是有利的。
如本文所用，“健康试样阈值”意指通过对多个健康试样执行测试方法而确定的值，其中超过所确定的健康试样阈值的对象值指示癌症疾病状态。
如本文所用，“癌症疾病状态的相当大的可能性”意指基于测试方法的置信度水平，癌症疾病状态存在于受试者试样中的概率为约80％或更多，而“癌症疾病状态的可能性”意指基于测试方法的置信度水平，癌症疾病状态存在于受试者试样中的概率为约50％或更多。当然，还考虑了中等水平的可能性，例如约60％或更多，或者约70％或更多。
如本文所用，“加合物”或“缀合物”表示反应性化合物与含羰基的VOCs癌症生物标记的反应产物。这些加合物通过醛或酮的脱水反应形成，其将挥发性癌症生物标记转化为非天然的非挥发性化合物。
如前所述，呼吸分析是一种发展模式，有可能简化疑似癌症的检查工作。然而，直到本发明的发现之前，由于多种因素而没有任何方法表现出临床实用性，例如涉及的含羰基的VOC生物标记化合物的浓度极低，这些化合物的分离过程的复杂性以及缺乏对临床医生有用的诊断算法。本发明的实施例集中于选择的含羰基的VOCs，例如2-丁酮、2-羟基乙醛、3-羟基-2-丁酮、4-羟基-2-己烯醛、4-羟基-2-壬烯醛和/或包括2-戊酮和戊醛的C5H10O化合物的混合物。
根据本发明的实施例，检测癌症的方法包括选择性地捕获和浓缩某些癌症生物标记，即含羰基的VOCs，其可以通过呼出气体经过化学预浓缩器组件10来实现，所述化学预浓缩器组件10包括具有入口17和出口19的化学预浓缩器15，所述入口17和出口19允许呼出气体样本通过其中，如图1所示。组件10还包括可膨胀的聚合物膜装置25，其可以在化学预浓缩器15的入口17之前流体地连接到流量计35。化学预浓缩器15的出口19可以流体地连接到压力计40、阀45和真空泵50，如下面更详细描述的。
来自受试者试样的呼出气体的一个或多个样品可被收集在可膨胀的聚合物膜装置25中。适于呼出气体样品收集的一种示例性可膨胀的聚合物膜装置是一升气体取样袋(Sigma-Aldrich Co.,LLC,St.Louis,MO)，其包括阀。对于样品收集，受试者可以通过阀直接呼入气体采样袋中，阀提供非侵入性收集技术。
流量计35不特别限于任何特定类型的流量计。有利地，流量计35应该能够精确地测量进入化学预浓缩器15的气体的体积，这可以允许定量呼出气体样品中含羰基的VOCs的浓度。
压力计40、阀45和真空泵50类似地不特别限于任何特定的类型。真空泵50通过调节阀45拉动可以调节或从化学预浓缩器15分离的真空。压力计40可以用于指示真空泵50和整个化学预浓缩器组件10的正常运行和/或操作。
如上所述，呼出气体中许多生物标记的浓度水平低于许多标准分析技术的检测限。然而，利用醛和酮的羰基官能团与某些反应性化学物质的化学反应性，呼出气体中的含羰基的VOCs可以在分析前被预浓缩。因此，在美国专利号8,663,581中描述了一种适用于预浓缩呼出气体中的含羰基的VOCs的预浓缩器15，其全部内容并入文中并在文中进一步描述。应该理解的是，虽然在美国专利号8,663,581的教导中体现的预浓缩器和方法用于本文描述的本发明的实施例，但是本发明不特别限于此。可以使用其它预浓缩器装置和/或方法，只要所述装置和方法有效地预浓缩呼出气体中的所需的含羰基的VOCs以提供分析样品。
因此，根据一个实施例，化学预浓缩器15可以包括支撑结构和在支撑结构的表面上的反应性化合物层。如本文所用，短语“反应性化合物”包括通过共价键结合在一起的分子化合物和通过离子键结合在一起的盐。反应性化合物与含羰基的VOCs形成缀合物或加合物以进行收集和预浓缩。如本文所用，“含羰基”是指醛和酮。
一般而言，反应性化合物包括能够与所关注的VOC上的羰基官能团反应的反应性末端；能够可逆地在支撑结构表面上形成层的锚定部分，以及反应性末端与锚定部分之间的连接基团。如下式(I)中所示，反应性末端包括与杂原子(Z)、连接基团(L)和锚定部分(Y)结合的氨基(NH2)，其中Z、L和Y如下定义。根据本发明的实施例，反应性化合物具有根据式(I)的通式：
H2N-Z-L-Y 式(I)
其中Z是NH、NR或O；L是连接基团；Y是二取代或三取代的N或P部分；R选自由烷基、芳烷基、芳烯基和芳炔基组成的群组，其中每一个可以被取代或未被取代，并且任选地含有一个或多个杂原子。
根据一个实施例，Y可以是–NR1R2、或–NR1R2R3、–PR1R2、–PR1R2R4，其中R1、R2、R4独立地选自由烷基、芳烷基、芳烯基和芳炔基组成的群组，其中每一个可以被取代或未被取代，并且任选地含有一个或多个杂原子；并且R3选自由H、烷基、芳烷基、芳烯基和芳炔基组成的群组，其中每一个可以被取代或未被取代，并且任选地含有一个或多个杂原子。在一个替代实施例中，R1和R2组合还可以形成杂环，例如哌啶或吗啉部分。
根据本发明的另一个实施例，反应性化合物可以包括反应性末端、阳离子部分和其间的连接基团L。当Y是–NR1R2R3或–PR1R2R4时，反应性化合物是阳离子盐，其可以进一步包含-A，其是阴离子抗衡离子。因此，阳离子部分可以包含阳离子氮，例如铵离子，或阳离子磷，例如鏻。
当Y是磷时，R1、R2和R4全部可以是芳基，例如苯基。当Y是氮时，R1、R2和R3可以是烷基，其中的每一个可以被取代或未被取代，并且任选地含有一个或多个杂原子。在一个替代实施例中，当Y是氮时，R1、R2可以是烷基，其中的每一个可以被取代或未被取代，并且任选地含有一个或多个杂原子，并且R3可以是H。
根据本发明的实施例，反应性末端可以包含肼或氨氧基。例如，Z可以是氮，例如NH或NR，从而形成肼末端。或者，Z可以是氧，从而形成氨氧基末端。肼或氨氧基末端形成反应性化合物的反应性官能团，因此，醛和酮通过脱水或缩合反应与肼或氨基氧基官能团反应。因此，反应性化合物的反应性末端和VOC的羰基官能团是形成含羰基的VOC癌症生物标记的加合物的缩合反应的互补反应物。
根据本发明的实施例，式(I)的反应性化合物之间形成的缀合物或加合物是腙(当Z＝N时)或肟(当Z＝O时)。在任一加合物形式中，共价键将VOC固定到锚定部分，从而在分析前预浓缩含羰基的VOC癌症生物标记。
在反应性化合物中，连接基团L将反应性末端共价键合至锚定部分。反应性化合物不受其连接基团特别限制。然而，在反应性末端附近增加的取代可增加空间位阻，从而影响化合物的反应性。因此，如果需要，改变取代可以允许醛与酮分析物之间的区分。根据本发明的实施例，连接基团可以包括非离子片段，其可以是取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基或醚。例如，连接基团L可以是乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基或辛基片段。连接基团L可以包括醚，例如聚乙二醇(PEG)。
当反应性化合物是盐时，反应性化合物的阴离子成员(A)是平衡带正电荷部分的负电荷物质。根据另一个实施例，A可以是强酸的共轭碱。例如，A可以是卤化物，例如溴化物或氯化物。根据另一个实施例，A可以是弱酸的共轭碱。例如，A可以是羧酸酯，例如苯甲酸酯。在一个实施例中，Z为O且Y为氮，并且反应性化合物具有根据式(II)的通式：
其中L、R1、R2、R3和A如上定义。在另一个实施例中，R1、R2和R3中的至少一个是甲基，A是卤化物。
也设想反应性化合物可以包括多个反应性末端。例如，R1、R2和R3中的至少一个可以是包含至少两个杂原子，并且具有通式-L1-Z-NH2的取代或未取代的烷基，其中L1是铵氮与Z之间的连接基团。
如方案1中所示，根据式(II)，其中L为乙基的示例性反应性化合物(4)可以通过三步合成顺序实现。通过在Mitsunobu条件下先用N-羟基邻苯二甲酰亚胺(2)处理氨基醇(1)，随后使用烷基卤(R3-X)季铵化以提供被保护的盐(3)，可将氨基醇(1)转化为相应的邻苯二甲酰基保护的氨氧基铵盐(3)。通过肼解除去邻苯二甲酰基得到反应性化合物(4)。示例性反应性化合物在下表1中示出。
方案1：氨氧基反应性化合物(4)(Ph3P是三苯基膦；DEAD是偶氮二羧酸二乙酯)的合成。
在又一个实施例中，Z是O，并且Y是氮，并且反应性化合物具有根据式(III)的通式：
根据通式(III)的反应性化合物可以通过省略方案I所示的合成顺序中的季铵化步骤(2)来制备。例如，其中L是乙基的根据式(III)的示例性反应性化合物可以通过两步合成顺序来实现。通过先在Mitsunobu条件下用N-羟基邻苯二甲酰亚胺(2)处理氨基醇(1)，可将氨基醇(1)转化为其相应的邻苯二甲酰基保护的氨氧基。通过肼解除去邻苯二甲酰基得到式(III)的叔胺反应性化合物。示例性叔胺反应性化合物是N-(2-(氨氧基)乙基)-吗啉(AMA)。
根据一个实施例，叔胺基团可以用作锚定基团。在一个替代实施例中，叔胺反应性化合物可以通过用质子酸处理而转化为其布朗斯特盐。例如，可将式(III)的叔胺反应性化合物溶于合适的有机溶剂中并用酸处理以制备式(II)的反应性化合物，其中R3为H，并且A为酸的共轭碱。
反应性化合物可以溶解在一种或多种溶剂中，然后沉积在支撑结构的表面上。溶剂没有特别限制，但是应当能够蒸发但留下支撑结构的表面上的反应性化合物。合适的溶剂包括极性质子溶剂、极性非质子溶剂或其组合。示例性极性质子溶剂包括但不限于水和醇，例如甲醇和/或乙醇。示例性极性非质子溶剂包括但不限于乙腈、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜和硝基甲烷。反应性化合物可以通过将反应性化合物和至少一种溶剂合并而获得，然后将其施用到支撑结构的表面的液体提供。除去溶剂，从而将反应性化合物作为一层沉积在支撑结构的表面上。
根据本发明实施例的化学预浓缩器的支撑结构提供了在去除溶剂后可以保留反应性化合物的表面。有助于将反应性化合物保留在支撑结构表面上的结合力是反应性化合物的锚定部分(例如铵基)与支撑结构表面上的官能团(例如羟基)之间的相互作用，如下面进一步讨论的。
支撑结构的构造不特别受限于任何具体构造，但是当存在时，例如入口和出口结构、形状和阵列模式的特征可能影响反应性化合物捕获所需化学分析物的效率。因此，支撑结构可以被配置成优化表面积和流动动力学。
参考图2A，提供了显示连接到两个熔融石英管的预浓缩器的照片，其被显示放置在美国一角硬币上以指示其尺寸。在图2B中，提供了扫描电子显微照片，显示了图2A所示的预浓缩器内的微柱阵列。可以使用预浓缩器的其它表面构造。
支撑结构可以包括与反应性化合物相容且基本上不溶于用于沉积化合物的溶剂载体中的任何材料。更特别地，支撑结构的表面可以与支撑结构的下方部分相同或不同，可以包括选自由电介质和半导体组成的群组的材料，这有助于使用MEMS技术来制造。例如，表面材料可以是硅、多晶硅、氧化硅、氮化硅、氮氧化硅、碳化硅、钛、氧化钛、氮化钛、氮氧化钛、碳化钛、铝、氧化铝、氮化铝、氮氧化铝、碳化铝或其组合。有利地是，反应性化合物显示出与包含氧化硅、氧化钛、氧化铝或其组合的支撑结构表面的异常结合。
支撑结构的表面可以影响将反应性化合物粘附到支撑结构上的结合力。例如，晶片的硅表面的热氧化或二氧化硅的沉积可以控制硅烷醇基团的密度和/或微柱的SiO2表面上的静电电荷。
化学预浓缩器15还可以包括围绕支撑结构的壳体，其中壳体具有入口17和出口19。根据一个实施例，化学预浓缩器包括指向支撑结构的表面的气流导管。气流导管可以包括管状装置，其不附接到支撑结构，或者可以被制造到支撑结构中。出口19和/或入口17可以被配置成与采样泵连接，从而便于壳体外部的气体样品的一部分通过入口转移到壳体中。
可以通过任何合适的方法将反应性化合物施用到支撑结构的表面。在一个实施例中，使包含第一溶剂和反应性化合物的液体与支撑结构的表面接触，并通过减压蒸发除去第一溶剂。如果需要，第一溶剂可以在真空烘箱中蒸发。例如，反应性化合物的稀释溶液可以通过约3.5mg反应性化合物溶于约0.5mL第一溶剂中制备，该第一溶剂仅作为载体溶剂。将约10μL至约20μL的稀释溶液施用到预浓缩器，然后在减压下移除第一溶剂以提供约0.07至0.14mg反应性化合物在预浓缩器中的负载。在除去第一溶剂后，化学预浓缩器准备用于浓缩含羰基的VOC生物标记。
实际上，使测量体积的呼出气体样品通过化学预浓缩器，含羰基的VOCs与反应性化学物质形成加合物，其保留在支撑结构的表面上，从而有效地提供加合物的浓缩样品。在停止暴露后，化学预浓缩器可以用能够溶解VOC加合物的第二溶剂处理，以便于从支撑结构表面去除VOC加合物，并提供VOC加合物的浓缩样品用于分析测试。合适的溶剂包括极性质子溶剂、极性非质子溶剂或其组合。示例性极性质子溶剂包括但不限于水和醇，例如甲醇。示例性极性非质子溶剂包括但不限于乙腈、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜和硝基甲烷。如果需要，洗脱的浓缩样品可以通过蒸发至少一部分第二溶剂而进一步浓缩。
可以分析VOC加合物的浓缩样品的至少一部分以鉴定和定量VOC加合物。一种示例性分析工具是质谱法，其可以在进行或不进行色谱的情况下进行。例如，缀合物可以使用高效液相色谱联用质谱(HPLC-MS)或气相色谱联用质谱(GC-MS)进行分析。中性化学缀合物，例如可以使用根据通式(III)的叔胺反应性化合物获得的那些，适于使用GC-MS进行分析。叔胺反应性化合物的一个有益特征是其被酸质子化并形成正电荷的能力，这特别适于傅里叶变换离子回旋共振质谱(FT-ICR-MS)分析，如下讨论。通过比较FT-ICR-MS和GC-MS结果，通常可以鉴定和/或定量所有的酮和醛加合物。应该理解的是，其它分析技术(例如激光光谱等)也可用于定量生物标记加合物。内部标准也可以用来帮助鉴定和/或定量方法。
当使用的反应性化合物是根据通式(II)的阳离子盐时，另一种分析缀合物的有用方法是FT-ICR-MS。使用纳电喷雾技术，阳离子官能团还对[+]离子FT-ICR-MS赋予极高的灵敏度。这种异常高的灵敏度使得检测限在飞摩尔至阿摩尔范围内。这种灵敏度甚至比最灵敏的GC-MS好出几个数量级，最灵敏的GC-MS通常需要100-1,000飞摩尔或更多来检测。而且，因为VOCs是非挥发性的，所以可以将最终的分析溶液浓缩(例如，至干燥)并被非常少量的溶剂溶解。另外，纳电喷雾FTMS只需要几微升的样品体积。
此外，FT-ICR-MS还可以与化学电离(CI)或光电离(PI)耦合，并以负[-]离子模式操作。在[-]离子模式下操作，拒绝阳离子相，并允许分析保留在化学预浓缩器中的其它化学物质。在任一种模式中，反应性化合物的VOC加合物可以通过溶剂溶解，然后直接FT-ICR-MS分析从预浓缩器的结构支撑表面解吸。
可以使用FT-ICR-MS分析可从健康试样和受试者试样获得的含羰基的VOC加合物的浓缩样品并定量。然后可以使用统计学方法比较试样组之间的分析结果，例如Wilcoxon检验以确定试样组之间的统计学上的显著差异。根据本发明的实施例，含有羰基的特定VOC生物标记(即，2-丁酮、2-羟基乙醛、3-羟基-2-丁酮、4-羟基-2-己烯醛、4-羟基-2-壬烯醛以及包括2-戊酮和戊醛的C5H10O化合物的混合物)经鉴定以升高的水平存在于具有起源于肺脏外组织的不同类型的原发性癌症并可能包括转移到肺脏的原发性癌症的癌症患者(受试者试样)的呼出气体中。示例性原发性癌症包括但不限于声门上喉鳞状细胞癌、胰腺癌、黑素瘤、结肠癌、乳腺癌、肾细胞癌、前列腺癌、卵巢癌、食管癌、软骨肉瘤、胆管癌、淋巴瘤和鳞状皮肤癌。
文中，我们描述了一个定量分析，使用硅微反应器化学预浓缩器来捕获含羰基的VOCs，其形成呼出气体中所含的含羰基的VOCs的加合物，以及与癌症组织学相关的特定的含羰基VOCs的鉴定/定量。本文描述的方法仅需要受试者患者提供足够量的呼出气体，例如具有呼出气体的1升Tedlar袋。然后可以对呼出气体样品进行进一步处理和定量分析，例如通过质谱分析。
不受限于任一种特定的理论，本文所述的方法以所认为的原理为前提，即癌症诱导氧化应激和氧化酶，并且这又产生更高浓度的特定的含羰基的VOCs，其被释放到血液中并前往含羰基的VOCs在呼吸中被呼出的肺脏。含羰基的VOCs在生物化学途径中作为中间体产生，有些对于给定途径是独特的，例如自由基引起的脂质氧化。因此，调查集中于使用硅微反应器化学预浓缩器技术鉴定呼出气体中的含羰基的VOC癌症生物标记，该技术我们以前开发用于捕获和分析空气和呼出气体中的痕量羰基VOC。
以下公开了根据说明书的用于检测癌症疾病状态的方法的非限制性实例。这些实例仅仅是为了说明的目的，不能被认为是对本发明的范围或实施方式的限制。本领域普通技术人员将理解其它实例。
实例
化学预浓缩器
使用标准微机电系统(MEMS)制造技术由4"-硅晶片制造化学预浓缩器(或硅微反应器)，如Li,M.等人(2012)Preconcentration and Analysis of Trace VolatileCarbonyl Compounds(痕量挥发性羰基化合物的预浓缩和分析),Anal.Chem.84:1288-1293和美国专利号8,663,581中所述。微反应器(图2A)包括限定微流体通道的微柱阵列(参见图2B)。微柱具有通过干法反应离子蚀刻(DRIE)制成的尺寸50μm×50μm×250μm的高纵横比。微柱中心之间的距离为100μm。通道尺寸为7mm×5mm，微反应器中的总体积为约5μL。微反应器包括5千多个方形微柱，对应于约260mm2的总微柱表面积。微反应器的入口和出口使用基于石英的粘合剂装有190μm O.D.，100μm I.D.失活熔融石英管(参见图2A)。
用2-(氨氧基)-N,N,N-三甲基乙铵(ATM)碘化物(表1中的结构4a)对通道和微柱进行表面官能化是通过从一个连接端口将从已知浓度的ATM碘化物的甲醇溶液注入微反应器中，然后在真空下蒸发溶剂来进行。氧化硅微柱的微负表面电荷允许阳离子ATM在微柱表面上的静电结合。ATM通过高反应性的肟化反应，与呼出气体中的微量含羰基的VOC发生化学选择性反应。
呼出气体试样收集和处理
将空气和呼出气体样品收集在一升袋(Sigma-Aldrich，USA)中。路易斯维尔大学的机构审查委员会(IRB)批准了呼出气体样品收集的详细研究方案。分析健康对照(n＝193)和起源于肺脏外的各种原发性癌症患者(n＝32)的呼出气体样品，并测定所有含羰基化合物的浓度。起源于肺脏外的原发性癌症患者的所有临床诊断都是独立于呼出气体样品的收集做出的。
对于呼出气体的样品收集，受试者通过尖端直接向袋中呼入气体，从而提供一种非侵入性收集技术，易于被患者接受。在收集呼出气体后，将袋通过一根熔融石英管连接到微反应器的入口端口。微反应器的出口端口通过微反应器上的另一个熔融石英管连接到真空泵，如图2A所示。如图1所示，用于捕获含羰基的VOC的分析组件10包括用以通过ATM涂布的预浓缩器15从袋中抽取气体呼吸样品的真空泵50。在呼出气体样品被抽取通过预浓缩器15并通过真空抽空后，将预浓缩器15断开。最后，用100μL冷甲醇从预浓缩器15中洗脱出ATM-VOC加合物，得到99％的ATM-VOC回收率。通过FT-ICR-MS直接分析洗脱的溶液。将已知量的ATM-丙酮-d6的甲醇溶液加入洗脱液中作为内标。呼出气体中所有羰基化合物的浓度通过与作为内标参考的添加的ATM-丙酮-d6的相对丰度的比较来测定。
FT-ICR-MS仪器
利用电喷射芯片(喷嘴直径5.5μm)通过装配有TriVersa NanoMate离子源(AdvionBioSciences,Ithaca,NY)的混合线性离子阱-FT-ICR-MS(Finnigan LTQ FT,ThermoElectron,Bremen,德国)分析洗脱剂。TriVersa NanoMate采用正离子模式通过施加2.0kV而无排出压力下操作。最初，在1分钟内获得低分辨率MS扫描以确保电离的稳定性，然后使用FT-ICR分析仪收集高质量准确度的数据。FT-MS扫描在800m/z下以100,000的目标质量分辨率获取8.5分钟。AGC(自动增益控制)最大离子时间被设置为500ms(但通常利用<10ms)，并且每个保存的光谱获取了5个“μscans”；因此每个转换和保存的光谱的周期时间为约10秒。使用QualBrowser 2.0(Thermo Electron)将FT-ICR质谱以精确质量列表输出为电子表格文件，通常输出所有观察到的峰。ATM和ATM-VOC加合物基于其精确质量通过首先基于观察到的内标质量应用小(通常<0.0005)线性校正来分配。
统计数据分析
将呼出气体样品中测得的羰基VOC浓度分为健康试样对照(n＝193)、仅原发性癌症(n＝13)、转移到肺脏的原发性癌症组(n＝19)和所有原发性癌症患者，即仅原发性癌症和转移到肺脏的原发性癌症(n＝32)。通过Wilcoxon检验分析具有足够数量样品的组以确定组之间的统计学上的显著差异。Wilcoxon检验使用Minitab版本16.0进行。
结果与讨论
首先通过使用单羰基标准物和羰基标准物的混合物来表征由ATM涂布的预浓缩器捕获羰基的效率。捕集效率受流经预浓缩器的VOC混合物的速度以及ATM/羰基化合物的摩尔比影响。在优化的预浓缩器微观结构和操作条件下，痕量酮和醛的捕获效率已经达到98％以上。
在呼出气体分析前，测定来自实验室空气、临床室空气和街道空气样品的羰基VOCs的浓度。然后，测定来自193个健康(健康试样)对照和32个患有起源于肺脏外的原发性癌症的患者(受试者试样)的呼出气体样品中羰基VOCs的浓度。将原发性癌症患者细分为其中原发性癌症已经转移到肺脏的群组(黑色素瘤、结肠癌、乳腺癌、肾癌、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌、胆管癌、淋巴瘤和鳞状皮肤癌)和其中在肺脏中没有鉴定到转移癌的群组(食道癌、鳞状上皮细胞癌、间皮瘤、软骨肉瘤和胰腺癌)。已经检测了健康受试者和具有起源于肺脏外的原发性癌症的患者(仅原发性癌症和转移到肺脏的原发性癌症)的呼出气体样品中的C1(甲醛)至C12的含羰基的VOCs。
这代表了广泛的肿瘤细胞类型和来源组织。为了更仔细地解释数据–当与193名对照患者组相比较时，每名癌症患者具有至少一种羰基化合物，其水平比对照人群中鉴定的水平高出两个标准偏差以上。这在图3-6的图中得以表示，其中每一个代表各种癌症的四种不同标记中的一种的值，即C4H8O(图3)、C2H4O2(图4)、C4H8O2(图5)和4-HHE(图6)。每个图中最左边的条是对照群的平均值(误差条代表标准偏差)，而其余的条是具有指定癌症的患者的值。
而且，如下表2和3所示，每种癌症的所有受试者对于四种不同标记中的至少一种具有升高的值，并且大部分具有至少两种不同标记的升高的水平。
尽管通过对实施例的描述已经说明了本发明，并且虽然已经相当详细地描述了说明性实施例，但是发明人的意图不是或不以任何方式要将所附权利要求的范围限制到该细节内容。对于本领域的技术人员来说，额外的优点和修改是显而易见的。因此，本发明的更广泛的方面不限于所示出和描述的具体细节、代表性装置和方法以及说明性实例。因此，在不脱离发明人的总体发明构思的范围的情况下，可以对这些细节内容做出偏离。

Claims (14)

1.一种检测受试者试样中癌症疾病状态的非侵入性方法，其中所述原发性癌症起源于肺脏外组织，所述方法包括以下步骤：
从所述受试者试样获得呼出气体，其中所述呼出气体包括多种含羰基的挥发性有机化合物(VOCs)；
形成所述多种含羰基的VOCs与反应性化合物的加合物；
定量所述多种含羰基的VOCs中的每一种的所述加合物中的每一种以建立所述加合物中的每一种的对象值；以及
将每个对象值与所述多种含羰基的VOCs的所述加合物中的每一种的健康试样阈值进行比较，所述健康试样阈值对应于从健康试样计算的值，以确定存在量大于它们各自的健康试样阈值的一个或多个对象值，从而指示所述受试者试样中癌症疾病状态的相当大的可能性。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述癌症疾病状态选自由声门上喉鳞状细胞癌、胰腺癌、黑素瘤、结肠癌、乳腺癌、肾细胞癌、前列腺癌、卵巢癌、食道癌、软骨肉瘤、胆管癌、淋巴瘤和鳞状皮肤癌组成的群组。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述多种含羰基的VOC选自由2-丁酮、2-羟基乙醛、3-羟基-2-丁酮、4-羟基-2-己烯醛和包括2-戊酮和戊醛的C5H10O化合物的混合物组成的群组。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，还包括：
浓缩从多个健康试样获得的呼出气体中含有的所述多种含羰基的VOCs，其中所述多种含羰基的VOCs与所述反应性化合物形成加合物；以及
定量所述多个健康试样中的所述多种含羰基的VOCs的加合物以建立所述多种含羰基的VOC的所述加合物中的每一种的所述健康试样阈值。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中从所述受试者试样获得呼出气体包括在可膨胀的聚合物膜装置中收集所述呼出气体，以提供包含呼气样品的膨胀装置；并且其中形成所述多种含羰基的VOCs与反应性化合物的加合物包括使所述呼气样品通过包含所述反应性化学物质的化学预浓缩器。
6.根据权利要求5所述的方法，其中使所述呼气样品通过化学预浓缩器包括将所述膨胀装置连接到所述化学预浓缩器的入口，并将减压施加到所述化学预浓缩器的出口以引起所述呼气样品通过所述化学预浓缩器从所述膨胀装置流出。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述反应性化合物具有通式(I)：
(I)H2N—Z—L—Y，
其中Z是NH、NR或O；L是连接基团；Y是二取代或三取代的N或P部分；R选自由烷基、芳烷基、芳烯基和芳炔基组成的群组，其中每一个可以被取代或未被取代，并且任选地含有一个或多个杂原子，并且其中所述多种含羰基的VOCs与所述反应性化合物通过脱水反应形成其加合物。
8.根据权利要求7所述的方法，其中Z为O且Y为二取代或三取代的氮以提供具有通式(II)的反应性化合物，
(II)
其中R1和R2独立地选自由烷基、芳烷基、芳烯基和芳炔基组成的群组，其中每一个可以被取代或未被取代，并且任选地含有一个或多个杂原子，或者其中R1和R2组合形成杂环；R3选自由H、烷基、芳烷基、芳烯基和芳炔基组成的群组，其中每一个可以被取代或未被取代，并且任选地含有一个或多个杂原子；A是阴离子抗衡离子；并且其中所述连接基团L包含选自由取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基和醚组成的群组的非离子部分。
9.根据权利要求7所述的方法，其中Z为O且Y为二取代的氮以提供具有通式(III)的所述反应性化合物，
(III)
其中R1和R2独立地选自由烷基、芳烷基、芳烯基和芳炔基组成的群组，其中每一个可以被取代或未被取代，并且任选地含有一个或多个杂原子，或者其中R1和R2组合形成杂环。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述反应性化合物是2-(氨氧基)-N,N,N-三甲基乙铵盐。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中定量所述多种含羰基的VOCs的所述加合物以建立所述多种含羰基的VOCs的所述加合物的每个成员的所述对象值包括使用质谱仪分析所述多种含羰基的VOCs的所述加合物。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述质谱仪使用傅里叶变换离子回旋共振质谱(FTICR-MS)。
13.根据权利要求11所述的方法，其中所述质谱仪与色谱设备耦合。
14.一种筛查受试者试样中癌症疾病状态的非侵入性方法，其中所述原发性癌症起源于肺脏外组织，所述方法包括以下步骤：
浓缩从所述受试试样获得的呼出气体中含有的多种含羰基的挥发性有机化合物(VOCs)，其中所述多种含羰基的VOCs选自由2-丁酮、2-羟基乙醛、3-羟基-2-丁酮和4-羟基己烯醛、4-羟基-2-壬烯醛、2-戊酮和戊醛组成的群组，其与反应性化合物形成加合物；
定量所述多种含羰基的VOCs的所述加合物以建立所述多种含羰基的VOC的所述加合物的每个成员的对象值；以及
将所述多种含羰基的VOCs的所述加合物的每个成员的所述对象值与所述多种含羰基的VOCs的所述加合物的每个成员的健康试样阈值进行比较，以确定存在量大于其相应的健康试样阈值的一种或多种含羰基的VOCs，从而指示所述受试者试样中所述癌症疾病状态的相当大的可能性。
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